Quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra Larval utilizzando la microscopia Brightfield
February 2nd, 2020
Qui dimostriamo un metodo per quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale, fornendo un modo per valutare gli effetti delle manipolazioni genetiche e farmacologiche sulla crescita e lo sviluppo del fegato.
Questo metodo fornisce un modo per quantificare le dimensioni del fegato nel pesce zebra larvale. Consente inoltre di valutare gli effetti della manipolazione genetica e farmacologica sulla crescita e lo sviluppo del fegato. Questa tecnica fornisce un modo rapido e preciso per visualizzare e misurare il fegato, nonché l'intestino e il pancreas.
Oltre a quantificare le dimensioni del fegato, questo metodo di dissezione può essere utile per preparare il fegato, l'intestino e il pancreas per l'ibridazione in situ o l'imaging confocale. Prima di tentare la deskinning sulle larve sperimentali, assicurati di aver trascorso molto tempo a esercitarti su campioni non sperimentali e di avere un tasso di successo significativo. È fondamentale visualizzare il corretto orientamento e movimento delle larve e delle forcep di zebrafish al fine di rimuovere la pelle senza disturbare gli organi circostanti.
A tre o sette giorni dopo la fecondazione, dopo aver eutanasiato le larve, utilizzare una pipetta di vetro e una pompa pipetta per raccogliere fino a 15 larve in un tubo da due millilitri. Lavare le larve due volte con un millilitro di 1X PBS freddo sul ghiaccio. Rimuovere il più PBS possibile utilizzando una pipetta di vetro e una pompa di pipetta e aggiungere un millilitro di PFA freddo al quattro per cento in PBS.
Incubare a quattro gradi Celsius almeno durante la notte con un dolce dondolo. Utilizzando una pipetta di vetro e una pompa di pipetta, rimuovere il PFA dal tubo e risciacquare tre volte con un millilitro di PBS freddo. Rock per cinque minuti tra un risciacquo e l'altro.
Pipetta diverse larve in PBS in un pozzo di nove ben fondo piatto di vetro rotondo. Al microscopio, rimuovere la pelle che circonda il fegato usando forcep fini per tenere una larva sulla schiena, afferrando entrambi i lati della testa il più delicatamente possibile. Quindi usa forcep molto fini nell'altra mano per afferrare la pelle appena sovrascriva il cuore.
Tirare la pelle verso il basso diagonalmente verso la coda del pesce nella parte inferiore del piatto sul lato sinistro o destro del pesce. Ripetere per l'altro lato. Continuare ad afferrare lembi di pelle e tirare verso il basso fino a quando tutta la pelle e i melanofori sovrastante o vicino al fegato sono stati rimossi.
Se il tuorlo è presente per cinque o sei giorni di larve post-fecondazione, sollevare il tuorlo in un unico pezzo tenendo il pesce con forcep fini sulla schiena e usando le forcep molto fini per pungere delicatamente il tuorlo. Per tre o quattro larve DPF, tenere il pesce con forcep fini sulla schiena e utilizzare le forcep molto fini per accarezzare il tuorlo a partire dal lato ventrale. Raschiare il tuorlo a pezzi.
Posizionare le larve sezionate in PBS fresco e freddo in un tubo da due millilitri utilizzando una pipetta di vetro e una pompa di pipetta. Per montare le larve, versare alcuni millilitri di metilcellulosa al tre per cento sul coperchio di una piastra di Petri pulita e plastica. Utilizzare una pipetta di vetro e una pompa di pipetta per aggiungere larve alla metilcellulosa, aggiungendo il meno PBS possibile con le larve.
Sotto un microscopio sezionato a basso ingrandimento, utilizzare forcep fini per orientare il pesce in modo che siano sdraiati sul lato destro rivolto a sinistra. Conferma che il pesce da fotografare sia perfettamente allineato con un occhio direttamente sopra l'altro occhio. Se la coda del pesce è piegata, rimuovere la coda pizzicandola con forza con le forcep per rimuoverla in modo che il pesce giace piatto.
Ingrandisci ad alto ingrandimento e concentrati sul fegato, assicurandoti che il contorno del fegato sia chiaramente visibile. Premere il pulsante Acquisisci immagine per ancorare un'immagine e salvare il file. Ripetere per tutti i pesci, assicurandosi che l'ingrandimento sia lo stesso per ogni immagine.
Scatta una foto di un micrometro usando lo stesso ingrandimento. Per utilizzare il programma R per accecare tutte le immagini del fegato per evitare potenziali pregiudizi degli investigatori e promuovere il rigore scientifico, rinominare i file in modo casuale e creare un file di randomizzazione contenente un elenco dei nomi di file originali e corrispondenti nomi di file accecati. Aprire i file randomizzati in ordine, a partire dal file uno.
Scegliere lo strumento Selezioni a mano libera e delineare ogni fegato. Premere Ctrl-M per misurare l'area di ogni fegato. Per tutti i fegati che non possono essere misurati con precisione perché hanno pelle residua, tuorlo, sono fuori fuoco o non sono intatti, inserire una misurazione segnaposto.
Salvare le misure in un file di testo. Per dislinare e analizzare i dati, aprire il file di misurazione e il file di randomizzazione in un programma di fogli di calcolo. Inserire una nuova colonna nel file di misure e aggiungere i nomi di file originali per i file accecati utilizzando il file di randomizzazione.
Salvare il file come file Misure non conciate. Ordinare i dati in base al nome del file originale. Escludere eventuali misurazioni del fegato per le quali le immagini non erano adeguate.
Se necessario, convertire i valori di misurazione nella scala desiderata in millimetri quadrati. Aprire la barra Scala nel software di elaborazione delle immagini. Utilizzare lo strumento Linea retta per misurare un millimetro sulla barra di scala.
Il software di elaborazione delle immagini misura quindi nelle stesse unità dei fegati, dando un fattore di conversione. Utilizzate il fattore di conversione per convertire le misurazioni nel file Misure non conociate. Determinare la deviazione media e standard e calcolare i valori P.
A sei giorni dalla fecondazione, le larve di zebrafish non transgeniche mostravano la posizione naturale e la forma del fegato che sovrastava l'intestino. I pesci zebra transgenici hanno aumentato significativamente le dimensioni del fegato rispetto ai loro fratelli non transgenici. Qui vengono mostrati alcuni esempi di immagini e micrometri inadeguati.
Larva con la pelle che copre il fegato, larva con tuorlo che oscura il fegato, larva con parti del fegato pizzicate e larva con fegato lussato e cadente, larva con fegato mancante, larva con contorno epatico difficile da identificare e larva con posizionamento improprio. Quando si tenta questa procedura, è importante utilizzare movimenti piccoli e controllati per prevenire danni al fegato. Oltre alla microscopia a campo brillante, possiamo anche usare larve sezionate in questo modo, per microscopia confocale, per visualizzare proteine reporter fluorescenti o colorazione immuno-fluorescente e per l'ibridazione in situ.
La formaldeide o PFA è un agente cancerogeno irritante e sospetto. I guanti devono essere indossati durante la manipolazione della PFA e le soluzioni concentrate devono essere maneggiate in una cappa aspirante chimica.
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Panoramica
Questo metodo fornisce un modo per quantificare la dimensione del fegato in zebrine larvali, consentendo la valutazione di manipolazioni genetiche e farmacologiche sulla crescita e lo sviluppo del fegato. Facilita anche la visualizzazione e la misurazione del fegato, dell'intestino e del pancreas.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia dello sviluppo
- Genetica
Sfondo
- La quantificazione della dimensione del fegato è cruciale per comprendere lo sviluppo degli organi.
- Le zebrine larvali servono come organismo modello per gli studi sullo sviluppo.
- Le manipolazioni genetiche e farmacologiche possono influenzare la crescita degli organi.
- Una tecnica corretta è essenziale per una dissezione e una visualizzazione di successo.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per quantificare la dimensione del fegato in zebrine larvali.
- Valutare l'impatto di interventi genetici e farmacologici sullo sviluppo del fegato.
- Preparare gli organi per ulteriori tecniche di analisi come l'ibridizzazione in situ.
Metodi utilizzati
- Dissezione di zebrine larvali per esporre il fegato, l'intestino e il pancreas.
- Tecniche di visualizzazione per misurare la dimensione degli organi.
- Pratica su campioni non sperimentali per garantire la competenza nella tecnica.
- Orientamento e controllo del movimento durante la dissezione per evitare danni agli organi.
Principali risultati
- Il metodo permette una misurazione rapida e precisa della dimensione del fegato.
- Facilita lo studio dello sviluppo degli organi in risposta alle manipolazioni.
- Fornisce una base per ulteriori studi di imaging.
- Dimostra l'importanza della tecnica nei risultati sperimentali.
Conclusioni
- Questo metodo è efficace per quantificare la dimensione del fegato in zebrine larvali.
- Supporta la valutazione degli effetti genetici e farmacologici sulla crescita degli organi.
- Una tecnica di dissezione corretta è fondamentale per risultati sperimentali di successo.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantifying larval liver size in zebrafish models enables rapid assessment of drug effects on oncogene-related phenotypes, supporting early-stage target validation in hepatocellular carcinoma research. This method provides predictive confidence by linking genetic or pharmacologic interventions to measurable organ growth changes, informing portfolio triage decisions. The approach supports mechanistic de-risking by offering a quantitative, reproducible readout for pathway modulation in preclinical disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring liver area changes in response to oncogene modulation.
- Operational Value: Provides a rapid, precise quantification method suitable for high-throughput screening of genetic or pharmacologic interventions.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through objective, measurable phenotypes that correlate with disease-related hepatomegaly.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Dissection protocol prepares liver, gut, and pancreas for downstream applications like immunofluorescence and in situ hybridization.
- Reproducibility: Standardized fixation, dissection, and imaging steps ensure consistent liver area measurements across experimental groups.
- Scalability: Method allows processing of up to 15 larvae per tube, supporting batch-wise analysis for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma where hepatomegaly is an early larval phenotype.
- Translational Continuity: Enables seamless transition from discovery to preclinical validation by providing quantifiable organ size data.
- Risk-Adjusted Decisions: Liver size measurements inform go/no-go decisions based on dose-dependent or genotype-dependent growth effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a quantitative bridge between genetic manipulation and phenotypic outcome.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking oncogene expression to measurable liver area changes in larval zebrafish.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (liver area in mm²) that enable reliable comparison across treatment conditions.
- Analytics: Generates measurable data (mean, standard deviation, P-values) suitable for statistical analysis and hit confirmation.
- Translational Research: Connects early phenotypic screening to preclinical continuity through disease-relevant liver hypertrophy readouts.
- Enterprise Reuse: Dissection and imaging workflow is adaptable across multiple organ systems (liver, gut, pancreas) and compatible with multiplexed downstream assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing a direct, quantifiable readout of liver growth in response to pathway modulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through blinded image analysis and scale-bar calibration.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early phenotypic assessment, reducing investment in ineffective targets.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by identifying compounds or genotypes that significantly alter liver size relative to controls.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, dissection, and brightfield microscopy to avoid tissue damage.
- Depends on instrumentation including dissecting microscopes, glass pipettes, forceps, and image processing software (e.g., R, ImageJ).
- Necessitates cross-team standardization of dissection technique, file blinding, and measurement protocols to minimize investigator bias.
- Adaptation considerations include adjusting dissection timing based on larval age (3–7 dpf) and yolk presence.
- Practical limitation: Liver area measurement may underestimate volume changes; complementary methods needed to distinguish hypertrophy from hyperplasia.
