Name: Quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra Larval utilizzando la microscopia Brightfield (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Impara a quantificare le dimensioni epatiche in larve di Danio rerio con microscopia brightfield. Questo metodo permette di valutare effetti genetici e farmacologici sulla crescita epatica.

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Vorremmo riconoscere Maurine Hobbs e la Centralit zebrefish Animal Resource dell'Università dello Utah per aver fornito allevamento di pesci zebra, spazi di laboratorio e attrezzature per svolgere porzioni di questa ricerca. L'espansione del cSAR è supportata in parte dalla sovvenzione NIH - 1G20OD018369-01. Ringraziamo anche Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum e il Huntsman Cancer Institute (HCI) zebrefish Facility per la cura del pesce zebra. Vorremmo ringraziare Kenneth Kompass per l'aiuto con la programmazione R. Questo lavoro è stato finanziato in parte dalle sovvenzioni della Huntsman Cancer Foundation (in collaborazione con la sovvenzione P30 CA042014 assegnata al Huntsman Cancer Institute) (KJE) e NIH/NCI R01CA222570 (KJE).

Gli studi sugli animali sono effettuati seguendo le procedure approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dello Utah.
1. Fissaggio larve
<ol><li>A 3-7 giorni dopo la fecondazione (dpf), le larve di eutanasia con metanotrico tricaino (0,03%) e raccogliere fino a 15 larve in un tubo da 2 mL utilizzando una pipetta di vetro e una pompa pipetta.</li>
	<li>Lavare le larve due volte con 1 mL di freddo (4 gradi centigradi) 1x salina tampone di fosfato (PBS) sul ghiaccio. Per ogni lavaggio, rimuovere il più liquido possibile dal tubo con una pipetta di vetro e una pompa pipetta, quindi aggiungere 1 mL di PBS freddo al tubo.</li>
	<li>Rimuovere il più possibile PBS utilizzando una pipetta di vetro e una pompa pipetta, e aggiungere 1 mL di freddo (4 C) 4% paraformaldeide (PFA) in PBS. AVVISO: il PFA è un cancerogeno irritante e sospetto. I guanti devono essere indossati durante la movimentazione di PFA e le soluzioni concentrate devono essere maneggiate in una cappa di fumi chimici.</li>
	<li>Incubare a 4 gradi centigradi almeno durante la notte (ma fino a diversi mesi) con dondolo delicato.</li>
</ol>2. Dissezionare i tessuti che circondano il fegato
<ol><li>Rimuovere le larve dal PFA risciacquando 3x con 1 mL di PBS freddo (4 gradi centigradi) e dondolando per 5 min tra i risciacqui. NOTA: È bene mantenere le larve sciacquate in PBS per un giorno o due a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Pipette diverse larve in PBS in un pozzo di una teglia di vetro a fondo rotondo 9 pozzetto.</li>
	<li>Rimuovere la pelle che circonda il fegato.<ol>
<li>Utilizzare pinze sottili per trattenere la larva sulla schiena (pancia in su), afferrando su entrambi i lati della testa il più delicatamente possibile. Quindi utilizzare pinze molto sottili nell'altra mano per afferrare la pelle appena sopra il cuore.</li>
		<li>Tirare la pelle in diagonale verso la coda del pesce e il fondo del piatto sul lato sinistro o destro del pesce. Ripetere l'operazione per l'altro lato (destro o sinistro).</li>
		<li>Continuare a afferrare lembi di pelle e tirare verso il basso / indietro fino a quando tutta la pelle e melanofori sovrastanti o vicino al fegato sono stati rimossi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il tuorlo, se presente.<ol>
<li>Per 5-6 larve dpf, sollevare il tuorlo in un unico pezzo tenendo il pesce con pinze sottili sulla schiena e utilizzando le pinze molto sottili per spingere delicatamente il tuorlo.</li>
		<li>Per 3-4 larve dpf, raschiare il tuorlo a pezzi. Tenere il pesce con pinze sottili sulla schiena e utilizzare le pinze molto sottili per accarezzare il tuorlo, a partire dal lato ventrale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mettere le larve sezionate in PBS freddo fresco utilizzando una pipetta di vetro e una pompa pipetta.</li>
</ol>3. Imaging
<ol><li>Per montare le larve, versare qualche mL di cellulosa metilica del 3% sul coperchio di un piatto di Petri di plastica pulita.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta di vetro e una pompa pipetta per aggiungere larve alla cellulosa metile, aggiungendo il minor numero possibile di PBS alle larve.</li>
	<li>Sotto un microscopio sezionato a bassa ingrandimento, utilizzare pinze sottili per orientare i pesci in modo che siano posati sul loro lato destro, rivolto a sinistra. NOTA: Assicurarsi che i pesci siano perfettamente orientati su un fianco o che le misurazioni del fegato non siano accurate.</li>
	<li>Scatta una foto di ogni pesce.<ol>
<li>Verificare che il pesce da fotografare sia perfettamente allineato, con un occhio direttamente sopra l'altro occhio. Se necessario, utilizzare pinze sottili per toccare leggermente sulla testa o sulla coda dei pesci per regolare l'orientamento. Se la coda del pesce è piegata, rimuovere la coda pizzicandola con forza con pinze per rimuoverla in modo che il pesce si stende piatta.</li>
		<li>Ingrandire l'ingrandimento elevato e concentrarsi sul fegato, facendo in modo che il contorno del fegato è chiaramente visibile.</li>
		<li>Scattare una foto e salvare il file.</li>
		<li>Ripetere l'operazione per tutti i pesci, assicurandosi che l'ingrandimento sia lo stesso per ogni immagine.</li>
		<li>Scattare una foto di un micrometro utilizzando lo stesso ingrandimento (vedere Figura 2H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analisi dell'immagine
<ol><li>Misurare l'area del fegato di ogni pesce utilizzando il software di elaborazione delle immagini.<ol>
<li>Cieco tutte le immagini di fegato per evitare potenziali pregiudizi investigatori e promuovere il rigore scientifico15. Questo passaggio può essere eseguito manualmente da un altro membro del laboratorio o utilizzando un programma per computer (Supplementary Material). Rinominare i file in modo casuale e creare un "file di randomizzazione" contenente un elenco dei nomi di file originali e corrispondenti nomi di file accecati.</li>
		<li>Aprire i file randomizzati in ordine, a partire dal file 1.</li>
		<li>Scegliere lo strumento selezioni a mano libera e delineare ogni fegato.</li>
		<li>Premere Ctrl-M per misurare l'area di ogni fegato.</li>
		<li>Per tutti i fegati che non possono essere misurati con precisione, inserire una misura segnaposto (molto piccola o molto grande, quindi può essere facilmente esclusa in seguito).</li>
		<li>Salvare le misure in un file di testo ("file di misurazioni").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Un-blind e analizzare i dati<ol>
<li>Aprire "file di misurazione" e "file di randomizzazione" in un foglio di calcolo.</li>
		<li>Inserire una nuova colonna nel "file di misurazione" e aggiungere i nomi dei file originali per i file accecati, utilizzando il "file di randomizzazione". Salvare il file come "file di misure non cieche".</li>
		<li>Ordinare i dati in base al nome file originale.</li>
		<li>Assicurarsi di escludere eventuali misurazioni epatiche per le quali le immagini erano inadeguate (vedere figura 2A–G).</li>
		<li>Se necessario, convertire i valori di misurazione nella scala desiderata (mm2, ad esempio).<ol>
<li>Aprire la barra della scala nel software di elaborazione delle immagini.</li>
			<li>Utilizzare lo strumento linea retta per misurare 1 mm sulla barra della scala. Il software di elaborazione delle immagini misurerà nelle stesse unità dei fegati (pixel), dando un fattore di conversione.</li>
			<li>Utilizzare il fattore di conversione per convertire le misurazioni nel "file di misure non cieche".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzando il programma per fogli di calcolo o incollando i dati in un software scientifico di grafici e statistiche, determinare la media e la deviazione standard e calcolare i valori p.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lin, D. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li>
<li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+hepatocellular+carcinoma%3A+Epidemiology%2C+etiology%2C+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+%CE%B2-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras%28V12%29+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+kras%28V12%29+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).</li>
<li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish%3A+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).</li>
<li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae%3A+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).</li>
<li>Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li>
<li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).</li>
<li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Quantificazione della dimensione del fegato è cruciale negli studi volti a comprendere lo sviluppo del fegato, rigenerazione, e oncogenesi. Il protocollo qui descritto è una tecnica relativamente rapida, facile ed economica per la quantificazione delle dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale. L'esercizio di un'adeguata cautela durante l'esecuzione di determinati aspetti del protocollo può aiutare a migliorare la precisione dei risultati e a ridurre la frustrazione.
Una corretta fissazion...

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la malignità primaria più comune del fegato1 e la terza causa principale di mortalità correlata al cancro2. Per comprendere meglio i meccanismi dell'epatocarcinogenesi e identificare potenziali terapie HCC, noi e altri abbiamo sviluppato pesci zebra transgenici in cui l'espressione specifica dell'epatocite di oncogeni come3,4, Kras (V12)5,6, Myc7o Yap18 porta all'HCC negli animali adulti. In questi pesci zebra, l'allargamento del fegato è notato già 6 giorni dopo la fecondazione (dpf), fornendo una piattaforma facile per testare gli effetti dei farmaci e alterazioni genetiche sulla crescita eccessiva del fegato guidato dall'oncogene. Una misurazione accurata e precisa delle dimensioni del fegato larvale è essenziale per determinare gli effetti di queste manipolazioni.
Le dimensioni e la forma del fegato possono essere valutate in modo semi-quantitativo nelle larve fisse di pesce zebra da CY3-SA etichettatura9 o in larve di pesce zebra dal vivo utilizzando giornalisti fluorescenti epatociti specifici e microscopia sesicazione fluorescenza5,6. Quest'ultimo metodo è relativamente veloce, e la sua mancanza di precisione può essere affrontata fotografando e misurando l'area di ogni fegato utilizzando il software di elaborazione delle immagini7,10. Tuttavia, può essere tecnicamente difficile posizionare uniformemente tutte le larve vive in un esperimento tale che l'area epatica bidimensionale è una rappresentazione accurata delle dimensioni del fegato. Una tecnica simile per la quantificazione delle dimensioni del fegato prevede l'utilizzo della microscopia a fluorescenza leggera per quantificare il volume epatico larvale8, che può essere più accurata per rilevare le differenze di dimensioni quando il fegato viene espanso in modo non uniforme in diverse dimensioni. Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) può essere utilizzato per contare il numero di epatociti fluorescenti e altri tipi di cellule epatiche nei fegati larve8,11. In questo metodo, i fegati larghi sono raggruppati e dissociati, quindi le informazioni sulle dimensioni e la forma del singolo fegato vengono perse. In combinazione con un altro metodo di determinazione delle dimensioni del fegato, FACS consente la differenziazione tra aumento del numero di cellule (iperplasia) e aumento delle dimensioni della cellula (ipertrofia). Tutti questi metodi impiegano una costosa tecnologia a fluorescenza (microscopio o selezionatrice cellulare) e, fatta eccezione per l'etichettatura CY3-SA, richiedono l'etichettatura degli epatociti con un reporter fluorescente.
Qui descriviamo in dettaglio un metodo per quantificare l'area del fegato larvale del pesce zebra utilizzando la microscopia a campo luminoso e il software di elaborazione delle immagini3,12,13,14. Questo protocollo consente una quantificazione precisa dell'area dei singoli fegati in situ senza l'uso della microscopia a fluorescenza. Durante l'analisi delle dimensioni del fegato, accechiamo l'identità dell'immagine per ridurre la distorsione degli sperimentatori e migliorare il rigore scientifico15.

<table><tbody><tr><td>Telecamera per microscopio da dissezione</td><td>Leica, ad esempio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Leica, ad esempio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine (Dumont #5) pinza</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Immagine J/FIJI</td><td></td><td>ImageJ/FIJI può essere scaricato gratuitamente: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Fornitori</td><td></td><td></td>vari</tr><tr><td>Pompa per pipette</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri in plastica</td><td>USA Scientific Inc</td><td>2906</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Piastra in vetro a fondo tondo a 9 pozzetti</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>Software per l'accecamento dei file</td><td>R project</td><td></td><td>R può essere scaricato gratuitamente: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>Software scientifico per grafici e statistiche</td><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foglio di calcolo Microsoft</td><td>Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaina metanesolfonato (Tricaina-S)</td><td>Western Chemical</td><td>200-226</td><td></td></tr><tr><td>Molto fine (Dumont #55) pinza</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra larval utilizzando la microscopia brightfield

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In diversi modelli transgenici di pesce zebra del carcinoma epatocellulare (HCC), l'epatomegalia può essere osservata durante le fasi precoci della larva. Quantificare le dimensioni del fegato larvale nei modelli HCC del pesce zebra fornisce un mezzo per valutare rapidamente gli effetti dei farmaci e di altre manipolazioni su un fenotipo relativo all'oncogene. Qui mostriamo come riparare le larve di pesce zebra, sezionare i tessuti che circondano il fegato, fotografare i fegati usando la microscopia a campo luminoso, misurare l'area del fegato e analizzare i risultati. Questo protocollo consente una quantificazione rapida e precisa delle dimensioni del fegato. Poiché questo metodo comporta la misurazione dell'area del fegato, può sottovalutare le differenze nel volume del fegato e sono necessarie metodologie complementari per distinguere tra i cambiamenti nelle dimensioni delle cellule e i cambiamenti nel numero di cellule. La tecnica di dissezione qui descritta è un ottimo strumento per visualizzare il fegato, l'intestino e il pancreas nelle loro posizioni naturali per una miriade di applicazioni a valle, tra cui la colorazione immunofluorescenza e l'ibridazione in situ. La strategia descritta per la quantificazione delle dimensioni del fegato larvale è applicabile a molti aspetti dello sviluppo e della rigenerazione epatica.

Pesci zebra transgenici che esprimono l'epatocite specifico attivato a z-catenina(Tg(fabp10a:pt-z-cat) pesce zebra)3 e i fratelli di controllo non transgenici sono stati eutanasiati a 6 dpf e l'area del fegato è stata quantificata utilizzando un software di microscopia e elaborazione delle immagini a campo luminoso. I pesci zebra transgenici hanno aumentato significativamente le dimensioni del fegato (0,0006 cm2) rispetto ai loro fratelli non transgenici (0,0004 cm<sup...

Qui dimostriamo un metodo per quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale, fornendo un modo per valutare gli effetti delle manipolazioni genetiche e farmacologiche sulla crescita e lo sviluppo del fegato.

Quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra Larval utilizzando la microscopia Brightfield

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Questo metodo fornisce un modo per quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale. Consente inoltre di valutare gli effetti della manipolazione genetica e farmacologica sulla crescita e lo sviluppo del fegato. Questa tecnica fornisce un modo rapido e preciso per visualizzare e misurare il fegato, nonché l'intestino e il pancreas.Oltre a quantificare le dimensioni del fegato, questo metodo di dissezione può essere utile per preparare il fegato, l'intestino e il pancreas per l'ibridazione in situ o l'imaging confocale. Prima di tentare la deskinning sulle larve sperimentali, assicurati di aver trascorso molto tempo a esercitarti su campioni non sperimentali e di avere un tasso di successo significativo. È fondamentale visualizzare il corretto orientamento e movimento delle larve e delle forcep di zebrafish al fine di rimuovere la pelle senza disturbare gli organi circostanti.A tre o sette giorni dopo la fecondazione, dopo aver eutanasiato le larve, utilizzare una pipetta di vetro e una pompa pipetta per raccogliere fino a 15 larve in un tubo da due millilitri. Lavare le larve due volte con un millilitro di 1X PBS freddo sul ghiaccio. Rimuovere il più PBS possibile utilizzando una pipetta di vetro e una pompa di pipetta e aggiungere un millilitro di PFA freddo al quattro per cento in PBS.Incubare a quattro gradi Celsius almeno durante la notte con un dolce dondolo. Utilizzando una pipetta di vetro e una pompa di pipetta, rimuovere il PFA dal tubo e risciacquare tre volte con un millilitro di PBS freddo. Rock per cinque minuti tra un risciacquo e l'altro.Pipetta diverse larve in PBS in un pozzo di nove ben fondo piatto di vetro rotondo. Al microscopio, rimuovere la pelle che circonda il fegato usando forcep fini per tenere una larva sulla schiena, afferrando entrambi i lati della testa il più delicatamente possibile. Quindi usa forcep molto fini nell'altra mano per afferrare la pelle appena sovrascriva il cuore.Tirare la pelle verso il basso diagonalmente verso la coda del pesce nella parte inferiore del piatto sul lato sinistro o destro del pesce. Ripetere per l'altro lato. Continuare ad afferrare lembi di pelle e tirare verso il basso fino a quando tutta la pelle e i melanofori sovrastante o vicino al fegato sono stati rimossi.Se il tuorlo è presente per cinque o sei giorni di larve post-fecondazione, sollevare il tuorlo in un unico pezzo tenendo il pesce con forcep fini sulla schiena e usando le forcep molto fini per pungere delicatamente il tuorlo. Per tre o quattro larve DPF, tenere il pesce con forcep fini sulla schiena e utilizzare le forcep molto fini per accarezzare il tuorlo a partire dal lato ventrale. Raschiare il tuorlo a pezzi.Posizionare le larve sezionate in PBS fresco e freddo in un tubo da due millilitri utilizzando una pipetta di vetro e una pompa di pipetta. Per montare le larve, versare alcuni millilitri di metilcellulosa al tre per cento sul coperchio di una piastra di Petri pulita e plastica. Utilizzare una pipetta di vetro e una pompa di pipetta per aggiungere larve alla metilcellulosa, aggiungendo il meno PBS possibile con le larve.Sotto un microscopio sezionato a basso ingrandimento, utilizzare forcep fini per orientare il pesce in modo che siano sdraiati sul lato destro rivolto a sinistra. Conferma che il pesce da fotografare sia perfettamente allineato con un occhio direttamente sopra l'altro occhio. Se la coda del pesce è piegata, rimuovere la coda pizzicandola con forza con le forcep per rimuoverla in modo che il pesce giace piatto.Ingrandisci ad alto ingrandimento e concentrati sul fegato, assicurandoti che il contorno del fegato sia chiaramente visibile. Premere il pulsante Acquisisci immagine per ancorare un'immagine e salvare il file. Ripetere per tutti i pesci, assicurandosi che l'ingrandimento sia lo stesso per ogni immagine.Scatta una foto di un micrometro usando lo stesso ingrandimento. Per utilizzare il programma R per accecare tutte le immagini del fegato per evitare potenziali pregiudizi degli investigatori e promuovere il rigore scientifico, rinominare i file in modo casuale e creare un file di randomizzazione contenente un elenco dei nomi di file originali e corrispondenti nomi di file accecati. Aprire i file randomizzati in ordine, a partire dal file uno.Scegliere lo strumento Selezioni a mano libera e delineare ogni fegato. Premere Ctrl-M per misurare l'area di ogni fegato. Per tutti i fegati che non possono essere misurati con precisione perché hanno pelle residua, tuorlo, sono fuori fuoco o non sono intatti, inserire una misurazione segnaposto.Salvare le misure in un file di testo. Per dislinare e analizzare i dati, aprire il file di misurazione e il file di randomizzazione in un programma di fogli di calcolo. Inserire una nuova colonna nel file di misure e aggiungere i nomi di file originali per i file accecati utilizzando il file di randomizzazione.Salvare il file come file Misure non conciate. Ordinare i dati in base al nome del file originale. Escludere eventuali misurazioni del fegato per le quali le immagini non erano adeguate.Se necessario, convertire i valori di misurazione nella scala desiderata in millimetri quadrati. Aprire la barra Scala nel software di elaborazione delle immagini. Utilizzare lo strumento Linea retta per misurare un millimetro sulla barra di scala.Il software di elaborazione delle immagini misura quindi nelle stesse unità dei fegati, dando un fattore di conversione. Utilizzate il fattore di conversione per convertire le misurazioni nel file Misure non conociate. Determinare la deviazione media e standard e calcolare i valori P.A sei giorni dalla fecondazione, le larve di zebrafish non transgeniche mostravano la posizione naturale e la forma del fegato che sovrastava l'intestino. I pesci zebra transgenici hanno aumentato significativamente le dimensioni del fegato rispetto ai loro fratelli non transgenici. Qui vengono mostrati alcuni esempi di immagini e micrometri inadeguati.Larva con la pelle che copre il fegato, larva con tuorlo che oscura il fegato, larva con parti del fegato pizzicate e larva con fegato lussato e cadente, larva con fegato mancante, larva con contorno epatico difficile da identificare e larva con posizionamento improprio. Quando si tenta questa procedura, è importante utilizzare movimenti piccoli e controllati per prevenire danni al fegato. Oltre alla microscopia a campo brillante, possiamo anche usare larve sezionate in questo modo, per microscopia confocale, per visualizzare proteine reporter fluorescenti o colorazione immuno-fluorescente e per l'ibridazione in situ.La formaldeide o PFA è un agente cancerogeno irritante e sospetto. I guanti devono essere indossati durante la manipolazione della PFA e le soluzioni concentrate devono essere maneggiate in una cappa aspirante chimica.

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