Preparazione di pellet e plasma di cellule mononucleari periferici da un singolo estrapolazione di sangue presso siti di studio clinico per l'analisi dei biomarcatori

I campioni di PBMC e plasma sono semplici da acquisire e altamente informativi nei primi sviluppi clinici. Questo solido protocollo riduce al minimo la variabilità pre-analitica introdotta nei siti clinici. Questo protocollo è semplice e veloce, richiede attrezzature di laboratorio di base e una minima esperienza dell'operatore per elaborare il sangue in PBBC e plasma.

È compatibile con le giornate di laboratorio affollate negli ospedali. L'analisi a valle dei componenti del sangue risultante da questo protocollo può informare le relazioni farmacocinetiche e farmacodinamiche, la pianificazione della dose di farmaci e la prova del coinvolgimento del bersaglio e fornire informazioni sui meccanismi d'azione dei farmaci, supportando sia l'analisi in tempo reale che introspettiva. Utilizziamo questo protocollo per studi oncologici, in particolare per analizzare i meccanismi di risposta ai danni del DNA.

Tuttavia, i materiali raccolti da questo protocollo possono essere rilevanti in molte aree di malattia e molteplici modalità terapeutiche. Dopo aver ricevuto otto millilitri di sangue donatore per campione, registrare il momento in cui il sangue è stato prelevato e invertire delicatamente ogni tubo da otto a 10 volte prima di trasferire i campioni di sangue trattati anticoagulante in ciascuno dei tubi etichettati per le radiazioni. Per i campioni clinici, centrifugare i tubi subito dopo averli invertiti.

Posizionare i tubi grigi 0,2 in un armadio a raggi X prerifatti, chiudere la porta e applicare una dose grigia di 0,2 sui tubi. Sostituire i tubi irradiati a bassa dose con i sette tubi grigi e regolare la dose per applicare una dose di radiazioni grigie ai campioni di irradiazione ad alta dose. Dopo che entrambi i campioni sono stati irradiati, incubare tutti e tre i tubi a 37 gradi Celsius per un'ora.

Trasferire i campioni in tubi di preparazione cellulare prima di separare le celle con centrifugazione ad alta velocità, assicurandosi di impostare le unità come x g o RCF equivalente. Dopo la centrifugazione, guarda i tubi su uno sfondo scuro per identificare il plasma, i globuli rossi e gli strati del mantello buffy. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire circa la metà del plasma in una centrifuga conica etichettata da 15 millilitri senza disturbare lo strato di mantello buffy e conservare il tubo di plasma su ghiaccio bagnato.

Quindi, utilizzare una pipetta da pascolo per trasferire l'intero PBMC contenente strato di pelo buffy in un nuovo tubo da 15 millilitri e aggiungere PBS a temperatura ambiente al PBMC a un volume finale di 15 millilitri per campione. Mescolare delicatamente le cellule per inversione cinque volte e raccogliere le cellule per centrifugazione a una velocità inferiore, assicurandosi di controllare le unità di centrifugazione. Aspirate tutti tranne gli ultimi 500 microlitri di supernatante senza disturbare i pellet.

Aggiungere pbs fresco a un volume finale di 10 millilitri ad ogni tubo e rimorsindo invertendo delicatamente i tubi. Utilizzare 40 aliquote microliter delle celle per il conteggio. Dopo il conteggio, raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione e rimuovere il più possibile il supernatante senza disturbare il pellet.

Per conservare il PBMC per una successiva lavorazione, rimorsi i pellet in 50 microlitri di PBS fresco per campione con pipettazione delicata e trasferire ogni sospensione cellulare intera in un crioviale etichettato da 1,5 millilitri su ghiaccio umido. Quindi flash congelare le celle con il metodo preferito e posizionarle in una scatola di congelamento a meno 80 gradi. Registrare l'ora in cui le celle sono state congelate.

In alternativa, resospendare il pellet in un millilitro o miscela di congelamento per campione e trasferire le sospensioni cellulari su singoli criooviali etichettati. Quindi posizionare i tubi e le scatole di congelamento pre-refrigerate per meno 80 gradi Celsius. Per congelare il plasma, aggiungere fino a un millilitro aliquote lotti di plasma fino a ciascuno dei cinque microtubi di due millilitri senza disturbare il pellet residuo e registrare il volume totale di plasma in ogni tubo.

Quindi, congelare immediatamente le aliquote del plasma con un orientamento verticale in un congelatore meno 80 gradi Celsius. Per l'analisi western dei campioni, resuspend il pellet in ogni tubo con un volume appropriato di tampone di lisi integrato con inibitori della proteasi e della fosfatasi pari a quello del volume del pellet cellulare con pipettazione delicata e incubare i campioni cellulari per 10 minuti sul ghiaccio. Alla fine dell'incubazione, trasferire i campioni in tubi da 1,5 millilitri e sonicarli con tre secondi e 30 secondi fuori cicli a quattro gradi Celsius.

Raccogliere i campioni per centrifugazione e trasferire i supernatanti in nuovi tubi da 1,5 millilitri. Quindi, mescolare 40 microgrammi per campione con il buffer di carico e far bollire i campioni per cinque minuti. Caricare 20 microgrammi di ogni campione per corsia in duplicato in un gel proteico 4-12%Bis-Tris ed eseguire un SDS-PAGE.

Il numero di cellule ottenute da otto millilitri di sangue varia a seconda del paziente e dell'impostazione della malattia. In generale, il pellet di cellule è di piccole dimensioni e di colore bianco trasparente. A volte i pellet possono avere una contaminazione dei globuli rossi, che ha un effetto negativo sulla qualità della preparazione.

Una resa tipica di un paziente cronico di leucemia linfocitica che utilizza questo protocollo varia da 1,62 per 10 alla quarta a 1,99 volte 10 alla nona cellula per otto millilitri di preparazione di cellule mononucleari con una concentrazione finale di proteine compresa tra 1,62 e 19,77 milligrammi per millilitro. In questa analisi rappresentativa di tre campioni di pazienti, è stato osservato un aumento delle modifiche post-tras traslazione a dosi più elevate di radiazioni ionizzanti. È interessante notare che la fosforilazione dell'atassia-telangiectasia mutata e RAD50 era sostanziale alla bassa dose di 0,2 grigi, il che suggerisce che queste modifiche post-traslazionali possono essere interrogate come biomarcatori farmacodinamici per trattamenti che coinvolgono la generazione di rotture a doppio filamento del DNA con un buon intervallo dinamico nel tumore, così come campioni di sangue periferici.

Per una preparazione ottimale del campione, elaborare il sangue entro un'ora dalla raccolta a temperatura ambiente, centrifugare correttamente i campioni e visualizzare il tubo sullo sfondo scuro per poter distinguere il mantello buffy.