Name: Analisi della distribuzione tumorale e tissutale dellanticorpo terapeutico specifico dellantigene bersaglio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Scopri il monitoraggio in tempo reale della distribuzione di anticorpi terapeutici in tumori e tessuti. Questo metodo rapido ed economico aiuta a selezionare anticorpi con limitata diffusione non specifica, arricchendo la localizzazione tumorale per terapie mirate.

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Siamo grati all'University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, alla Biomolecular Analysis Facility, all'Advanced Microscopy Facility e al Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S è uno dei primi investigatori in carriera della Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NCI/NIH (R01CA233752) a J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) premio rivoluzionario di livello 1 a J. T-S (BC17097) e U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) premio di finanziamento (OC180412) a J. T-S

Tutte le procedure che coinvolgono la manipolazione degli animali e gli studi sugli xenografti tumorali sono state riviste e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) qui all'Università della Virginia e conformi ai pertinenti standard normativi
1. Espressione e purificazione degli anticorpi
<ol><li>Mantenimento delle celle CHO<ol>
<li>Far crescere le cellule CHO in FreeStyle CHO Media integrato con integratore di glutammina 1x disponibile in commercio a 37 °C tremando a 130 giri/min con 5% di CO2 utilizzando flaconi delong Erlenmeyer in vetro o monouso. NOTA: Si consiglia vivamente di utilizzare un pallone sconcertato con tappo ventilato per una maggiore agitazione e per migliorare il trasferimento di gas durante le condizioni di scuotimento. Significativamente ridotta la resa degli anticorpi è stata ottenuta con fiasche regolari (non sconcertate) a causa della limitata agitazione della coltura di sospensione.</li>
		<li>Mantenere il numero di cella compreso tra 1-5 x 106 celle/mL con &gt;95% di vitalità cellulare. Se il numero di celle aumenta di oltre 5 x 106 celle/mL, dividere le celle. Non consente mai alle celle CHO di raggiungere meno di 0,2 x 106 celle/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasfezione di cellule CHO<ol>
<li>Far crescere le cellule CHO in 200 mL di supporti (2 x 106 celle/mL) in fiasche sconcertate delong Erlenmeyer. NOTA: Le colture di sospensione coltivate in fiasche sconcertate hanno sempre prodotto rese proteiche più elevate rispetto a quando coltivate in fiasche non sconcertate.</li>
		<li>In un tubo da 15 mL, prendi 5 ml di supporti CHO FreeStyle e aggiungi 50 μg di DNA clone VH e 75 μg di DNA clone VL. Vortice da mescolare bene.</li>
		<li>Incubare la miscela di DNA a temperatura ambiente per 5 minuti. NOTA: Un'incubazione più lunga riduce le rese proteiche.</li>
		<li>Aggiungere 750 μL di 1 mg/mL di polietileneimina (PEI) alla soluzione di DNA e vortice aggressivo la miscela per 30 s. Incubare a temperatura ambiente per ulteriori 5 minuti. NOTA: Il PEI deve essere reso fresco. Il ciclo di disgelo multiplo di PEI riduce significativamente la resa complessiva.</li>
		<li>Aggiungere l'intera miscela di DNA e PEI sulle cellule mentre si scuote manualmente il pallone. Incubare immediatamente i flaconi sconcertati delong Erlenmeyer con cellule a 37 °C che tremano a 130 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Espressione NOTA: L'anticorpo ha un peptide del segnale secretorio progettato fino all'estremità N-terminale, che aiuta gli anticorpi a essere secreti nel supporto.<ol>
<li>Far crescere le cellule trasfette a 37 °C, tremando a 130 giri/min il giorno 1.</li>
		<li>Il giorno 2, aggiungere 2 mL di 100x agente anti-grumo e 2 mL di soluzione antibatterica-antimicotica 100x. Spostare il pallone a temperatura più bassa (32-34 °C), con scuotimento a 130 giri/min.</li>
		<li>Ogni quinto giorno, aggiungere 10 mL di mangime Tryptone N1 e 2 mL di integratore di glutammina 100x.</li>
		<li>Continuare a contare le cellule ogni tre giorni usando l'emocitometro dopo aver macchiato un'aliquota di cellule con macchia blu tripano. Assicurarsi che la vitalità della cella rimanga al di sopra dell'80%.</li>
		<li>Il giorno 10 o 11, raccogliere il mezzo per la purificazione degli anticorpi. Ruotare la coltura a 3000 x g,4 °C per 40-60 min e quindi filtrare il supporto chiaro utilizzando filtri di bottiglia da 0,22 μM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificazione NOTA: La purificazione degli anticorpi viene eseguita utilizzando la colonna Protein-A disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali), utilizzando una pompa peristaltica.<ol>
<li>Equilibrare la colonna con due colonne di tampone di legame (20 mM di fosfato di sodio a pH 7.4).</li>
		<li>Passare il supporto filtrato contenente anticorpi (ottenuto nel passaggio 1.3.5) attraverso la colonna alla portata di 1 mL/min.</li>
		<li>Lavare la colonna con un volume di due colonne di buffer di associazione.</li>
		<li>Eludere l'anticorpo in frazioni di 500 μL utilizzando un tampone di eluizione di 5 mL (acetato di sodio da 30 mM a pH 3,4).</li>
		<li>Neutralizzare il pH dell'anticorpo eluitato aggiungendo 10 μL di tampone di neutralizzazione (3 M acetato di sodio a pH 9) per frazione. NOTA: La frazione numero 3-6 contiene la maggior parte dell'anticorpo. Si consiglia di mantenere tutte le frazioni nel caso in cui l'anticorpo sia eluitato in una frazione successiva al previsto.</li>
		<li>Misurare la concentrazione di anticorpi purificati utilizzando uno spettrofotometro selezionando il protocollo predefinito per IgG. La concentrazione finale dell'anticorpo si ottiene in mg/mL considerando il peso molecolare e il coefficiente di assorbimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Etichettatura fluorescente
NOTA: Gli anticorpi sono etichettati con il colorante infrarosso che contiene un gruppo reattivo estere NHS, che si accoppia alle proteine e forma un coniugato stabile. Questa reazione è sensibile al pH e funziona meglio a pH 8.5. I coniugati fluorescenti etichettati con il colorante mostrano un assorbimento massimo di 774 nm e un'emissione massima di 789 nm. pH 8.5 è fondamentale per una coniugazione efficace.
<ol><li>Dializzare 0,5 mL dell'anticorpo utilizzando una cassetta di dialisi (0,1-0,5 mL) in 1 L di tampone di coniugazione (tampone fosfato da 50 mM a pH 8,5). Dopo 4 ore trasferire la cassetta di dialisi in tampone fresco e dializzare durante la notte.</li>
	<li>Impostare una reazione di coniugazione aggiungendo 0,03 mg di IRDye 800CW per 1 mg di anticorpo in un volume di reazione di 500 μL. NOTA: IRDye 800CW viene sciolto in DMSO ad una concentrazione di 10 mg/mL.</li>
	<li>Effettuare reazioni di etichettatura per 2 ore a 20 °C. NOTA: Aumentare il tempo oltre le 2 ore non migliora l'etichettatura.</li>
	<li>Purificare i coniugati etichettati per ampia dialisi contro 1x PBS.</li>
	<li>Stimare il grado di etichettatura misurando l'assorbanza del colorante a 780 nm e l'assorbanza della proteina a 280 nm. Il contributo colorante al segnale a 280 nm è del 3%.</li>
	<li>Calcola il rapporto colorante/proteina usando questa formula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ01.jpg"> dove 0,03 è un fattore di correzione per l'assorbanza del colorante utilizzato a 280 nm (pari al 3,0 % della sua assorbanza a 780 nm), εDye e εProtein sono coefficienti di estinzione molare rispettivamente per il colorante e la proteina (anticorpo). NOTA: εDye è 270.000 M-1 cm-1 e εProtein è 203.000 M-1 cm-1 (per un tipico IgG) in miscela 1:1 di PBS: metanolo. Proteine diverse dall'IgG possono avere coefficienti di estinzione molare molto diversi. L'uso di un corretto coefficiente di estinzione per la proteina di interesse è essenziale per una determinazione accurata del rapporto D/P.</li>
	<li>Calcola la concentrazione finale di proteine usando questa formula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ02.jpg"> NOTA: Confermare sempre l'efficacia legante l'antigene di anticorpi etichettati e non etichettati utilizzando ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) o citometria del flusso prima di procedere a studi in vivo.</li>
</ol>3. Studi di xenograft di topo
<ol><li>Preparazione di cellule tumorali per iniezione<ol>
<li>Far crescere le cellule OVCAR-3 in RPMI-1640 Medium, integrate con il 10% di FBS e 1x penicillina-streptomicina.</li>
		<li>Il giorno prima dell'iniezione, le cellule della sottocoltura in nuovi piatti di coltura da 100 mm con 10 mL di mezzo / piatto completo. Utilizzare il numero di cella di 0,5-1 x 106 celle/piatto.</li>
		<li>Incubare le colture a 37 °C di temperatura, 95% di umidità e 5% di CO2 per 20-24 ore.</li>
		<li>Il giorno dell'iniezione, rimuovere il mezzo di crescita dai piatti di coltura. Risciacquare accuratamente lo strato cellulare con ca2+/Mg2+ dulbecco libero dulbecco tamponato di fosfato (DPBS) per rimuovere cellule morte, detriti cellulari e tutte le tracce di siero, che possono interferire nell'azione della tripsina.</li>
		<li>Tripinare le cellule aggiungendo 1,0-1,5 mL di soluzione di Tripina-EDTA ad ogni piatto e cercare di diffondere la soluzione inclinando il piatto tutto intorno seguito da incubazione a 37 °C per 5-10 min. NOTA: Osservare le cellule al microscopio invertito per controllare lo stato effettivo di tripsicinazione. Sotto la tripsicinazione si traduce in un minor numero di distacco cellulare dalla superficie del piatto di coltura, la tripsininazione induce stress cellulare. Quindi, una corretta tripinazione è importante.</li>
		<li>Aggiungere 1,0-1,5 mL di mezzo di crescita completo a ogni piatto per interrompere l'azione della tripina, dopo di che sospendere le celle tubazionando delicatamente. NOTA: La pipettazione delicata è importante per mantenere la salute delle cellule.</li>
		<li>Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml e girare a 250 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Raccogliere il pellet di cella dopo aver rimosso il supernatante e lavare le cellule sospendendo il pellet in 1x DPBS.</li>
		<li>Ruotare la sospensione cellulare a bassa velocità 250 x g per 5 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL di DPBS e sospendere di nuovo le celle mediante pipettazione delicata per ottenere sospensioni a cella singola.</li>
		<li>Contare le celle utilizzando emocitometro o contatore di celle automatizzato. NOTA: Per una migliore precisione, ripetere il conteggio per tre volte e prendere una media.</li>
		<li>Regolare il volume in modo tale che la densità finale delle celle sia di 1 x 108 celle/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniezione sottocutanea di cellule per sviluppare xenografti di topo NOTA: Tutte le procedure devono essere fatte in un armadio di sicurezza BSL2. Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ topi sono stati utilizzati nello studio attuale.<ol>
<li>Prendere 50 μL della sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml e mescolare con 50 μL di mezzo a matrice di membrana basale. NOTA: Il mezzo a matrice di membrana basale tende a formare uno stato simile a un gel a temperatura ambiente, quindi mantieni attentamente le cellule e la miscela media della matrice sul ghiaccio. Si consiglia di tenere tubi, punte e siringhe in frigo e quindi trasferire sul ghiaccio prima dell'iniezione animale.</li>
		<li>Agitare la miscela per evitare qualsiasi raggruppamento cellulare. Quindi, prendere questi 100 μL della miscela media a matrice di sospensione cellulare che contiene 5 x 106 cellule, in una siringa da 1 cc.</li>
		<li>Sollevare delicatamente la pelle dell'animale per separare la pelle dallo strato muscolare sottostante e iniettare lentamente la sospensione cellulare (100 μL) sotto la pelle (5 x 106 cellule), con un ago da 26 G. Attendere alcuni secondi prima di eserti l'ago, in modo che il mezzo della matrice del seminterrato possa formare la struttura semi-solida del gel insieme alle cellule sotto la pelle, impedendo alla miscela di uscire dal sito di iniezione. NOTA: Le cellule devono essere testate prima dell'iniezione per qualsiasi contaminazione che possa danneggiare topi immunodifesa. Durante l'iniezione non mettere l'ago troppo in profondità nella pelle in quanto ciò potrebbe formare il tumore più profondo del previsto.</li>
		<li>Tenere l'animale in una gabbia sterile e osservare per circa 20 minuti.</li>
		<li>Osservare i topi per 2-3 settimane e consentire al tumore di crescere fino a 500 mm3 dimensioni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Localizzazione degli anticorpi utilizzando un sistema di imaging in vivo
NOTA: Le apparecchiature di imaging in vivo (vedi Tabella dei materiali)utilizzate in questo esperimento utilizzano una serie di filtri ad alta efficienza e algoritmi spettrali di non miscelazione per la visualizzazione non invasiva e il monitoraggio dell'attività cellulare e genetica all'interno di un organismo vivente in tempo reale. Il sistema fornisce sia capacità di monitoraggio della fluorescenza che della bioluminescenza.
<ol><li>Iniettare 25 μg di anticorpo etichettato colorante attraverso la vena della coda.<ol>
<li>Anestetizzare i topi che portano il tumore usando il 2% di isoflurane. Verificare la mancanza di risposta ai riflessi del pedale.</li>
		<li>Una volta che i topi smettono di muoversi, dilatare la vena laterale della coda applicando acqua di verme.</li>
		<li>Iniettare 25 μg (in 100 μL) di anticorpo etichettato utilizzando una siringa per insulina da 1 cc con un ago da 26 G.</li>
		<li>Allo stesso modo, come controllo negativo, etichettare e iniettare l'anticorpo isotipo IgG1 non specifico che non si rivolge alle cellule tumorali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire immagini dal vivo in vivo dopo 8, 24, 48 ore, ecc. di iniezioni di anticorpi.<ol>
<li>Nel software associato fare clic su Inizializza nel pannello di controllo e verificare che la temperatura dello stadio sia di 37 °C.</li>
		<li>Accendere l'alimentazione dell'ossigeno, tutte le pompe del sistema di anestesia, l'alimentazione di gas isoflurane alla camera anestetica e impostare la valvola del vaporizzatore di isoflurane al 2%.</li>
		<li>Trasferire i topi nella camera anestetica e attendere che i topi siano completamente anestetizzati. Applicare l'unguento lubrificante per gli occhi per evitare l'asciugatura degli occhi.</li>
		<li>Passare al pannello di controllo, impostare l'imaging a fluorescenza tramite l'opzione Creazione guidata imaging e selezionare l'eccitazione a 773 nm e l'emissione a 792 nm. NOTA: le impostazioni di esposizione automatica predefinite forniscono una buona immagine fluorescente. Tuttavia, le preferenze di esposizione automatica possono essere modificate in base alle esigenze.</li>
		<li>Trasferire i topi anestetizzati nella camera di imaging e assemblarli sul campo di imaging usando il cono del naso. La fase di imaging offre la possibilità di ospitare 5 topi alla volta. NOTA: avere topi di controllo con immagini insieme ai topi di prova per avere una quantità simile di esposizione e altre impostazioni durante l'analisi.</li>
		<li>Una volta che tutto è pronto, selezionare l'opzione Acquisisci sul pannello di controllo per l'acquisizione dell'immagine.</li>
		<li>Con le impostazioni di esposizione automatica il sistema genera l'immagine entro un minuto. L'immagine generata è la sovrapposizione di fluorescenza su immagine fotografica con intensità di fluorescenza ottica visualizzata in unità di conteggi o fotoni, o in termini di efficienza.</li>
		<li>Dopo aver acquisito l'immagine, trasferire i topi dalla camera di imaging alla loro gabbia e osservare per il loro recupero per 1-2 minuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ottimizzare ulteriormente l'immagine con gli strumenti e le funzioni forniti all'interno del software per l'analisi delle immagini. Gli strumenti di analisi delle immagini si trovano nella barra dei menu e nella tavolozza degli strumenti.<ol>
<li>In Regolazione immagine regolarela luminosità, il contrasto o l'opacità e selezionare la scala dei colori.</li>
		<li>Utilizzare gli strumenti roi per specificare una regione di interesse (ROI) in un'immagine ottica e misurare l'intensità del segnale all'interno del ROI. Se necessario, esportare i dati del segnale quantificati in un software di foglio di calcolo e tracciare i dati.</li>
		<li>Per gli studi di follow-up, analizzare le necrosi dei topi di vari tessuti (ad esempio fegato, polmone, cuore, rene, milza, cervello, ecc.) fianco a fianco per una distribuzione dettagliata non specifica di anticorpi etichettati fluorescentmente. NOTA: I dati possono essere ulteriormente supportati con ELISA specifica del tessuto utilizzando antigene (FOLR1 in questo caso) in 96 saggi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

L'erogazione selettiva e specifica del tessuto tumorale dell'agente terapeutico anti-cancro è la chiave per misurare l'efficacia e la sicurezza di una data terapiamirata 13. Qui abbiamo descritto un approccio rapido ed efficiente per indagare la distribuzione dettagliata dei tessuti e del tumore di anticorpi BaCa clinici, farletuzumab e non clinici. L'approccio descritto è applicabile a qualsiasi anticorpo appena generato e può essere utilizzato insieme a un anticorpo clinicamente efficace (con le...

La FDA approvò il primo anticorpo monoclonale che prendeva di mira CD3 (OKT3, Muromonab) nel 19861,2. Da allora per i prossimi vent'anni, c'è stata una rapida esplosione nel campo dell'ingegneria degli anticorpi a causa del travolgente successo degli anticorpi contro gli inibitori del checkpointimmunitario 3. Oltre all'attivazione indiretta del sistema immunitario, gli anticorpi sono mirati a segnalare direttamente le cellule tumorali per coinvolgere con precisione le cellule dell'effettore immunitario, innescare la citotossicità attraverso l'agonista del recettore della morte, bloccare la segnalazione di sopravvivenza delle cellule tumorali, ostruire l'angiogenesi (crescita dei vasi sanguigni), vincolare i regolatori del checkpoint immunitario, fornire radioisotopi, farmaci chemioterapici e siRNA come agenti coniugati2. Inoltre, lo studio dei frammenti variabili a catena singola (scFv) di vari anticorpi sulla superficie delle cellule T derivate dal paziente e delle cellule NK (CAR-T e CAR-NK) è un'area in rapida crescita di indagini cliniche per terapie a base cellulare4.
L'altissima affinità dei farmaci a base di anticorpi che fornisce selettività all'antigene che esprime le cellule tumorali lo rende un agente attraente. Allo stesso modo, il parto mirato e la ritenzione tumorale di un anticorpo terapeutico (o di un farmaco chimico) è la chiave per bilanciare l'efficacia rispetto alla tossicità. Pertanto, un gran numero di strategie basate sull'ingegneria proteica che includono ma non sono limitate agli anticorpibispecifici 5 e trispecifici6 vengono sfruttati per migliorare significativamente la ritenzione tumorale ottimizzata dell'avidità delle terapie iniettate per via endovenosa (IV)5,7. Qui, descriviamo un semplice metodo basato sulla fluorescenza per affrontare la distribuzione tumorale e tissutale di anticorpi anti-cancro potenzialmente efficaci.
Poiché i tessuti animali possiedono autofluorescenza quando eccitati nello spettro visibile, gli anticorpi sono stati inizialmente etichettati con colorante vicino all'infrarosso (ad esempio, IRDye 800CW). Per prove di indagini concettuali, abbiamo fatto uso di anticorpi di targeting del recettore del folato alfa-1 (FOLR1) chiamati farletuzumab e del suo derivato chiamato anticorpo Cytotoxicity di ancoraggio bispecifico (BaCa)7 che copresi bersagli FOLR1 e recettore della morte-5 (DR5)8 in un anticorpo ricombinante. FOLR1 è un recettore bersaglio sovraespresso ben definito nelle cellule tumorali ovarico e TNBC, negli xenografti tumorali e nei tumori deipazienti 9. In particolare, ci sono molteplici sforzi per sfruttare clinicamente FOLR1 utilizzando approcci basati su anticorpi per coinvolgere cellule dell'effettore immunitario e coniugati di farmaci anticorpali (ADC) per tumori ovarico emammario 10,11.
In questo documento sui metodi, abbiamo clonato, espresso e purificato l'anti-FOLR1 clinico (farletuzumab) insieme ad altri anticorpi di controllo utilizzando il sistema di espressione CHO. L'isotipo IgG1 e un anticorpo clinico anti-idiotipo mucina-16 chiamato abagovomab12 sono stati utilizzati come controlli negativi. A seguito della purificazione proteina-A, gli anticorpi indicati sono stati etichettati con IRDye 800CW e sono stati somministrati nella vena di coda di topi nudi con xenografti tumorali ovarico o FOLR1 umano stabilmente trasfetto che esprime xenografti di cancro del colon murino. La localizzazione degli anticorpi è stata monitorata mediante imaging dal vivo utilizzando spettro di imaging in vivo in più punti di tempodiversi 7. Questo metodo non richiede alcuna modifica genetica o iniezione del substrato per consentire l'emissione luminosa ed è significativamente più veloce, conveniente ed efficiente. Il protocollo generale di clonazione, espressione, purificazione ed etichettatura descritto di seguito può essere applicato a qualsiasi anticorpo clinico e non clinico se sono disponibili sequenze di catene pesanti e leggere.

<table><tbody><tr><td>FreeStyle CHO media</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 12651-014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Agente antiaggregante</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 01-0057DG</td><td></td></tr><tr><td>BD Siringa da insulina</td><td>BD BioSciences</td><td>Cat #329420</td><td></td></tr><tr><td>Calibro IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>Cat #124262</td><td></td></tr><tr><td>CHO CD EfficientFeed B</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat #A10240-01</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-13-CV</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 coniugato Anti-Human IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>Cat # 709-175-149</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Kit Maxiprep per plasmidi HiPure</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # K21007</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap MabSelect SuRe Colonna</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat # 11-0034-93</td><td></td></tr><tr><td>Infusione</td><td>Takara BioScience</td><td>STO344</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW NHS Ester</td><td>LI-COR</td><td>Cat # 929-70020</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Covetrus</td><td>Cat # 11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante Unguento per gli occhi</td><td>Refresh Lacri-Lube</td><td>Cat #4089</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>Cat # 354234</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione PEI</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat # BMS1003A Cassette</td><td></td></tr> per <tr><td>dialisi Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat # 66333</td><td></td></tr><tr><td>Steritop Vacuum Filtri</td><td>Millipore Express</td><td>Cat #S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15400-054</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modelli sperimentali: Linee cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Umano: OVCAR-3</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>Umano: Cellule CHO-K</td><td>Stabile trasformato nel nostro laboratorio</td><td>ATCC CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>Topo: 4T1</td><td>Gentile dono dal Dr. Chip Landen, UVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse: MC38</td><td>Gentile dono dalla Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td><td>Autenticato da STR profiling</td><td></td></tr><tr><td>Mouse: MC38 hFOLR1</td><td>Generato nel nostro laboratorio (Questo documento)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modelli sperimentali: Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mice: Nudo atimico Foxn1nu/Foxn1+</td><td>Envigo</td><td>Ordini</td><td></td>multipli</tr><tr><td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Ordini</td><td></td> multipli</tr></tbody></table>

analisi della distribuzione tumorale e tissutale dell'anticorpo terapeutico specifico dell'antigene bersaglio

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Gli anticorpi monoclonali sono farmaci multifunzionali ad alta affinità che funzionano con meccanismi indipendenti variabili per eliminare le cellule tumorali. Negli ultimi decenni, il campo dei coniugati anticorpo-farmaco, degli anticorpi bispecifici, dei recettori degli antigeni chimerici (CAR) e dell'immunoterapia oncologica è emerso come l'area più promettente delle indagini di base e terapeutiche. Con numerosi studi umani di successo che prendono di mira i recettori del checkpoint immunitario e le cellule CAR-T nella leucemia e nel melanoma a un ritmo rivoluzionario, è un momento molto emozionante per le terapie oncologiche derivate dalle variazioni dell'ingegneria degli anticorpi. Purtroppo, un numero significativamente elevato di anticorpi e terapie a base di CAR si sono dimostrati deludenti anche negli studi sull'uomo di tumori solidi a causa della limitata disponibilità di cellule dell'effettore immunitario nel letto tumorale. È importante sottolineare che anche la distribuzione aspecifica di anticorpi terapeutici in tessuti diversi dai tumori contribuisce alla mancanza di efficacia clinica, tossicità associata e insufficienza clinica. Poiché la fedele traduzione di studi preclinici su percorsi clinici umani è altamente basata sull'efficacia dello xenograft tumorale dei topi e sugli studi di sicurezza, qui evidenziamo un metodo per testare il tumore e la distribuzione generale dei tessuti degli anticorpi terapeutici. Ciò si ottiene etichettando l'anticorpo purificato proteina-A con colorante fluorescente vicino all'infrarosso seguito da immagini dal vivo di topi portanti di tumore.

Nella metodologia descritta, prima abbiamo clonato anticorpi mirati al recettore del folato alfa-1 (FOLR1) chiamato farletuzumab, e un anticorpo bispecifico chiamato BaCa costituito da farletuzumab e lexatumumab insieme a anticorpi di controllo come abagovomab (sequenze fornite nel file complementare 1). I dettagli dei domini rappresentativi della variabile pesante (VH) e della luce variabile (VL) nei cloni di DNA (pVH, pVL) sono mostrati nella figura 1A. Per confermare i cl...

Qui presentiamo un protocollo per studiare la localizzazione in vivo degli anticorpi nei modelli di xenograft tumorale dei topi.

Analisi della distribuzione tumorale e tissutale dell'anticorpo terapeutico specifico dell'antigene bersaglio

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Questo protocollo dimostra l'espressione e la purificazione degli anticorpi e il monitoraggio in tempo reale della distribuzione degli anticorpi nel tumore e nei tessuti. Lo screening degli anticorpi con il protocollo descritto aiuterà a selezionare gli anticorpi che hanno una distribuzione limitata dei tessuti non specifica e arricchirà le localizzazioni tumorali. La tecnica descritta è rapida ed economica.Altre tecniche, come la tomografia computerizzata ad emissione di fotoni singoli e la tomografia ad emissione di positroni, sono molto costose e richiedono traccianti radioattivi e altri traccianti sofisticati. La tecnica non si limita al cancro che prende di mira gli anticorpi. Può essere applicato a qualsiasi altra malattia, come malattie polmonari o cardiache, per l'analisi della distribuzione degli anticorpi nel corpo.A dimostrare la procedura sarà Jeremy Gatesman, un tecnico veterinario della mia università. Cellule CHO crude in 200 millilitri di media, a Delong, Erlenmeyer fiasche sconcertate. Combina cinque millilitri di supporti freestyle CHO con 50 microgrammi di DNA clone pesante variabile e 75 microgrammi un DNA clone a luce variabile in un tubo da 15 millilitri.Quindi, vortice il tubo. Lasciare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Aggiungere 750 microlitri di un milligrammo per millilitro di polietilenimina alla soluzione di DNA e vortice aggressivo per 30 secondi.Lasciare la miscela a temperatura ambiente per altri cinque minuti. Aggiungere l'intera miscela alle cellule CHO scuotendo manualmente il pallone. Incubare immediatamente le cellule a 37 gradi Celsius mentre si trema a 130 giri/min.Il giorno successivo, aggiungere due millilitri di agente anti-grumo 100 X e due millilitri di soluzione antimicotica antibatterica 100 X alle cellule. Incubare i contenitori a 32-34 gradi Celsius, con scuotimento a 130 giri/min. Continuare a coltivare le cellule per 10-11 giorni, aggiungendo 10 millilitri di mangime Tryptone N1 e due millilitri di integratore di glutammina 100 X ogni quinto giorno.Contare le cellule ogni tre giorni per garantire che la vitalità cellulare rimanga superiore all'80%Il giorno 10 o 11, raccogliere il mezzo per la purificazione degli anticorpi centrifugando la coltura a 3000 volte G e quattro gradi Celsius per 40-60 minuti. Quindi, filtrare il supporto chiaro con un filtro bottiglia da 0,22 micrometri. Per purificare gli anticorpi, equilibrare la colonna proteica A con due volumi di colonna di tampone legante.Passare il supporto filtrato attraverso la colonna alla portata di un millilitro al minuto. Quindi lavare la colonna con due volumi di colonna di buffer di associazione. Utilizzare cinque millilitri di tampone di eluizione per eludere l'anticorpo in 500 frazioni di microlitri.E neutralizzare il pH dell'anticorpo alluso aggiungendo 10 microlitri di tampone di neutralizzazione per la frazione. Misurare la concentrazione dell'anticorpo purificato con uno spettrofotometro utilizzando il protocollo predefinito per IgG. Dializzare 0,5 millilitri dell'anticorpo utilizzando una cassetta di dialisi in un litro di tampone di coniugazione.Dopo quattro ore, trasferire la cassetta di dialisi su un tampone fresco e dializzare durante la notte. Per impostare una reazione di coniugazione, aggiungere 0,03 microgrammi di colorante IRR 800 CWU per un milligrammo di anticorpo in un volume totale di 500 microlitri. Incubare la miscela per due ore a 20 gradi Celsius, quindi purificare i coniugati etichettati per dialisi estesa contro PBS.Stimare il grado di etichettatura misurando l'assorbanza del colorante di 780 nanometri e l'assorbanza della proteina a 280 nanometri. Per sviluppare gli xenografi del topo, sollevare delicatamente la pelle dell'animale e separarla dallo strato muscolare sottostante. Iniettare lentamente 100 microlitri di sospensione cellulare sotto la pelle con un ago calibro 26.Attendere alcuni secondi prima di eserti l'ago in modo che il mezzo matrice seminterrato informi la struttura semi-solida simile a un gel insieme alle cellule sotto la pelle, il che impedirà alla miscela di uscire dal sito di iniezione. Per eseguire l'imaging in vivo, iniettare l'anticorpo etichettato colorante attraverso la vena della coda. Dopo aver anestetizzato il mouse, verificare la mancanza di risposta ai riflessi del pedale e dilatare la vena applicando acqua tiepida.Utilizzare una siringa per insulina 1cc con un ago calibro 26 per iniettare 25 microgrammi dell'anticorpo etichettato in un volume di 100 microlitri. Come controllo negativo, etichettare e iniettare l'anticorpo isotipo IgG non specifico che non si rivolge alle cellule tumorali. Eseguire l'imaging in vivo otto, 24 e 48 ore dopo le iniezioni di anticorpi.Nel software di imaging fare clic su inizializza. Verificare che la temperatura dello stadio sia di 37 gradi Celsius. Nel pannello di controllo, impostare l'imaging a fluorescenza attraverso la procedura guidata di imaging e impostare l'eccitazione su 773 nanometri, emissione a 792 nanometri.Trasferire il mouse anestetizzato nella camera di imaging. Posizionarlo sul campo di imaging usando il cono del naso. Quando è pronto, fare clic su acquisisci nel pannello di controllo per l'acquisizione dell'immagine e fare clic su espone automaticamente.L'immagine generata è la sovrapposizione della fluorescenza sull'immagine fotografica con fluorescenza ottica e densità visualizzate in unità di conteggi o fotoni. I cloni cDNA positivi con domini variabili pesanti e a luce variabile sono stati confermati con la PCR colonia. I risultati rappresentativi del farletuzumab purificato eseguito sulla pagina SDS non riducente e riducente sono mostrati qui.Catene pesanti e leggere producevano bande da 50 e 25 kilodalton dopo la riduzione. Confermato anche il legame degli anticorpi con proteine native nella superficie cellulare. Gli anticorpi etichettati fluorescentmente erano iniettati nella vena della coda, in topi innestati con R1 completo che esprimeva tumori.Gli animali sono stati vissuti immagine in più punti di tempo utilizzando IVIS. i dati confirs arricchimento selettivo di anticorpi completi R1 e BaCa nei tumori. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che il mantenimento delle cellule CHO è fondamentale per la resa degli anticorpi.Ed è importante avere un grado simile di coniugazione fluorescente del colorante per la localizzazione competitiva del tumore. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunoistochimica tissutale e l'ELISA specifica dei tessuti o del tumore possono essere eseguiti per supportare i dati di imaging dei topi vivi.

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Questo video descrive la tecnica della radioimmunoterapia premirata o PRIT, in cui vengono somministrati immunoconiugati seguiti da radioligandi per il trattamento dei tumori. Questa radioimmunoterapia riduce le dosi di radiazioni ai tessuti sani e utilizza radionuclidi con emivite molto basse incompatibili con vettori basati su anticorpi.

Radioimmunoterapia premirata: un metodo per la somministrazione mirata di radionuclidi terapeutici ai tumori

Questo video dimostra una tecnica per studiare la localizzazione in vivo di anticorpi specifici per il tumore in un modello di xenotrapianto tumorale di topo. Dopo l'iniezione sottocutanea di cellule tumorali nei topi per la formazione del tumore, vengono iniettati anticorpi marcati in fluorescenza che si legano ai recettori specifici del tumore, consentendo la valutazione in vivo della localizzazione degli anticorpi tramite imaging.

Una tecnica per valutare la localizzazione in vivo di anticorpi specifici per il tumore

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Valutazione iniziale di anticorpo-coniugati modificate con peptidi virali-derivati per accumulo cellulare di aumentare e migliorare il Targeting tumorale

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