Name: Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri come isolare cellule mioepiteliali e luminali da ghiandole mammarie murine mediante tripsinizzazione differenziale. Questo metodo preserva l'integrità cellulare per colture 3D e organoidi.

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Ringraziamo Ben Abrams per l'assistenza tecnica e il supporto di base dell'Istituto per la biologia delle cellule staminali (IBSC) dell'Università della California (UCSC). Ringraziamo Susan Strome e Bill Saxton per l'uso del loro Microscopio Solamere Spinning Disk Confocal. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni all'UCSC dall'Howard Hughes Medical Institute attraverso il programma James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study (S.R.), dal NIH (NIH GM058903) per l'iniziativa di massimizzare lo sviluppo degli studenti (H.M.) e da la National Science Foundation for a graduate research fellowship (O.C. DGE 1339067) e con una sovvenzione (A18-0370) del Comitato di coordinamento della ricerca UC-Cancro (LH).

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California, Santa Cruz.
1. Giorno 1: Digestione della ghiandola mammaria
<ol><li>Prepararsi a raccogliere le MG da topi femmine maturi 10-14 settimane di età.<ol>
<li>Eseguire la raccolta su un banco aperto in condizioni asettiche.</li>
		<li>Sterilizzare tutte le forniture chirurgiche, tavole di sughero, e perni da autoclaving e ammollo in 70% alcol per 20 min prima dell'intervento chirurgico.</li>
		<li>Anestetizza gli animali con pentobarbital di sodio (2X dose anestetica di 0,06 mg/g di peso corporeo) somministrati tramite iniezione intraperitoneale con una siringa insulinica da 0,5 ml.</li>
		<li>Monitorare il livello di anestesia pizzicando le dita dei dei pipi' dell'animale per verificare la presenza di una risposta riflessiva e iniziare il protocollo solo dopo che l'animale è completamente anestesizzato.</li>
		<li>Posizionare l'animale sulla schiena, pinare le sue appendici alla tavola di sughero, e pulire il suo addome e petto con etanolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per raccogliere i #2, 3, 4 e 5 MG da un topo (cioè 8 MG, Figura 1A), identificare la linea mediana tra le due zampe posteriori e fare una piccola incisione (1 cm) sulla pelle addominale con forbici affilate, quindi estendere il taglio fino al collo18.</li>
	<li>Seguire facendo piccoli tagli lateralmente verso le gambe e le braccia per consentire il rilascio della pelle utilizzando un tampone di cotone. Tirare la pelle e allungarla stretta prima di apporrla su un lato (Figura 1B,passaggio 1)18. Rimuovere gli MG tagliando sotto di essi e rimuovere i linfonodi dalle ghiandole #4(Figura 1B, passaggi 2, 3)18. Ripetere la procedura sull'altro lato del corpo.</li>
	<li>Raccogliere il tessuto MG in 50 mL di 4 .C's Modified Eagle's Media (DMEM)/Miscela Nutriente F12 (F12) integrato con il 5% di siero bovino fetale (FBS) e 1X Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)18.</li>
	<li>Tritare le ghiandole in un piatto da 35 mm o su un piatto di ceramica utilizzando una lama di rasoio o un elicottero di tessuto. Ruotare la piastra ogni cinque braciole manuali o ogni giro sull'elicottero di tessuto fino a quando i pezzi di tessuto possono essere montati attraverso una punta di micropipette da 1 mL con facilità (0,1 mm/frammento, Figura 1C).</li>
	<li>Digerire gli MG in Digestione Media (cfr. tabella 1)per 14 h in un piatto di adesione ben basso a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2.</li>
</ol>2. Giorno 2: Isolamento dei frammenti di tessuto epiteliale mammario
<ol><li>Dopo 14 h di digestione, mescolare delicatamente pipeting il tessuto digerito 10X utilizzando una micropipetta da 1 mL per abbattere qualsiasi stroma o tessuto adiposo rimanente, assicurando che non vengano generate bolle né forza meccanica in eccesso. NOTA: Se c'è una digestione incompleta dopo 14 h, ciò potrebbe essere dovuto all'accumulo di DNA tranè. In questo caso, aggiungere 1 L di 1 mg/mL deoxyribonuclease I (DNase I) per 2 mL di Digestione Media. Incubare per altri 30 min a 37 , 5% CO2.</li>
	<li>Raccogliere il tessuto in un tubo da 15 mL e risciacquare il pozzo utilizzato per la digestione con 2-3 mL di coltura tissutale grado 1X Dulbecco fosfato buffered Saline (DPBS) libero da Ca2 e Mg2. Centrifuga a 600 x g per 10 min.</li>
	<li>Evacuare il soldante contenente lo strato lipidico e il mezzo, quindi risospendere il pellet in 5 mL di DPBS e passare a un nuovo tubo da 15 mL. Centrifuga a 600 x g per 10 min.</li>
	<li>Durante la centrifugazione posizionare un colino a celle di nylon di 70 m in un tubo da 50 ml e il colino preliminare utilizzando 10 mL di 37 m DMEM/F12.</li>
	<li>Risospendere i frammenti di tessuto dal passaggio 2.4 del protocollo utilizzando 5 mL di DPBS e passare la sospensione attraverso un colino a celle di nylon da 70 m per rimuovere le cellule stromali e le singole cellule (Figura 1D).</li>
	<li>Raccogliere i frammenti di tessuto sul colino cellulare. Risciacquare 4X con 10 mL di 37 gradi centigradi/F12 (Figura 1D). AVVISO: il risciacquo incompleto si tradurrà in colture contaminate da cellule non epiteliali.</li>
	<li>Rilasciare i frammenti di tessuto tenendo la linguetta del colino con le dita guantate, invertendo il colino su un piatto di coltura dei tessuti di 60 mm e passando 1 mL di Livelli di Manutenzione (vedi Tabella 1) attraverso il fondo del colino 4X (Figura 1E).</li>
	<li>Controllare il colino per i resti dei frammenti di tessuto, che saranno visibili ad occhio nudo, e risciacquare il colino 1X in più con 1 mL di manutenzione media se eventuali frammenti sono ancora aderendo al colino. I frammenti di tessuto sciacquato dovrebbero ora essere privi di cellule stromali.</li>
	<li>Esaminare rapidamente il piatto da 60 mm contenente i frammenti di MG del protocollo step 2.9 al microscopio invertito (obiettivo 4X o 10X, Figura 1F). Una tipica preparazione di otto MG produce 500 frammenti. Cercare singole cellule o goccioline di grasso e se ci sono cellule contaminanti. NOTA: Se ci sono cellule contaminanti, ripetere la fase di filtrazione raccogliendo il mezzo e frammenti dal piatto da 60 mm utilizzando una pipetta da 5 mL e filtrando nuovamente il frammento attraverso un nuovo colino da 70 m, ripetendo i passi del protocollo 2.6, 2.8-2.10.</li>
	<li>Incubare 24 h a 37 , 5% CO2, permettendo al frammento di tessuto di aderire e generare frammenti bistrato (Figura 2A). NOTA:Se i frammenti non si sono stabilizzati di 24 h, continuare a incubare fino a quando non sono stati aderitati. Se i frammenti non aderiscono bene, la separazione dei compartimenti delle celle non funzionerà. Se i ricercatori sono preoccupati per l'adesione, le piastre di coltura dei tessuti possono essere trattate per promuovere l'attaccamento del frammento (ad esempio, poli-L-lisina).</li>
</ol>3. Giorno 3: prova differenziale delle cellule epiteliali mioee e luminali
<ol><li>Per separare i MyOEC dai LEC, svuotare i supporti dal piatto, risciacquare 1x con 1 mL di DPBS e aggiungere 1 mL di trifoglio-EDTA fresco (0,05%) e monitorare attentamente la digestione sotto un microscopio invertito (10X o 20X obiettivo, Figura 2B,C,F). Il distacco dello strato MyoEC esterno richiederà 3-6 min, a seconda della trypsin-EDTA (0,05%) Forza. NOTA: Vedere la figura 2 per le immagini rappresentative che mostrano questo processo. Sotto l'illuminazione di campo luminoso, i myoEC appaiono arrotondati e hanno un aspetto più luminoso rispetto ai LEC, che rimangono aderente al centro e appaiono più scuri.</li>
	<li>Raccogliere la frazione MyoEC in un tubo da 15 mL contenente 2 mL 10% FBS/DPBS. Senza disturbare i LEC, sciacquare delicatamente il piatto da 60 mm con 2 mL di DPBS e quindi smaltire il DPBS (Figura 2H-I). NOTA: il ripristino abituale per i MyoEC è compreso in un intervallo compreso tra (3,5 x 106-1,5 x 106)a seconda delle dimensioni degli MG.</li>
	<li>Per rimuovere la frazione LEC, aggiungere 1 mL di trypsin-EDTA (0,05%) al piatto di nuovo e incubare 7-15 min, monitorando attentamente per evitare sovradigestione. Spegnire la trypsin-EDTA (0,05%) sul piatto con 2 mL di 10% FBS/DPBS. Raccogliere la frazione LEC in un nuovo tubo da 15 mL. NOTA: il recupero abituale per i LEC è all'interno di un intervallo (2 x 106-4,2 x 106) a seconda delle dimensioni degli MG di routine, la purezza di entrambe le frazioni come analizzato dall'immunosintochimica è del 90%19 (Figura 2E).</li>
	<li>Centrifugare ogni frazione per 5 min a 300 x g per rimuovere la trypsin-EDTA (0,05%). Risospendere il pellet in 250 gradi di Maintenance Medium e contare ogni popolazione cellulare utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato. Posizionare le cellule sul ghiaccio durante il conteggio. NOTA: Se si desidera la manipolazione genetica delle frazioni cellulari, le cellule primarie possono essere coltivate su piatti a bassa adesione e infettate da lentivirus20.</li>
</ol>4. Giorno 3: Combinazione e incorporamento di frazioni di cellule in una matrice extracellulare
NOTA: Una volta che le frazioni MyoEC e LEC sono state raccolte e conteggiate, possono essere combinate. Il tipico rapporto MyoEC/LEC è 1:3 (Figura 3A)19. Possono essere eseguiti diversi studi. Ad esempio, per eseguire studi sul mosaico, le frazioni possono essere generate da topi di tipo selvaggio (WT) e mutanti (Mut) e combinati (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, o frazioni possono essere combinate utilizzando diversi rapporti di MyoEC/ LEC19.
<ol><li>In base al numero di cellule, calcolare il numero di pozzi (8 pozzi camera, vedere Tabella dei materiali) che devono essere preparati per 12.000 cellule/pozzetto (ad esempio 3.000 MyoEC:9.000 LEC).</li>
	<li>Stabilire lo strato di base per la coltura 3D aggiungendo a ciascuno della Tabella dei Materiali 90 % L del 50% (50% ECM/50% DMEM/F12, senza rosso fenoglio - vedere la Tabella dei Materiali) ad ogni pozzo. Assicurarsi che non ci siano bolle e che i pozze siano rivestiti in modo uniforme. Per solidificare lo strato di base, incubare i vetrini a 37 gradi centigradi, 5% di CO2 per 30 min. NOTA: L'ECM deve rimanere ghiacciato fino a questo passaggio, altrimenti polimerizza prematuramente e porterà a rivestimento di base irregolare e polimerizzazione. L'utilizzo di un ECM di base migliora la crescita organoide in un singolo piano, che facilita l'acquisizione di immagini. Questo ottiene anche una crescita organoide più veloce e utilizza meno ECM22.</li>
	<li>Durante la polimerizzazione, preparare le miscele cellulari. Pellet le frazioni MyoEC e LEC a 300 x g per 5 min e respendere ogni frazione di cella in 10% ECM/90% Mezzo di crescita in modo che ogni pozzo ha 100 l (vedi tabella 1 per come rendere Media crescita). NOTA: Per facilitare la preparazione, replicare i pozze utilizzando le stesse miscele di cellule. Questi possono essere combinati e preparati in un tubo (ad esempio, quattro pozze dello stesso mix di cellule possono essere preparati in 400 :L del 10% ECM/90% Mezzo di crescita).</li>
	<li>Aggiungete 100 l di ogni miscela cellulare nel 10% ECM/90% Growth Medium in ogni pozzo e lasciate che gli organoidi si stabilizzino per 20 min a 37 gradi centigradi, 5% CO2.</li>
	<li>Una volta che le cellule si sono depositate, aggiungere delicatamente 100 l'L di Growth Medium con il pipettaggio dolcemente lungo la parete della camera di ogni pozzo. Incubare i vetrini a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2 (vedi Figura 3A per la composizione totale di ogni pozzo). NOTA: L'inibitore di Rho Kinase, R-spondin, e Nrg1 sono fattori che sono stati identificati come importanti per la coltura a lungo termine di organoidi cresciuti sia da cellule mammarie primarie e cellule di cancro al seno umano13,14. Inoltre, i fattori delle cellule staminali B27 e N2 estendono il tempo di coltura degli organoidi.</li>
	<li>Celle di immagine ogni 24 h per monitorare la loro crescita e rinnovare delicatamente il mezzo di crescita ogni 2-3 giorni utilizzando 100 l/well (Figura 3B-E). NOTA: quando si rinnova il supporto, prestare estrema attenzione. Inclinare i vetrini della camera per raccogliere il mezzo in un angolo dei pozzi. Togliere 100 l del mezzo e ricostituire con cura di lasciare lo strato ECM indisturbato.</li>
	<li>Se i ricercatori sono interessati a studiare l'allattamento/alveologenesi, passare a Alveologenesi Medium (vedi tabella 1) il giorno 5 e continuare a rinnovare il mezzo ogni 2-3 giorni fino al giorno 10 (Figura 3F) o oltre passando utilizzando la soluzione di recupero (vedi la tabella dei materiali)13. NOTA: A questo punto, gli organoidi possono essere isolati dall'ECM incubando a 4 gradi centigradi in 400 gradi di soluzione di recupero a 4 gradi centigradi (vedere Tabella dei materiali per le informazioni sul protocollo e sul reagente).</li>
</ol>5. Giorno 5 o 10: organidi fissaggio e immunostaining
<ol><li>Rimuovere il mezzo con attenzione pipettando delicatamente dal supporto (una pipetta a bulbo funziona meglio). Risciacquare ogni pozzo utilizzando 200 l of 1x Dulbecco's Foshate Buffered Saline (DPBS, vedi ricette).</li>
	<li>Fissare gli organoidi utilizzando la paraformaldeide fredda (4 gradi centigradi) 4% (w/v) (PFA, vedi ricette) per 10 min a temperatura ambiente. AVVISO: il PFA è pericoloso. Indossare dispositivi di protezione personale (cappotto da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza). Questo passaggio deve essere eseguito all'interno di un cappuccio fumatore. NOTA: l'ECM viene sciolto dal trattamento PFA. La rimozione incompleta dell'ECM può portare alla colorazione dello sfondo quando gli organoidi vengono analizzati dall'immunofluorescenza.</li>
	<li>Rimuovere il 4% PFA e aggiungere 200 L di 0,2% (w/v) glicine/DPBS (vedi tabella 1) a ogni pozzo. Incubare gli scivoli a temperatura ambiente per 30 min o 4 gradi durante la notte su una superficie a dondolo impostata su un'impostazione lenta. NOTA: Gli organoidi possono essere conservati per 1-3 giorni in DPBS a 4 gradi centigradi prima del passaggio successivo.</li>
	<li>Permeabilizzare gli organoidi utilizzando DPBS - 0.25% Triton X-100 (PBST, vedi Tabella 1) per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Bloccare gli organoidi utilizzando il siero d'asino (DS) del 5% (o di altro siero corrispondente alla specie dell'anticorpo secondario) in DPBS per 1 h su una superficie a dondolo. NOTA: Questo passaggio può essere eseguito durante la notte a 4 gradi centigradi su una superficie a dondolo.</li>
	<li>Preparare gli anticorpi primari nell'1% DS/DPBS. Utilizzare 125-200 l per ogni pozzo. Eseguire l'immunostaining incubando gli organoidi negli anticorpi primari durante la notte a 4 gradi centigradi su una superficie a dondolo.</li>
</ol>6. Giorno 11: completa immunofluorescenza
<ol><li>Lavare ogni pozzo 2X con 200 PBST per 5 min. Aggiungere l'anticorpo secondario in 1% DS/DPBS utilizzando 125-200 -L per ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente su una superficie a dondolo per 45 min.</li>
	<li>Lavare ogni pozzo 2X utilizzando 200 PBST per pozzo.</li>
	<li>Macchia redigere i nuclei utilizzando il colorante del DNA di Hoechst in DPBS (1:2,000 in DPBS) per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere tutto il liquido lasciato sul pozzo aspirando delicatamente con un vuoto.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione le camere e la guarnizione, posizionare una goccia (30 dollari l) dei supporti di montaggio (vedere Tabella dei materiali) su ogni pozzo e coverslip, facendo attenzione a rimuovere le bolle. Lasciare asciugare lo scivolo in uno spazio buio per 1-2 giorni. Sigillare con smalto trasparente. Immagini degli organoidi su un microscopio confocale (Figura 3E-F).</li>
</ol>

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<li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6 (9), e25661(2011).</li>
<li>Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50011(2013).</li>
<li>Marlow, R., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+breast+cancer+bone+metastatic+niche+in+complex+three-dimensional+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).</li>
<li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui viene presentato un metodo che descrive in dettaglio come i ricercatori possono generare colture organoidi 3D utilizzando cellule MG primarie. La differenza tra questo e altri protocolli è che dettagliamo un metodo per separare i due compartimenti cellulari MG distinti: i MyoEC basali esterni e i LEC interni. Il nostro metodo impiega una trypsin-EDTA in due fasi (0,05%) trattamento che chiamiamo metapsinizzazione differenziale19. Questa procedura consente ai ricercatori di isolare myinfo e LEC...

La ghiandola mammaria (MG) è una struttura epiteliale tubolare simile ad un albero incorporata all'interno di uno stroma ricco di adipociti. L'epitelio duttale bistrato comprende uno strato basale esterno e basale di contratture, cellule mioepiteliali (MyoEC) e uno strato interno di cellule epiteliali luminali e secretorie (LEC), che circondano un lumaro centrale1. Durante l'allattamento, quando i myoEC esterni si contraggono per spremere il latte dai LEC dell'alveolar interno, la MG subisce numerosi cambiamenti che sono sotto il controllo dei fattori di crescita (ad esempio, EGF e FGF) e degli ormoni (ad esempio progne, insulina e prolattina). Questi cambiamenti causano la differenziazione delle strutture specializzate, gli alveoli, che sintetizzano e secernono il latte durante l'allattamento1. L'epitelio mammario può essere manipolato sperimentalmente utilizzando tecniche in cui sia frammenti di tessuto epiteliale, cellule, o anche una singola cellula basale vengono trapiantati in cuscinetti di grasso mammari ospiti, precleared di parenchyma mammario endogeno, e lasciato crescere per ricostituire un intero albero epileliale funzionale2,3,4,5. Il trapianto è una tecnica potente, ma richiede tempo e impossibile se una mutazione si traduce in una prima letalità embrionale (prima dell'E14) che impedisce il salvataggio dell'anlage mammario trapiantabile. Inoltre, i ricercatori desiderano spesso ricercare i ruoli dei due diversi comparti, che derivano da cellule progenitrici soggette a restrizioni di lignaggio. Mentre la tecnologia Cre-lox consente la manipolazione genetica differenziata di myoEC e LEC, questa è anche un'impresa lunga e costosa. Così, fin dagli anni '50, gli investigatori hanno usato organoidi mammari in vitro come un modo relativamente semplice ed efficiente per affrontare le questioni riguardanti la struttura e la funzione del tessuto mammario6,7.
Nei primi protocolli che descrivono l'isolamento e la coltura delle cellule epiteliali mammarie primarie, i ricercatori hanno scoperto che una matrice di membrana seminterrato (BME), composta da un coagulo di plasma ed estratto di embrione di pollo, era necessaria per frammenti di MG coltivati su un piatto6. Nei decenni successivi, le matrici extracellulari (ECU, collagene e matrice proteica gelatina secreta dalle cellule del sarcoma murino di Engelbreth-Holm-Swarm) sono state sviluppate per facilitare la coltura 3D e imitare meglio l'ambiente in vivo7,8,9,10. Cellule cullanti in matrici 3D hanno rivelato da molteplici criteri (morfologia, espressione genica e reattività ormonale) che un tale microambiente migliori modelli in vivo fisiologici processi fisiologici9,10,11,12. La ricerca sulle cellule murine primarie ha identificato i fattori di crescita chiave e i morfogeni necessari per la manutenzione prolungata e la differenziazione degli organoidi13. Questi studi hanno posto le basi per il protocollo qui presentato, e per la coltura delle cellule mammarie umane come organoidi 3D, che è ora uno strumento clinico moderno, consentendo la scoperta di farmaci e test farmacologici su campioni di pazienti14. Nel complesso, la coltura organoide mette in evidenza le capacità di auto-organizzazione delle cellule primarie e il loro contributo alla morfogenesi e alla differenziazione.
Presentato qui è un protocollo alla cultura murine epitelia che può essere differenziato in acini di produzione di latte. Una tecnica di prova differenziale viene utilizzata per isolare i MyoEC e i LEC che compongono i due distinti compartimenti delle cellule MG. Queste frazioni cellulari separate possono quindi essere geneticamente manipolate per sovraesprimere o abbattere la funzione genica. Poiché lignaggio-intrinseco, l'auto-organizzazione è una proprietà innata delle cellule epiteliali mammarie15,16,17, ricombinando queste frazioni cellulari permette ai ricercatori di generare organoidi bistrato. Iniziamo digerindo enzimaticamente il tessuto adiposo, e poi incubando i frammenti mammari su un piatto di coltura dei tessuti per 24 h (Figura 1). I frammenti di tessuto si depositano su piatti di polistirolo come frammenti bistrato con la loro organizzazione in vivo: strato mioeelistiale esterno che circonda strati luminali interni. Questa organizzazione cellulare consente l'isolamento dei MyoEC esterni da trypsin-EDTA (0,05%) trattamento per 3-6 min seguito da un secondo giro di trippsina-EDTA (0,05%) trattamento che stacca i restanti LEC interni (Figura 2). Pertanto, questi tipi di cellule con diversa sensibilità alla trypsina sono isolati e possono essere successivamente miscelati e placcati in ECM (Figura 3). Le cellule si sottopono all'auto-organizzazione per formare sfere a scansione, che comprendono uno strato esterno di MyoEC che circondano i LEC interni. La formazione del lume si verifica quando le cellule crescono in un mezzo contenente un cocktail di fattori di crescita (vedi ricette per Mezzo di crescita)13. Dopo 5 giorni, gli organoidi possono essere differenziati in acini che producono latte passando all'Alveologenesi Medium (vedi ricette e Figura 3F)e incubati per altri 5 giorni. In alternativa, gli organoidi continueranno ad espandersi e a ramificarsi in Growth Medium per almeno 10 giorni. Gli organiidi possono essere analizzati utilizzando l'immunofluorescenza (Figura 3D-F) o rilasciati dall'ECM utilizzando una soluzione di recupero (cfr. tabella dei materiali)e analizzati tramite altri metodi (ad esempio, immunoblot, RT-qPCR).

<table><tbody><tr><td>Provetta conica in polipropilene ad alta trasparenza da 15 ml (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific 352096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di fissaggio ultra-bassa a 24 pozzetti (Corning)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CLS3473-24EA</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari Easy-Grip da 35 mm trattato TC (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico in polipropilene ad alta trasparenza da 50 ml (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>Piatto per colture cellulari Easy-Grip da 60 mm trattato TC (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>70 &; Filtro cellulare in nylon M (Corning)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Pen/Strep funziona anche</td></tr><tr><td>integratore di B27 senza vitamina A (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Topi B6 ACTb-EGFP</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>003291</td><td></td></tr><tr><td>BD Siringa da insulina 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>Classe 2 Dispasi (Roche)</td><td>Millipore Sigma</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Classe 3 Collagenasi</td><td>Worthington Biochimica</td><td>LS004206</td><td></td></tr><tr><td>Corning Soluzione di recupero cellulare</td><td>Fisher Scientific</td><td>354253</td><td>Seguire le linee guida per l'uso &ndash; Estrazione di strutture tridimensionali da Corning Matrigel Matrix</td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>CLS3471</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, senza rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>DNasi (desossiribonucleasi I)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-capra 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21447</td><td>Uso a 1:500, Lotto: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-606-150</td><td>Uso a 1:1000, Lotto: 140554, stock 1,4 mg/mL</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-250</td><td>senza Mg2+/Ca2+</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Fisher Scientific</td><td>AF-100-15-100ug</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>VWR</td><td>97068&ndash; 085</td><td>100% origine USA, qualità premium, lotto: 059B18</td></tr><tr><td>Fluoromount-G (Southern Biotech)</td><td>Fisher Scientific</td><td>0100-01</td><td>Indicato come terreno di montaggio nel testo</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-WAP</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-14832</td><td>Utilizzare in scala 1:250, lotto: J1011, stock 200 & micro; g/mL, RRID:AB_677601</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>AnaSpec</td><td>AS-83218</td><td>Utilizzare 1:2000, stock è 20mM</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6634-100mg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>KRT14&ndash; CreERtam</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5107</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Fattore di crescita ridotto (GFR); Senza rosso fenolo; 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td>Lotto: 8204010, concentrazione stock 8,9 mg/mL</td></tr><tr><td>MillexGV Unità filtrante 0,22 &; m</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millicell EZ SLIDE in vetro a 8 pozzetti, sterile</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td>Questi vetrini per camera sono ottimi per la rimozione delle guarnizioni, ma altre marche possono funzionare bene (ad es. Lab Tek II).</td></tr><tr><td>Topo anti-SMA</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2547</td><td>Utilizzare a 1:500, Lotto: 128M4881V, stock 5,2 mg/mL, RRID:AB_476701</td></tr><tr><td>Integratore N-2 (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Nrg1</td><td>R& D</td><td>5898-NR-050</td><td></td></tr><tr>Programma <td>nazionale di ormoni e peptidi</td><td></td> della<td>prolattina ipofisaria ovina</td><td>acquistato dal Dr. Parlow presso l'Istituto di ricerca e istruzione Harbor-UCLA</td></tr><tr><td>Millipore Millipore</td><td>Sigma</td><td>PX0055-3</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>R26R-EYFP</td><td>Il laboratorio Jackson</td><td>6148</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore Rho Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>R-spondina</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino filtrato sterile</td><td>Equitech-Bio Inc.</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino filtrato sterile</td><td>Equitech-Bio Inc.</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>x100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA da laboratorio 0,05%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Gli organiidi offrono strutture tissutali tridimensionali auto-organizzanti che riassumono i processi fisiologici nella comodità di un piatto. La ghiandola mammaria murina è composta da due distinti compartimenti cellulari epiteliali, che servono diverse funzioni: l'esterno, il compartimento mioeile contrattile e il compartimento luminoso interno e secretorico. Qui, descriviamo un metodo con cui le cellule che compongono questi compartimenti vengono isolate e poi combinate per studiare i loro contributi individuali di lignaggio alla morfogenesi e differenziazione della ghiandola mammaria. Il metodo è semplice ed efficiente e non richiede sofisticate tecnologie di separazione come lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza. Invece, raccogliamo e digeriamo enzimaticamente il tessuto, seminamo l'epitelio su piatti di coltura tissutale aderenti, e poi usiamo la provadifferenziata per separare il mioepitheal dalle cellule luminali con purezza del 90%. Le cellule vengono poi placcate in una matrice extracellulare dove si organizzano in organoidi bistrato tridimensionali (3D) che possono essere differenziati per produrre latte dopo 10 giorni di coltura. Per testare gli effetti delle mutazioni genetiche, le cellule possono essere raccolte da modelli murini di tipo selvatico o geneticamente modificati, oppure possono essere geneticamente manipolate prima della coltura 3D. Questa tecnica può essere utilizzata per generare organoidi a mosaico che consentono di sapieggiare la funzione genica specificamente nel compartimento luminooso o mioepitele.

Il protocollo qui presentato descrive un metodo per studiare specifici contributi di lignaggio delle cellule epiteliali mammarie facendo uso di organoidi mosaici. Per ottenere cellule murine primarie per gli organoidi, l'epitelio della ghiandola mammaria deve prima essere isolato dallo stroma ricco di adipociti circostante (Figura 1). Questo processo è descritto brevemente qui ed è descritto anche in uno studio pubblicato in precedenza18</su...

La ghiandola mammaria è una struttura bistrato, che comprende cellule epiteliali mitraeliliali ed interne interne. Presentato è un protocollo per preparare gli organoidi utilizzando la prova differenziale. Questo metodo efficiente consente ai ricercatori di manipolare separatamente questi due tipi di cellule per esplorare le domande riguardanti i loro ruoli nella forma e nella funzione della ghiandola mammaria.

Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Il nostro metodo è significativo perché consente ai ricercatori di isolare e manipolare diversi tipi di cellule per l'indagine dei loro contributi di lignaggio individuali alla forma e alla funzione dei tessuti. Questa tecnica è un metodo delicato ed efficiente per separare i tipi di cellule e, di conseguenza, l'integrità delle celle viene preservata per le impostazioni cultura 3D. Questa tecnica può anche essere applicata ad altri sistemi per isolare le cellule che non hanno biomarcatori ben caratterizzati.Per raccogliere le ghiandole mammarie numero due, tre, quattro e cinque da un topo femmina di 10-14 settimane, prima fai un'incisione di un centimetro sulla linea mediana tra i due arti posteriori. Estendere il taglio fino al collo e fare piccoli tagli laterale dall'incisione della linea mediana verso gli arti. Quindi allungare la pelle insegnata prima di fissarla con un perno su ciascun lato dell'animale.Usando le forcep, raccogliere i linfonodi dalle ghiandole numero quattro. Per rimuovere le ghiandole mammarie, utilizzare forbici affilate per tagliare sotto ogni regione del tessuto, posizionando i tessuti in 50 millilitri di quattro gradi Celsius DMEM-F12 integrati con 5%FBS

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Biologia dello sviluppo

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Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Coltura cellulare primaria utilizzando organoidi tessuto intatto fornisce un sistema modello che simula il microambiente multi-cellulare in vivo. Abbiamo sviluppato un primo modello di coltura di tessuti epitelio mammario senza siero che perpetua linee di colture cellulari miste e mostre differenziati morfologia, senza interruzione del tessuto enzimatico. Organoidi seno rimangono vitali per&gt; 6 mesi.

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Scopri come isolare cellule mioepiteliali e luminali da ghiandole mammarie murine mediante tripsinizzazione differenziale. Questo metodo preserva l'integrità cellulare per colture 3D e organoidi.

Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

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