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Articolo metodologico
Abbiamo stabilito un modo efficiente per esaurire i batteri intestinali in tre giorni e successivamente trapiantare il microbiota fecale tramite sonda gastrica di liquido fecale preparato da contenuti intestinali freschi o congelati nei topi. Presentiamo anche un metodo ottimizzato per rilevare la frequenza dei batteri rivestiti di IgA nell'intestino.
Il microbiota intestinale esercita ruoli pleiotropici nella salute e nelle malattie umane. Il trapianto di microbiota fecale (FMT) è un metodo efficace per studiare la funzione biologica dei batteri intestinali nel loro insieme o a livello di specie. Sono stati pubblicati diversi metodi FMT. Qui, presentiamo un protocollo FMT che esaurisce con successo il microbiota intestinale in pochi giorni, seguito dal trapianto di microbiota fecale dal contenuto intestinale fresco o congelato di donatore a topi convenzionali. La PCR in tempo reale viene applicata per testare l'efficacia della deplezione batterica. Il sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S (rRNA) viene quindi applicato per testare l'abbondanza relativa e l'identità del microbiota intestinale nei topi riceventi. Presentiamo anche un metodo di rilevamento basato sulla citometria a flusso dei batteri rivestiti di immunoglobuline A (IgA) nell'intestino.
Un microbiota intestinale diversificato svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi dell'ospite. Questo microbioma aiuta in vari processi fisiologici che vanno dalla digestione e dall'assorbimento dei nutrienti dal cibo, alla difesa contro le infezioni da agenti patogeni, alla regolazione dello sviluppo del sistema immunitario e all'omeostasi immunitaria1. La perturbazione della composizione microbica intestinale è stata collegata a molte malattie, tra cui il cancro2, le malattie autoimmuni3, le malattie infiammatorie intestinali4<....
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Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le attuali normative etiche per la cura e l'uso degli animali in Cina.
NOTA: Gli animali sono stati alloggiati in un ambiente controllato privo di agenti patogeni specifici (SPF) con cicli di luce e buio di 12 ore a 25 °C. Il cibo veniva irradiato prima di essere somministrato ai topi. L'acqua potabile e le gabbie sono state sterilizzate in autoclave prima dell'uso. Nello studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di otto settimane dopo 1 settimana di acclimatazione. Sono stati divisi in diversi gruppi in base al disegno dell'esperi....
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Il programma FMT utilizzato in questo studio è delineato nella Figura 1. Dopo il trattamento con il cocktail di antibiotici, l'efficienza della deplezione del microbiota intestinale è stata analizzata sequenziando la regione 16S rRNA. Abbiamo rilevato 196 specie nell'ileo di topi naïve, mentre il trattamento antibiotico di 3 giorni ha ridotto rapidamente le specie batteriche a 35 (Figura 2A). Sono state rilevate otto specie solo nei topi sottoposti al trattament.......
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Gli antibiotici utilizzati nella procedura di deplezione hanno diverse proprietà antibatteriche. La vancomicina è specifica per i batteri gram-positivi30. La doxiciclina orale può indurre cambiamenti significativi nella composizione del microbiota intestinale nei topi femmina C57BL/6NCrl31. La neomicina è un antibiotico ad ampio spettro che prende di mira la maggior parte dei batteri residenti nell'intestino32. Tutta.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato svolto sotto il patrocinio dell'eccezionale progetto interdisciplinare del West China Hospital, dell'Università del Sichuan (Grant Nr: ZYJC18024) e della National Natural Science Foundation of China (Grant: 81770101 e 81973540).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ago per siringa da 5 ml | Sheng guang biotech | 5mL | |
| 70 &; filtro cellulare m | BD biosciences | 352350 | |
| Ampicillina sale sodico | AMERESCO | 0339 | |
| APC Streptavidina | BD biosciences | 554067 | |
| Biotina anti-topo IgA anticorpo | Biolegend | 407003 | |
| Siero bovino albiumin (BSA) | Sigma | B2064-50G | |
| C57BL/6J topi | Chengdu Dashuo | ||
| CO2 | Xiyuan biotech | ||
| E.Coil genoma DNA | TsingKe | ||
| Eppendorf tubi | Axygen | MCT150-C | |
| Sgabello DNA veloce mini Manuale | QIAGEN | 51604 | |
| Metronidazolo | Shyuanye | S17079-5g | |
| Neomicina solfato | SIGMA | N-1876 | |
| Ago per sonda orale | Yuke biotech | 10# | |
| pClone007 Kit vettoriale TA semplice versatile | TsingKe | 007VS | |
| Soluzione salina tampone fosfato (PBS) | Hyclone | SH30256 | |
| Kit di lisi Precellys | Precellys | KT03961-1-001.2 | |
| RT PCR SYBR MIX | Vazyme | Q411-01 | |
| SYTO BC verde Fluorescente Nucleic Acid Stain | Thermo fisher scientific | S34855 | |
| V338 F primer | TsingKe | ACTCCTACGGGAGGCAGCAG | |
| V806 R primer | TsingKe | GGACTACHVGGGTWTCTAAT | |
| Vancomicina cloridrato | Sigma | V2002 | |
| Equipments | |||
| BD FACSCalibur flow citometro | BD biosciences | ||
| Battitore di perline vortx | Scilogex | ||
| BIORAD CFX Connect | BIORAD | ||
| Centrifuga | Eppendorf | ||
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| Nanodrop macchina per la misurazione degli acidi nucleici | Thermo fisher scientific | ||
| Strumenti chirurgici | Yuke biotech | ||
| Software | |||
| Adobe Illustrator CC 2015 | Versione 2015 | ||
| BIORAD CFX qPCR SOFTWARE | |||
| FlowJo Software | |||
| Graphpad prism 7 | |||
| Database | |||
| Silva (SSU132) 16S |
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