Name: Valutazione della funzione di memoria nei topi epilettici indotti da pilocarpina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Scopri come valutare le disfunzioni mnestiche nei topi epilettici indotti da pilocarpina con test comportamentali non invasivi. Questo protocollo permette di studiare il declino cognitivo associato all'epilessia minimizzando lo stress animale.

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Ringraziamo il dottor Jae-Min Lee per il suo supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziate dal governo coreano (NRF-2019R1A2C1003958, NRF-2019K2A9A2A0000167).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro descrive le procedure sperimentali per valutare la funzione cognitiva nei topi con epilessia cronica. Molti diversi paradigmi di test comportamentali vengono utilizzati per valutare le funzioni di apprendimento e memoria nei topi18. Il labirinto dell'acqua Morris, il labirinto del braccio radiale, il labirinto Y, il condizionamento contestuale della paura e i test basati su oggetti sono i test comportamentali più utilizzati e forniscono risultati affidabili. Tra questi, i test NL, NO...

L'epilessia è un disturbo cronico caratterizzato da convulsioni ricorrenti spontanee1,2,3. Poiché le crisi ripetitive possono causare anomalie strutturali e funzionali nel cervello1,2,3, un'attività convulsiva anomala può contribuire alla disfunzione cognitiva, che è una delle comorbidità associate all'epilessia più comuni4,5,6. Contrariamente agli eventi convulsioni cronici, che sono transitori e momentanei, i disturbi cognitivi possono persistere durante la vita dei pazienti epilettici, deteriorando la loro qualità di vita. Pertanto, è importante comprendere i meccanismi patofisiologici del declino cognitivo associato all'epilessia.
Vari modelli animali sperimentali di epilessia sono stati utilizzati per dimostrare i deficit di apprendimento e memoria associati all'epilessia cronica7,8,9,,10,11,12. Ad esempio, il labirinto d'acqua Morris, il condizionamento contestuale della paura, la posizione degli oggetti (NL) e i nuovi test di riconoscimento degli oggetti (NO) sono stati spesso utilizzati per valutare la disfunzione della memoria nell'epilessia del lobo temporale (TLE). Poiché l'ippocampo è una delle regioni primarie in cui il TLE mostra patologia, i test comportamentali che possono valutare la funzione di memoria dipendente dall'ippocampo sono spesso selezionati preferibilmente. Tuttavia, dato che le convulsioni possono indurre neurogenesi ippocampale aberrante e contribuire al declino cognitivo associato all'epilessia10, i paradigmi comportamentali per testare la funzione neuronale neonatale (cioè, la separazione del modello spaziale,PS) 8,13 possono anche fornire informazioni preziose sui meccanismi cellulari delle compromissione della memoria nell'epilessia.
In questo articolo, dimostriamo una batteria di test di memoria, NL, NO, e PS, per topi epilettici. I test sono semplici e facilmente accessibili e non richiedono un sistema sofisticato.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>Sung-shim</td><td></td><td>Utilizzare con l'ago da 26 o 30 gauge</td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td>Duksan</td><td>UN1170</td><td>Spray per pulire la scatola e gli oggetti</td></tr><tr><td>tenda</td><td></td><td></td> nera <td>Per evitare inutili segnali visivi</td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma</td><td>C5042</td><td>Per Cresyl violet</td></tr><tr><td>colorazione criotome</td><td>Leica</td><td>E21040041</td><td>Per tessuti nastro</td></tr><tr><td>biadesivo</td><td></td><td></td> per <td>il sezionamento Per il posizionamento sicuro degli oggetti</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio DPX</td><td>Sigma</td><td>06522</td><td></td></tr><tr><td>serie di etanolo</td><td>Duksan</td><td>UN1170</td><td>Marca 100%, 95%, 90%, 80%, 70% soluzioni di etanolo</td></tr><tr><td>piastra a pavimento con motivi a griglia stretta</td><td>Leehyo-bio</td><td></td><td>Attrezzatura per esperimenti comportamentali, dimensioni della piastra: 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, dimensioni della griglia: 2,75 x Piastra da pavimento da 2,75 cm</td></tr><tr><td>con ampi motivi a griglia</td><td>Leehyo-bio</td><td></td><td>Attrezzatura per esperimenti comportamentali, dimensioni della piastra: 42,5 x 42,5 x 0,5 cm, dimensioni della griglia: 5,5 x 5,5 cm</td></tr><tr><td>illuminometro</td><td>TES Electrical Electronic Corp.</td><td>1334A</td><td>Per la misurazione dell'illuminazione della stanza (60 Lux)</td></tr><tr><td>Unità di terapia intensiva</td><td>Thermocare</td><td>#W-1</td><td></td></tr><tr><td>ketamina cloridrato</td><td>Yuhan</td><td>7003</td><td>Utilizzare per anestetizzare il topo per la perfusione transcardica</td></tr><tr><td>Lampada LED</td><td>Lungo</td><td>P13A-0422-WW-04</td><td>Illuminazione per gli oggetti</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>della sala di test comportamentaleBambola di gomma, tubo di plastica da 50 ml, barattolo di vetro Coplin, fiaschetta di plastica, bottiglia di vetro</td></tr><tr><td>scatola da campo aperta</td><td>Leehyo-bio</td><td></td><td>Attrezzatura per esperimenti comportamentali, dimensioni: 44 x 44 x 31 cm</td></tr><tr><td>tovagliolo di carta</td><td>Yuhan-Kimberly</td><td>47201</td><td>Utilizzare per asciugare scatole da campo aperto e oggetti</td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Merck Millipore</td><td>104005</td><td>Preparare una soluzione al 4%</td></tr><tr><td>di pilocarpina cloridrato</td><td>Sigma</td><td>P6503</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>righello</td><td>Utilizzare per localizzare gli oggetti nella scatola a campo aperto</td></tr><tr><td>scopolamina nitrato di metile</td><td>Sigma</td><td>S2250</td><td>Marca 10X stock</td></tr><tr><td>Sistema intelligente 3.0</td><td>Panlab</td><td></td><td>Sistema di tracciamento video</td></tr><tr><td>cronometro</td><td>Junso</td><td>JS-307</td><td>Per la misurazione delle attività esplorative dei topi</td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>Per la crioprotezione di sezioni di tessuto</td></tr><tr><td>sale di terbutalina emisolfato</td><td>Sigma</td><td>T2528</td> Realizza una videocamera <td>stock 10X</td></tr><tr><td>(telecamera CCD)</td><td>Vision</td><td>VCE56HQ-12</td><td>Posizionare la telecamera direttamente sopra la scatola di campo aperto</td></tr><tr><td>xilazina (Rompun)</td><td>Bayer corea</td><td>KR10381</td><td>Utilizzare per anestetizzare il topo per la perfusione transcardica</td></tr><tr><td>xilene</td><td>Duksan</td><td>UN1307</td><td>Per Colorazione viola Cresyl</td></tr></tbody></table>

valutazione della funzione di memoria nei topi epilettici indotti da pilocarpina

Assessment of Memory Function in Pilocarpine-induced Epileptic Mice

La compromissione cognitiva è una delle comorbidità più comuni nell'epilessia del lobo temporale. Per ricapitolare il declino cognitivo associato all'epilessia associata all'epilessia in un modello animale di epilessia, abbiamo generato topi epilettici cronici trattati con pilocarpina. Presentiamo un protocollo per tre diversi test comportamentali utilizzando questi mouse epilettici: nuova posizione dell'oggetto (NL), nuovi test di riconoscimento degli oggetti (NO) e di separazione dei modelli (PS) per valutare rispettivamente l'apprendimento e la memoria per luoghi, oggetti e contesti. Spieghiamo come impostare l'apparato comportamentale e fornire procedure sperimentali per i test NL, NO e PS a seguito di un test sul campo aperto che misura le attività locomotorie basali degli animali. Descriviamo anche i vantaggi tecnici dei test NL, NO e PS rispetto ad altri test comportamentali per la valutazione della funzione di memoria nei topi epilettici. Infine, discutiamo delle possibili cause e soluzioni per i topi epilettici che non riescono a fare 30 s di buon contatto con gli oggetti durante le sessioni di familiarizzazione, che è un passaggio critico per il successo dei test di memoria. Pertanto, questo protocollo fornisce informazioni dettagliate su come valutare le compromissione di memoria associate all'epilessia utilizzando i topi. I test NL, NO e PS sono semplici, saggi efficienti che sono appropriati per la valutazione di diversi tipi di memoria nei topi epilettici.

Nella figura 1è illustrato un programma sperimentale generale e la configurazione per la valutazione della funzione cognitiva. Sei settimane dopo l'introduzione di crisi acute indotta da pilocarpina, i topi sono stati sottoposti ai test NL, NO e PS in ordine separato da periodi di riposo di 3 giorni tra i test (Figura 1A). Per il test NL, due oggetti identici sono stati inseriti nel campo aperto durante la sessione di familiarizzazione (F1) e il giorno successiv...

Questo articolo presenta procedure sperimentali per valutare i disturbi della memoria nei topi epilettici indotti da pilocarpina. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi patofisiologici del declino cognitivo associato all'epilessia, che è una delle comorbidità più comuni nell'epilessia.

Valutazione della funzione di memoria nei topi epilettici indotti da pilocarpina

Cognitive impairment is one of the most common comorbidities in temporal lobe epilepsy. To recapitulate epilepsy-associated cognitive decline in an animal ...

Il deterioramento cognitivo è una delle comorbilità più comuni nell'epilessia del lobo temporale. Presenteremo un protocollo che descrive come valutare la compromissione della memoria utilizzando un modello di topo di epilessia cronica. La nuova posizione degli oggetti, il riconoscimento di nuovi oggetti e il test di separazione del modello sono semplici e corti che possono stressare minimamente gli animali.Rende questo test ottimale per valutare la funzione della memoria nei topi epilettici, senza trigger aggiuntivi per convulsioni ricorrenti spontanee. Per iniziare, acclimatare gli animali alla scarsa illuminazione nelle loro gabbie di casa, per almeno 30 minuti. Preparare una casella di campo aperta.Il primo giorno dell'assunzione, del luogo e dell'illuminometro al centro della scatola a campo aperto. E regolare l'illuminazione a 60 Lux. Per valutare l'attività locomotoria di ogni mouse, utilizzare il software di tracciamento video del comportamento animale.Una volta aperto il software di tracciamento video, calibrare le dimensioni della casella di campo aperto. Quindi posizionare delicatamente un mouse sperimentale nella scatola di campo aperta rivolta verso il muro. Aprire programma smart, fare clic su Personalizzato e Accetta.Fare clic su Origine immagine. Dopo aver selezionato la fotocamera installata, premere il pulsante Imposta. Regolare la risoluzione della fotocamera e premere, Accetta.Dopo il clic di calibrazione, trascinare il mouse del computer per adattarlo alle dimensioni della scatola. E riempire la dimensione interna della scatola. Fare clic su Definizione zona per salvare e regolare ogni dimensione della casella e quindi fare clic su Salva.La scatola rossa è la gamma tracciata, quindi si adatta alle dimensioni della scatola interna, mentre la scatola rosa si adatta al contorno. Premere L'impostazione di rilevamento. Fare clic su Snapshot e premere Avvia test per verificare se viene tracciata un'area specifica, quindi pres Stop Test e quindi Accept.Fare clic su Impostazioni ora. Dopo aver selezionato il tempo preimpostato, impostare il tempo di latenza, a tre secondi di acquisizione su 15 minuti e premere Accetta. Premere Soggetti per impostare il nome in codice.Fare clic su Utilità di pianificazione per eliminare i dettagli esistenti e trascinare il nome in codice modificato negli argomenti nella prima sessione. Clicca su Acquisizione dati. Fare clic sul pulsante Registra e quindi su Start.Metti il mouse nella scatola e traccialo per 15 minuti. Dopo 15 minuti di registrazione riportare il mouse nella gabbia di casa. Ripristinare la luce intensa.Fare clic su Acquisizione dati. Quindi fare clic su Active Analysis Drag nome in codice Sham nella finestra accanto ad esso. Fare clic sul pulsante Definizioni report.Fare clic sul pulsante Nuove definizioni di report, quindi su Report riepilogativo e premere Accetta. Fare clic su Nome soggetto e distanza nella zona e inviarlo di lato. Quindi premere il pulsante Accetta.Fare clic sul segno di spunta rosso e fare clic su Analizza. Controlla i risultati. Il secondo giorno, e il terzo giorno, ripetere le sessioni di assuazione.Il quarto giorno eseguire la sessione di familiarizzazione. Nella luce fioca, posizionare ogni mouse nel campo aperto vuoto per tre minuti. Dopo questa breve assuzione riportare l'animale nella sua gabbia di casa.Posiziona due oggetti identici, bambole di gomma, nell'arena a campo aperto, a cinque centimetri di distanza dalle pareti adiacenti. Fissare gli oggetti con nastro a doppia fronte. Introdurre il mouse sperimentale, nella scatola di campo aperto rivolta verso il muro più lontano dagli oggetti.Consenti l'esplorazione gratuita per 20 minuti e misura manualmente il tempo trascorso ad esplorare entrambi gli oggetti utilizzando due cronometri. Non quantificare come tempo esplorativo, alcun comportamento, in cui il muso animale non punta verso l'oggetto. Una volta che il mouse raggiunge il tempo minimo di esplorazione di 30 secondi, per i due oggetti, interrompere la sessione di F1 e trasferire il mouse nella gabbia di casa.Se il mouse non riesce a esplorare gli oggetti per 30 secondi entro 20 minuti, rimuovere il mouse dalla casella di campo aperto ed escluderlo da ulteriori sessioni. Il quinto giorno, eseguire la nuova sessione di test della posizione dell'oggetto. Trasferire il mouse nell'area del campo aperto per la riabilitazione per tre minuti.Quindi restituiscilo alla sua gabbia di casa. Spostare un oggetto nella posizione diagonale e posizionare il mouse sperimentale rivolto verso la parete della casella di campo aperto. Concedi 10 minuti di esplorazione e registrazione gratuiti con un sistema di tracciamento video.Misura, il tempo trascorso ad esplorare ogni oggetto, usando due cronometri. Successivamente, trasferisci il topo nella sua gabbia di casa, afferrando la coda. Per tre giorni, lascia riposare il mouse con libero accesso a cibo e acqua.Il primo giorno eseguire una sessione di assunzione di 15 minuti, per un mouse. Il giorno 10 eseguire la breve sessione di riabilitazione, per tre minuti. Quindi restituirlo temporaneamente alla sua gabbia di casa.Posizionare due oggetti identici, tubi di plastica da 50 millilitri riempiti con 40 millilitri di acqua, in pieno campo, a cinque centimetri di distanza dalle pareti adiacenti. Introdurre il mouse sperimentale nella casella di campo aperto, rivolto verso la parete più lontano dagli oggetti. Poiché il topo sarà esposto ai due diversi oggetti nel NO Test, un tubo di plastica da 50 millilitri riempito con 40 millilitri di acqua e un barattolo di barattoli coplin di vetro.Controbilanciare l'oggetto durante la sessione di familiarizzazione, presentando due oggetti identici, barattoli di coplin in vetro, per metà degli animali del gruppo. Quindi, con due oggetti diversi, consentire l'esplorazione gratuita per 20 minuti e misurare manualmente il tempo trascorso ad esplorare entrambi gli oggetti utilizzando due cronometri. Una volta che il mouse raggiunge l'ora di scadenza minima di 30 secondi per entrambi gli oggetti, interrompere la sessione di familiarizzazione.Il giorno successivo, eseguire la nuova sessione di test di riconoscimento degli oggetti. In primo luogo, trasferire il mouse sul campo aperto per la riabilitazione, per tre minuti, e poi restituirlo alla gabbia di casa. A cinque centimetri di distanza dalle pareti adiacenti, sostituire il tubo con un barattolo di barattoli coplin di vetro, in modo che i topi siano esposti a un tubo e un barattolo di barattoli coplin di vetro.Per metà degli animali esposti ai barattoli di vetro Coplin durante la prima sessione di familiarizzazione, sostituire il barattolo di barattoli coplin di vetro con un tubo di plastica da 50 millilitri riempito con 40 millilitri di acqua. In modo che i topi siano esposti a un tubo e un barattolo di barattoli di coplin di vetro. Concedi 10 minuti di esplorazione gratuita durante la registrazione utilizzando un sistema di tracciamento video.Quindi afferra la coda del topo sperimentale e trasferiscile nella sua gabbia di casa. Per tre giorni e lasciare riposare il mouse con libero accesso a cibo e acqua. Per l'analisi NL, aprire Avvia programma personalizzato e Accetta.Fare clic su Origine immagine. Dopo aver selezionato la fotocamera installata, premere il pulsante Imposta. Solo la risoluzione della fotocamera e premere Accetta.Fare clic sul pulsante Apri cartella video per aprire il video salvato. Guarda il video salvato per 10 minuti dal momento in cui entra il mouse e misura il tempo trascorso a esplorare ogni oggetto. Il giorno 15 ha eseguito per la prima volta la prima sessione di familiarizzazione per il test PS.Questo è per il mouse all'area di campo aperto per la riabilitazione, per tre minuti. Posizionare la piastra del pavimento con l'ampia griglia e due oggetti identici. Le fiasche a T in plastica riempite con 50 millilitri d'acqua, nella scatola a campo aperto.Quindi ha introdotto il mouse sperimentale nella scatola di campo aperto rivolta verso il muro più lontano dagli oggetti. Consentire l'esplorazione gratuita per 20 minuti. E misurare manualmente il tempo trascorso ad esplorare entrambi gli oggetti utilizzando due cronometri.Una volta che il mouse raggiunge il tempo minimo di esplorazione di 30 secondi per entrambi gli oggetti, interrompere la prima sessione di familiarizzazione e trasferire l'animale nella sua gabbia domestica. Per controbilanciare l'oggetto e il test di separazione del modello per metà degli animali posizionare la piastra del pavimento con l'ampia griglia e due oggetti identici, bottiglie di vetro per l'esperimento di controbilanciamento nella scatola a campo aperto. Quindi introdurre il mouse sperimentale nella scatola di campo aperto e consentire l'esplorazione gratuita per 20 minuti.Una volta che il mouse raggiunge il tempo minimo di esplorazione di 30 secondi per i due oggetti, interrompere la prima sessione di familiarizzazione e trasferire l'animale nella sua gabbia domestica. Il giorno successivo, trasferire il mouse nell'area di campo per la riabilitazione per tre minuti. E poi riportarlo nella sua gabbia di casa.Eseguire quindi la seconda sessione di familiarizzazione con due bottiglie di vetro sul pavimento stretto della griglia. Per gli esperimenti di controbilanciamento, eseguire la seconda sessione di familiarizzazione con due matasse a T riempite d'acqua su un pavimento stretto della griglia. Il giorno successivo eseguire la sessione di test di separazione del modello.Trasferire il mouse nell'area del campo aperto senza oggetto per la riabilitazione per tre minuti. E poi riportarlo nella sua gabbia di casa. Quindi, posizionare il pallone a T riempito con acqua e una bottiglia di vetro sul pavimento stretto della griglia.Fai i contenitori a T pieni d'acqua, in un nuovo oggetto. Per gli esperimenti di controbilanciamento, posizionare ogni oggetto sul pavimento stretto della griglia per rendere la bottiglia di vetro un nuovo oggetto in questo caso. Quindi per il mouse sperimentale nell'area di campo aperto per 10 minuti da esplorare.Concedi 10 minuti di esplorazione e registrazione gratuiti utilizzando un sistema di tracciamento video. Afferra la coda del topo sperimentale e trasferiscile nella sua gabbia di casa. Misura il tempo trascorso ad esplorare ogni oggetto usando due cronometri.E calcola il rapporto di discriminazione pari alla differenza di tempo trascorso tra l'oggetto nuovo e l'oggetto familiare diviso per il tempo totale di esplorazione dei due oggetti. Sei settimane dopo l'introduzione di convulsioni acute indotte da pilocarpina. I topi saranno sottoposti al nuovo test di posizione dell'oggetto.Test di riconoscimento di nuovi oggetti e test di separazione del modello. In tale ordinanza, separati da tre periodi di riposo diurno tra una prova e l'altro. È stato confermato che non c'era alcuna preferenza significativa tra i due oggetti presentati insieme.I topi epilettici hanno mostrato una significativa riduzione, del rapporto discriminazione nei tre test rispetto ai controlli Sham. Dimostrazione della compromissione della memoria spaziale. La misurazione dell'attività locomotoria ha mostrato un aumento significativo degli animali epilettici.Mentre la motivazione ad esplorare gli oggetti era paragonabile tra Sham e gli animali epilettici. Infine la morte delle cellule ippocampali è stata valutata dopo che una pilocarpina ha indotto lo stato epilettico usando la colorazione viola cristallo per confermare il danno neuronale indotto dalla crisi epilettica. Gli animali trattati con pilocarpina dimostravano di essere cellule pienotiche nel sottocampo ca3 e nell'ippocampo, a differenza dei controlli Sham.Il conteggio nel test NO e PS è fondamentale per ridurre la distorsione intrinseca possibile in questi oggetti specifici del dispositivo. Inoltre, i topi epilettici cronici aperti mostrano un'ansia accresciuta, che richiede più passaggi di assueazione per un numero sufficiente di consensi per gli ambienti sperimentali. modifiche del tempo come il numero o la posizione degli oggetti nel nostro protocollo possono fornire l'oggetto dei test di memoria.Che può essere utile per elaborare complessi meccanismi di epilessia associati al declino cognitivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare diversi aspetti della compromissione della memoria nell'epilessia.

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