Profilazione a livello di trascrizione delle interazioni proteina-RNA attraverso il cross-linking e l'immunoprecipitazione mediata dalla purificazione tandem FLAG-Biotina
18 maggio 2020
Qui presentiamo un protocollo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq con purificazione tandem FLAG-biotina per determinare gli obiettivi di RNA delle proteine leganti l'RNA (RRP) nelle cellule dei mammiferi.
Solo e solo le proteine leganti controllano più processi biologici. Questo metodo FLAG-Biotin CLIP-seq, quindi per profilare globalmente la disposizione speciale e temporale di RTA e RRP nelle cellule di mammifero. Questo metodo consente un rilevamento efficiente degli RNA diretti legati alle proteine senza SDS-PAGE e delle procedure di trasferimento della membrana.
Rispetto al tradizionale CLIP-seq è privo di isotopi e non richiede anticorpi specifici per proteine. Inizia placcando circa 3 milioni di cellule staminali embrionali di topo in una piastra di 10 centimetri e incubandole durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere il mezzo con un vuoto e trattare le cellule con due millilitri dello 0,25% di tripside EDTA per due minuti a temperatura ambiente.
Tempra la triptina con quattro millilitri di mezzo MESC fresco e trasferisci le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Quindi, centrifugarli a 300 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il supernatante. Sospendere le celle in quattro millilitri di PBS freddo e trasferirle di nuovo nella piastra di 10 centimetri per il cross-linking.
Irradiare le cellule con una luce UV di 254 nanometri, quindi trasferire le cellule collegate incrociate in un tubo da 15 millilitri. Far girare queste cellule a 300 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius, quindi rimuovere il supernatante e lisciviare le cellule con 500 microlitri di Buffer A preparati secondo le indicazioni manoscritte. Trasferire le cellule in un tubo di 1,5 millilitro privo di RNAse e incubarle a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata per 30-60 minuti.
Trattare il lisato con 30 microlitri di DNAsi 1 a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, interrompere la reazione aggiungendo quattro microlitri di EDTA molare 0,5. Spingi il pellet insolubile centrifugando a 12.000 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius e trasferisci il supernatante in un nuovo tubo prerimente refrigerato da 1,5 millilitri.
Trasferire il lisato cellulare in perline FLAG prealibrate e incubare il campione a quattro gradi Celsius mentre si ruota per due o quattro ore. Dopo l'incubazione, centrifugare le perline per due minuti a 3000 volte G e rimuovere il supernatante. Aggiungere 500 microlitri di Buffer A al campione e incubare a 4 gradi Celsius per cinque minuti, quindi girare giù per le perline e rimuovere il supernatante.
Ripetere il lavaggio con buffer A, seguito da due lavaggi con un'elute Buffer B.To pre refrigerata con un peptide X FLAG, preparare la soluzione di eluizione come descritto nel manoscritto testuale e far girare le perline FLAG. Rimuovere il supernatante con una punta di pipetta a estremità stretta e aggiungere 200 microlitri della soluzione di eluizione X FLAG a ciascun campione. Incubare i campioni per 30 minuti a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata.
Quindi girare giù le perline per due minuti a 3000 volte G.Trasferire il supernato su un tubo fresco e ripetere l'eluizione due volte. Salvare il 5% degli eluenti per l'analisi western della macchia o la colorazione dell'argento per verificare l'efficienza dell'immunoprecipitazione FLAG. Trasferire gli eluenti tirati su perline di streptavidina preparate e ruotare delicatamente i campioni a quattro gradi Celsius per una o tre ore o durante la notte.
Quindi, raccogliere le perline su un supporto magnetico e rimuovere il supernatante. Lavare le perline due volte con 500 microlitri di Buffer C con rotazione delicata per cinque minuti per lavaggio. Successivamente, lavare le perline due volte con 500 microlitri di Buffer D e due volte con 500 microlitri di tampone PNK ghiacciato, raccogliendo le perline sul supporto magnetico e rimuovendo il supernatante tra un lavaggio e l'altro.
Per eseguire la digestione parziale dell'RNA, aggiungere 100 microlitri di soluzione MNA a ciascun campione e vortice impostato a 37 gradi Celsius con un miscelatore termico per 10 minuti. Raccogliere le perline con un supporto magnetico per 30 secondi e rimuovere il supernatante. Quindi, lavarli con tampone PNK-EDTA, buffer C e buffer PNK secondo le indicazioni del manoscritto.
Raccogliere le perline con il supporto magnetico e rimuovere il tampone. Quindi, aggiungere il mix di reazione CIP e vortice le perline a 37 gradi Celsius con un miscelatore termico per 10 minuti. Lavare rapidamente le perline due volte con 500 microlitri di tampone PNK EDTA ghiacciato, seguiti da due lavaggi con 500 microlitri di tampone PNK ghiacciato.
Dopo i lavaggi, aggiungere 40 microlitri di tre primi mix di legatura del linker alle perline e vortice a 16 gradi Celsius con un miscelatore termico per tre ore o durante la notte. Una legatura efficiente del linker agli alleati è fondamentale per questo esperimento. Controllare occasionalmente il tubo di reazione per assicurarsi che questi non precipitino durante la legatura.
Dopo l'incubazione, ripetere i lavaggi con tamponi PNK EDTA e PNK, aggiungere 40 microlitri di PNK mescolati alle perline e vortice a 37 gradi Celsius con il miscelatore termico per 10 minuti. Lavare le perline con tamponi PNK EDTA e PNK, quindi procedere con l'isolamento dell'RNA come descritto nel manoscritto testuale. Rispetto alla purificazione mediata da FLAG o streptavidina in un solo passaggio, la purificazione tandem FLAG-Biotina ha rimosso quasi tutte le proteine purificate del nucleo, evitando la contaminazione delle interazioni indirette dell'RNA proteico.
LIN28 e WDR43, Fbio CLIP-seq è stato eseguito utilizzando cellule staminali embrionali del topo. In totale, sono state recuperate circa 7,7 milioni e 2,2 milioni di letture univoche rispettivamente per LIN28 e WDR43. Il confronto delle viste della traccia mostra diversi modelli di rilegatura nel locus RN45 pre-rRNA.
I siti cross-linked sul motivo GGA G di RNA pre-let7-g di LIN28, Fbio CLIP-seq o identificati. Inoltre, sono stati determinati motivi di RNA arricchiti nei siti di legame e la percentuale di nucleotidi mutati in diversi tipi di mutazioni. Dimostrando che LIN28 preferisce legarsi al nucleotide genico.
Bene, alle 22:00, questo protocollo, è importante confermare l'efficienza dell'immunoprecipitazione per assicurarsi che solo i complessi proteici siano stati purificati con successo.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo CLIP-seq modificato chiamato Fbio CLIP-seq, che utilizza una purificazione in tandem FLAG-biotina per identificare gli RNA bersaglio delle proteine leganti l'RNA (RBPs) in cellule di mammifero. Il metodo consente un rilevamento efficiente degli RNA direttamente legati alle proteine, senza necessità di procedure di elettroforesi su SDS-PAGE o di trasferimento su membrana.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia molecolare
Contesto
- Le proteine leganti l'RNA (RBPs) svolgono ruoli fondamentali nella regolazione di diversi processi biologici.
- I metodi tradizionali di CLIP-seq richiedono spesso isotopi e anticorpi specifici.
- Fbio CLIP-seq ha lo scopo di semplificare il processo di profilazione delle RBPs e dei loro bersagli di RNA.
- Questo metodo è particolarmente utile per lo studio delle cellule di mammifero.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo più efficiente per identificare i bersagli di RNA delle proteine leganti l'RNA (RBP).
- Eliminare la necessità di procedure complesse come l'elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di SDS (SDS-PAGE).
- Fornire un protocollo facilmente applicabile negli studi su cellule di mammifero.
Metodi Utilizzati
- Piastreggiatura di cellule staminali embrionali di topo in una piastra da 10 cm.
- Incubazione delle cellule durante la notte prima del trattamento.
- Trattamento con tripsina EDTA per staccare le cellule.
- Utilizzo della purificazione in tandem FLAG-biotina per l'isolamento dell'RNA.
Risultati principali
- Il metodo Fbio CLIP-seq profila con successo le proteine leganti l'RNA e i loro bersagli di RNA.
- Elevata efficienza dimostrata nel rilevare gli RNA legati alle proteine.
- Ha mostrato che il metodo è privo di isotopi e di anticorpi.
- Ha fornito un approccio semplificato per lo studio delle interazioni RNA-proteina.
Conclusioni
- La tecnica fbio CLIP-seq è uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano le proteine leganti l'RNA in cellule di mammifero.
- Il metodo migliora la capacità di analizzare le interazioni con l'RNA eliminando i limiti tradizionali.
- Applicazioni future potrebbero estendersi a diversi contesti biologici e tipi cellulari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il mappaggio diretto delle interazioni proteina-RNA è fondamentale per la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nei primi stadi dei processi di scoperta. Il metodo Fbio CLIP-seq consente l'identificazione a livello del trascrittoma degli obiettivi diretti delle proteine leganti l'RNA, senza ricorrere a isotopi o ad anticorpi specifici per le proteine, riducendo così interferenze derivanti da interazioni indirette. Questa capacità aumenta l'affidabilità predittiva e supporta decisioni di portafoglio corrette rispetto ai rischi nella scoperta di farmaci mirati all'RNA.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'analisi su scala trascrittomica delle interazioni dirette proteina-RNA per la validazione funzionale delle proteine bersaglio.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica eliminando le proteine leganti l'RNA che rappresentano contaminanti indiretti.
- Permette una valutazione predittiva affidabile dell'interazione con il bersaglio e della mappatura delle vie biologiche.
- Facilita il triage delle proteine leganti l'RNA in base ai profili di interazione diretta.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce un flusso di lavoro standardizzato e privo di anticorpi per la preparazione di complessi proteina-RNA validati.
- Fornisce letture quantitative di eventi di legame diretto adatti per analisi successive.
- Migliora la riproducibilità e la scalabilità eliminando la dipendenza da isotopi e anticorpi.
- Consente una valutazione affidabile degli effetti dei composti sulle interazioni proteina-RNA.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea ai sistemi rilevanti per la malattia analizzando le interazioni endogene in cellule di mammifero.
- Permette un percorso continuo dalla scoperta alla validazione preclinica tramite la mappatura di target diretti di RNA.
- Riduce i rischi nella selezione di biomarcatori traslazionali grazie a dati di interazione ad alta specificità.
- Facilita l'avanzamento calibrato sui rischi di programmi terapeutici mirati all'RNA.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo Fbio CLIP-seq si integra all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e l'identificazione dei candidati, fornendo prove dirette di interazioni proteina-RNA per la validazione delle proteine bersaglio e lo sviluppo di saggi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mappando direttamente le proteine leganti l'RNA e i loro bersagli.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili per lo screening di composti e la standardizzazione di saggi.
- Analisi: Permette il confronto su scala trascrittoma dei modelli di legame e l'arricchimento di motivi specifici.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte ai modelli preclinici analizzando le interazioni in tipi cellulari rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile e indipendente dagli anticorpi per studi diversificati sulle proteine leganti l'RNA.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Ottimizza i flussi di lavoro mediante passaggi di purificazione senza anticorpi, senza isotopi e scalabili.
- Valore strategico: Permette decisioni più informate sul proseguimento o meno dello sviluppo e riduce il rischio biologico nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di asset mirati all'RNA con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biochimica RNA-proteina e tecniche di cross-linking.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per il cross-linking UV, la purificazione con perle FLAG e streptavidina e il sequenziamento ad alto rendimento.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i gruppi di lavoro per garantire riproducibilità e confrontabilità dei dati.
- È adattabile a diversi modelli cellulari di mammiferi con un'ottimizzazione del protocollo.
- I potenziali limiti includono la necessità di esprimere la proteina marcativa e una valida verifica accurata dell'efficienza di purificazione.
