Localizzazione e quantificazione dei begomovirus nei tessuti delle mosche bianche mediante immunofluorescenza e PCR quantitativo

Chiarire la spazialità e la quantità di virus nei vettori della mosca bianca può aiutare a comprendere le interazioni begomovirus-mosca bianca e nello sviluppo di nuove strategie per il controllo di gravi malattie begomovirali. I vantaggi di questa tecnica sono che possiamo isolare rapidamente i tessuti delle mosche bianche, co-localizzare le proteine virali e delle mosche bianche e quantificare i virus in mosche bianche interi corpi e piante infettate da virus. Nel momento sperimentale appropriato, dopo l'acquisizione del virus, mettere le mosche bianche femminili anestetizzate dal ghiaccio in una goccia di PBS su uno scivolo al microscopio e utilizzare un agopuntura fine per aprire l'addome della mosca bianca al microscopio stereo.

Utilizzare l'ago per estrarre il midgut e posizionare il midgut in un piatto di raccolta di PBS. Per raccogliere i PSM, dividere il corpo al torace dal lato dorsale vicino alla testa e fissare la mosca bianca con un ago attraverso il torace. Utilizzare un secondo ago per scuotere la mosca bianca fino a quando le due ghiandole salivari non sono separate dal corpo e trasferire le ghiandole in un nuovo piatto di PBS.

Per raccogliere le ovaie, aprire completamente l'addome e utilizzare un ago per separare le ovaie dagli altri tessuti. Utilizzare una pipetta per rimuovere il tessuto in eccesso e trasferire le ovaie in un nuovo piatto di PBS. Per raccogliere un campione di emolinfa, aggiungere 10 microlitri di PBS su un nuovo vetrino del microscopio e posizionare una nuova mosca bianca nella goccia.

Utilizzare un agopuntura fine per fare delicatamente un buco nell'addome. Quindi applicare una leggera pressione sull'addome per rilasciare l'emolinfa nel tampone e raccogliere un campione di otto microliter del liquido. Per visualizzare la localizzazione di TYLCV in tessuti di mosca bianca raccolti PSG, midgut o ovarico, trasferire da 15 a 20 campioni in una piastra di Petri di vetro da 3,5 centimetri e aspirare il buffer in eccesso.

Fissare i tessuti in un millilitro di paraformaldeide al 4% per due ore a temperatura ambiente prima di lavare accuratamente i campioni tre volte per due minuti in un millilitro di TBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, permeabilizzare i campioni con un millilitro dello 0,5%Triton X-100 per 30 minuti prima di lavare tre volte come appena dimostrato con un millilitro di TBST per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, bloccare qualsiasi legame non specifico con un millilitro di albumina siere bovina dell'1% per due ore a temperatura ambiente seguita da tre lavaggi in TBST come dimostrato.

Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le cellule con gli anticorpi primari di interesse durante la notte a quattro gradi Celsius protetti dalla luce. La mattina successiva, lavare i campioni tre volte con TBST prima di aggiungere gli anticorpi secondari appropriati per due ore a temperatura ambiente protetti dalla luce. Alla fine dell'incubazione, lavare i moscerini tre volte e trasferire i campioni in uno scivolo al microscopio pulito.

Rimuovere il più possibile il buffer e macchiare i nuclei con una goccia di DAPI prima di montare con un coverslip ed esaminare i tessuti etichettati mediante microscopia confocale. Per la quantificazione tylcv, lavare i campioni di tessuto whitefly raccolti da due a tre volte in PBS fresco e trasferire 20 moscerini, 20 PG o un'ovaia in cinque microlitri di PBS in singoli tubi PCR contenenti 25 microlitri di soluzione di lisi. Aggiungere da cinque a sette perline ceramiche di due millimetri di diametro a ciascun tubo e macinare i campioni in un omogeneizzatore.

Aggiungere un campione di otto microlitri di emolinfa in un nuovo tubo PCR e aggiungere 10 microlitri di lisi al tubo con una miscelazione accurata. Incubare tutti i campioni a 65 gradi Celsius per un'ora seguita da un'incubazione di 10 minuti a 100 gradi Celsius e una breve centrifugazione. Successivamente, aggiungere 18 microlitri di master mix nei flaconcini dei tubi quantitativi pcr strip e aggiungere due microlitri di ciascun campione di DNA ad almeno tre flaconcini.

Una volta caricati tutti i campioni, chiudere i tubi e la centrifuga per sedimentare la soluzione nella parte inferiore di ogni flaconcino. Carica le fiale su un ciclore termico in tempo reale per pcr quantitativo, selezionando cyber come colorante al fluoroforo e sconosciuto come tipo di campione. Quindi esportare i dati quantitativi in un foglio di calcolo per l'analisi della quantità relativa di DNA virale in ogni campione.

Qui vengono mostrate immagini rappresentative di TYLCV nella colorazione DAPI in PNG, moscerini e ovaie whitefly. Come osservato, la TVLCV dimostra un maggiore accumulo all'interno dei PSM e dei moscerini rispetto alle ovaie. La quantificazione del virus in PSG a mosca bianca, moscerini, emolinfa e ovaie dopo essersi nutrita di pomodoro infettato da TYLCV per 24, 48 e 72 ore indica che la quantità di virus aumenta nei diversi tessuti whitefly in correlazione diretta con l'aumento del periodo di accesso all'acquisizione.

È meglio usare mosche bianche fresche, poiché gli insetti morti aumenteranno la difficoltà di dissezione. Seguendo questa procedura, altre analisi, come l'gonfiore occidentale e la co-immunoprecipitazione, possono essere eseguite per rispondere a ulteriori domande sull'espressione virale delle proteine e sulle interazioni virali e delle proteine vettoriali.