Etichette e acquisizioni Dextran nelle cellule dei capelli Murine Cochlear dal vivo e funzionali

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di studiare l'assorbimento del dextran regolare etichettato fluorescentmente con Texas Red nelle cellule ciliate vive con canali meccanotraduzione funzionali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i tre kilodalton Texas Red dextran possono essere utilizzati per valutare la funzione del canale di meccanotrasduzione nelle cellule ciliate vive. Per raccogliere la coclea, posizionare il cranio di un topo postnatale di sei giorni in un piatto di coltura di 60 millimetri contenente il mezzo L-15 di Leibovitz e utilizzare forbici chirurgiche per fare un taglio superficiale dall'estremità anteriore all'estremità posteriore del cranio e attraverso i canali uditivi esterni.

Piegare la pelle verso il naso per esporre il cranio e fare un'incisione dalla parte posteriore alla parte anteriore del cranio e attraverso la linea degli occhi. Separare il cranio in due metà e usare una piccola spatola per rimuovere il cervello. Quando le ossa temporali possono essere osservate, utilizzare piccole forbici per tagliare intorno a queste ossa per asportare il tessuto.

Immergere le ossa temporali nel piatto da 35 millimetri contenente mezzo fresco L-15 e posizionare il piatto sotto un microscopio stereo dotato di un ampio oculare di campo e di una sorgente luminosa alogene a corrente alternata esterna. Utilizzare le forcelle per rimuovere il tessuto cocleare circostante, i canali semicircolari e gli organi vestibolari. Una volta che la coclea è stata sezionata e posta in un nuovo piatto con mezzi L-15 freschi, utilizzare pini chirurgici per fare una ferita da puntura sulla finestra rotonda e una foratura nella regione cocleare apicale.

Una volta raccolte tutte le cocle, posizionare il tessuto in un pozzo di una lastra di depressione in vetro a nove porri contenente 200 microlitri di mezzo L-15 fresco. Per l'etichettatura dextran dei tessuti isolati, sostituire bene il mezzo di ciascun campione con 200 microlitri di mezzo L-15 fresco integrato con due milligrammi per millilitro del dextran coniugato a fluorescenza di interesse. Incubare i campioni per due ore a temperatura ambiente e 25 rotazioni al minuto in uno shaker tridimensionale con un angolo inclinato di 25 gradi protetto dalla luce.

Alla fine dell'incubazione, lavare i tessuti una volta con mezzo e una volta con HBSS per due minuti per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, fissare i campioni in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a temperatura ambiente, seguiti da due lavaggi rapidi e delicati in HBSS. Dopo il secondo lavaggio, utilizzare le forcep a punta fine per rimuovere l'osso cocleare, il legamento a spirale e la membrana tectoriale e lavare l'organo isolato di Corti in HBSS.

Prestare particolare attenzione quando si rimuove la membrana tectoriale trasparente poiché il tessuto sulle cellule ciliate può essere facilmente danneggiato durante questo passaggio. Per etichettare l'F-actin, permeabilizzare i campioni in 0,5%Triton X-100 in PBS integrati con 100-200 diluizione di phalloidin etichettata fluorescentmente per 30 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare i tessuti da due a tre volte in HBSS fresco per lavaggio, come dimostrato da un singolo lavaggio in PBS.

Utilizzare un mezzo di montaggio appropriato per montare l'organo dei tessuti Corti su un microscopio in vetro che fa scivolare i lati stereocilia dei capelli verso l'alto e immagini i campioni su un microscopio confocale fluorescente utilizzando l'obiettivo di immersione dell'olio 63X. Dopo un'incubazione di due ore con tre kilodalton dextran coniugati fluorescentmente con Texas Red, l'organo di Corti espianta dal giorno postnatale di tipo selvaggio sei topi dimostrano un'etichettatura robusta e specifica delle cellule ciliate sia interne che esterne. L'imaging della stereocilia dei capelli e dei corpi cellulari rivela che solo quelle cellule che hanno incorporato tre kilodalton dextran Texas Red nel loro corpo cellulare hanno anche dimostrato l'etichettatura fluorescente della loro stereocilia.

È importante sottolineare che un segnale fluorescente uniforme si osserva lungo la stereocilia con arricchimento alle punte delle file stereocilia più corte in cui si trova il canale di meccanotraduzione. Si osservano anche strutture simili a vesciche nel corpo cellulare delle cellule ciliate e delle cellule di supporto vicine che suggeriscono che il dextran Texas Red può anche essere assunto dall'endocitosi. Il più grande dextrans da 10 kilodalton ha anche prodotto un modello simile a una vescicola nel corpo cellulare delle cellule ciliate e delle cellule di supporto.

In particolare, la presenza di un chelatore di calcio o di bloccanti del canale meccanotrasduzione impedisce l'etichettatura stereocilia e l'assorbimento di tre kilodalton dextran Texas Red nelle cellule ciliate. Il modello simile a una vescicola è ancora osservato in presenza di blocco del canale meccanotrasciduzione, tuttavia, indicando che questo modello di assorbimento è indipendente dai canali MET funzionali. È molto importante sezionare attentamente l'organo del tessuto Corti e confermare il corretto orientamento delle cellule ciliate prima di montare il tessuto per l'imaging.

Dopo l'etichettatura dextran delle cellule ciliate vive e funzionali, l'immunostaining del tessuto fisso può essere eseguito per identificare specifici tipi cellulari di proteine di interesse.