Profilazione a livello di trascrizione delle interazioni proteina-RNA attraverso il cross-linking e l'immunoprecipitazione mediata dalla purificazione tandem FLAG-Biotina
May 18th, 2020
Qui presentiamo un protocollo CLIP-seq modificato chiamato FbioCLIP-seq con purificazione tandem FLAG-biotina per determinare gli obiettivi di RNA delle proteine leganti l'RNA (RRP) nelle cellule dei mammiferi.
Solo e solo le proteine leganti controllano più processi biologici. Questo metodo FLAG-Biotin CLIP-seq, quindi per profilare globalmente la disposizione speciale e temporale di RTA e RRP nelle cellule di mammifero. Questo metodo consente un rilevamento efficiente degli RNA diretti legati alle proteine senza SDS-PAGE e delle procedure di trasferimento della membrana.
Rispetto al tradizionale CLIP-seq è privo di isotopi e non richiede anticorpi specifici per proteine. Inizia placcando circa 3 milioni di cellule staminali embrionali di topo in una piastra di 10 centimetri e incubandole durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere il mezzo con un vuoto e trattare le cellule con due millilitri dello 0,25% di tripside EDTA per due minuti a temperatura ambiente.
Tempra la triptina con quattro millilitri di mezzo MESC fresco e trasferisci le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Quindi, centrifugarli a 300 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il supernatante. Sospendere le celle in quattro millilitri di PBS freddo e trasferirle di nuovo nella piastra di 10 centimetri per il cross-linking.
Irradiare le cellule con una luce UV di 254 nanometri, quindi trasferire le cellule collegate incrociate in un tubo da 15 millilitri. Far girare queste cellule a 300 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius, quindi rimuovere il supernatante e lisciviare le cellule con 500 microlitri di Buffer A preparati secondo le indicazioni manoscritte. Trasferire le cellule in un tubo di 1,5 millilitro privo di RNAse e incubarle a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata per 30-60 minuti.
Trattare il lisato con 30 microlitri di DNAsi 1 a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, interrompere la reazione aggiungendo quattro microlitri di EDTA molare 0,5. Spingi il pellet insolubile centrifugando a 12.000 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius e trasferisci il supernatante in un nuovo tubo prerimente refrigerato da 1,5 millilitri.
Trasferire il lisato cellulare in perline FLAG prealibrate e incubare il campione a quattro gradi Celsius mentre si ruota per due o quattro ore. Dopo l'incubazione, centrifugare le perline per due minuti a 3000 volte G e rimuovere il supernatante. Aggiungere 500 microlitri di Buffer A al campione e incubare a 4 gradi Celsius per cinque minuti, quindi girare giù per le perline e rimuovere il supernatante.
Ripetere il lavaggio con buffer A, seguito da due lavaggi con un'elute Buffer B.To pre refrigerata con un peptide X FLAG, preparare la soluzione di eluizione come descritto nel manoscritto testuale e far girare le perline FLAG. Rimuovere il supernatante con una punta di pipetta a estremità stretta e aggiungere 200 microlitri della soluzione di eluizione X FLAG a ciascun campione. Incubare i campioni per 30 minuti a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata.
Quindi girare giù le perline per due minuti a 3000 volte G.Trasferire il supernato su un tubo fresco e ripetere l'eluizione due volte. Salvare il 5% degli eluenti per l'analisi western della macchia o la colorazione dell'argento per verificare l'efficienza dell'immunoprecipitazione FLAG. Trasferire gli eluenti tirati su perline di streptavidina preparate e ruotare delicatamente i campioni a quattro gradi Celsius per una o tre ore o durante la notte.
Quindi, raccogliere le perline su un supporto magnetico e rimuovere il supernatante. Lavare le perline due volte con 500 microlitri di Buffer C con rotazione delicata per cinque minuti per lavaggio. Successivamente, lavare le perline due volte con 500 microlitri di Buffer D e due volte con 500 microlitri di tampone PNK ghiacciato, raccogliendo le perline sul supporto magnetico e rimuovendo il supernatante tra un lavaggio e l'altro.
Per eseguire la digestione parziale dell'RNA, aggiungere 100 microlitri di soluzione MNA a ciascun campione e vortice impostato a 37 gradi Celsius con un miscelatore termico per 10 minuti. Raccogliere le perline con un supporto magnetico per 30 secondi e rimuovere il supernatante. Quindi, lavarli con tampone PNK-EDTA, buffer C e buffer PNK secondo le indicazioni del manoscritto.
Raccogliere le perline con il supporto magnetico e rimuovere il tampone. Quindi, aggiungere il mix di reazione CIP e vortice le perline a 37 gradi Celsius con un miscelatore termico per 10 minuti. Lavare rapidamente le perline due volte con 500 microlitri di tampone PNK EDTA ghiacciato, seguiti da due lavaggi con 500 microlitri di tampone PNK ghiacciato.
Dopo i lavaggi, aggiungere 40 microlitri di tre primi mix di legatura del linker alle perline e vortice a 16 gradi Celsius con un miscelatore termico per tre ore o durante la notte. Una legatura efficiente del linker agli alleati è fondamentale per questo esperimento. Controllare occasionalmente il tubo di reazione per assicurarsi che questi non precipitino durante la legatura.
Dopo l'incubazione, ripetere i lavaggi con tamponi PNK EDTA e PNK, aggiungere 40 microlitri di PNK mescolati alle perline e vortice a 37 gradi Celsius con il miscelatore termico per 10 minuti. Lavare le perline con tamponi PNK EDTA e PNK, quindi procedere con l'isolamento dell'RNA come descritto nel manoscritto testuale. Rispetto alla purificazione mediata da FLAG o streptavidina in un solo passaggio, la purificazione tandem FLAG-Biotina ha rimosso quasi tutte le proteine purificate del nucleo, evitando la contaminazione delle interazioni indirette dell'RNA proteico.
LIN28 e WDR43, Fbio CLIP-seq è stato eseguito utilizzando cellule staminali embrionali del topo. In totale, sono state recuperate circa 7,7 milioni e 2,2 milioni di letture univoche rispettivamente per LIN28 e WDR43. Il confronto delle viste della traccia mostra diversi modelli di rilegatura nel locus RN45 pre-rRNA.
I siti cross-linked sul motivo GGA G di RNA pre-let7-g di LIN28, Fbio CLIP-seq o identificati. Inoltre, sono stati determinati motivi di RNA arricchiti nei siti di legame e la percentuale di nucleotidi mutati in diversi tipi di mutazioni. Dimostrando che LIN28 preferisce legarsi al nucleotide genico.
Bene, alle 22:00, questo protocollo, è importante confermare l'efficienza dell'immunoprecipitazione per assicurarsi che solo i complessi proteici siano stati purificati con successo.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo CLIP-seq modificato chiamato Fbio CLIP-seq, che utilizza la purificazione tandem FLAG-biotina per identificare i bersagli RNA delle proteine che si legano all'RNA (RBPs) nelle cellule di mammiferi. Il metodo consente un'efficiente rilevazione di RNA direttamente legati a proteine senza la necessità di procedure di SDS-PAGE e trasferimento su membrana.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Biologia molecolare
Sfondo
- Le proteine che si legano all'RNA (RBPs) svolgono ruoli cruciali nella regolazione di vari processi biologici.
- I metodi CLIP-seq tradizionali spesso richiedono isotopi e anticorpi specifici.
- Fbio CLIP-seq mira a semplificare il processo di profilazione delle RBPs e dei loro bersagli RNA.
- Questo metodo è particolarmente utile per lo studio delle cellule di mammiferi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo più efficiente per identificare i bersagli RNA delle RBPs.
- Eliminare la necessità di procedure complesse come SDS-PAGE.
- Fornire un protocollo che possa essere facilmente applicato negli studi sulle cellule di mammiferi.
Metodi utilizzati
- Placing di cellule staminali embrionali di topo in una piastra da 10 cm.
- Incubazione delle cellule durante la notte prima del trattamento.
- Trattamento con tripsina EDTA per distaccare le cellule.
- Utilizzo della purificazione tandem FLAG-biotina per l'isolamento dell'RNA.
Risultati principali
- Il metodo Fbio CLIP-seq profila con successo le RBPs e i loro bersagli RNA.
- Ha dimostrato efficienza nel rilevare RNA legati a proteine.
- Ha dimostrato che il metodo è privo di isotopi e anticorpi.
- Ha fornito un approccio semplificato per lo studio delle interazioni RNA-proteina.
Conclusioni
- Fbio CLIP-seq è uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano le RBPs nelle cellule di mammiferi.
- Il metodo migliora la capacità di profilare le interazioni RNA senza le limitazioni tradizionali.
- Le applicazioni future potrebbero espandersi a vari contesti biologici e tipi di cellule.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Direct mapping of protein-RNA interactions is critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery pipelines. The Fbio CLIP-seq method enables transcriptome-wide identification of direct RNA-binding protein targets without reliance on isotopes or protein-specific antibodies, reducing confounding from indirect interactions. This capability enhances predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions in RNA-targeted drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables transcriptome-wide interrogation of direct protein-RNA interactions for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by eliminating indirect RNA-binding protein contaminants.
- Supports predictive confidence in target engagement and pathway mapping.
- Facilitates triage of RNA-binding proteins based on direct interaction profiles.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, antibody-free workflow for preparing validated protein-RNA complexes.
- Delivers quantitative readouts of direct binding events suitable for downstream screening.
- Improves reproducibility and scalability by removing isotope and antibody dependencies.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by profiling endogenous interactions in mammalian cells.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by mapping direct RNA targets.
- De-risks translational biomarker selection through high-specificity interaction data.
- Facilitates risk-adjusted advancement of RNA-targeted therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
The Fbio CLIP-seq method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing direct evidence of protein-RNA interactions for target validation and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping direct RNA-binding protein targets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound screening and assay standardization.
- Analytics: Enables transcriptome-wide comparison of binding patterns and motif enrichment.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models by profiling interactions in disease-relevant cell types.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, antibody-independent platform for diverse RNA-binding protein studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows through antibody-free, isotope-free, and scalable purification steps.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA-protein biochemistry and cross-linking techniques.
- Needs access to UV cross-linking, FLAG and streptavidin bead purification, and high-throughput sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various mammalian cell models with protocol optimization.
- Potential limitations include requirement for tagged protein expression and careful validation of purification efficiency.
