Name: Fare il passo successivo: un modello di trapianto di arto hind di coaptation neurale per massimizzare il recupero funzionale nel ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Impara un modello di trapianto ortotopico dell'arto posteriore nel ratto per studiare immunologia e recupero funzionale. Questa tecnica microchirurgica consente anastomosi vascolari e coaptazione neurale con risultati riproducibili.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Frankel Foundation e dal Northwestern Memorial Hospital McCormick Grant (Operazione RESTORE). La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto Nazionale di Scienze Mediciche Generali degli Istituti Nazionali di Salute sotto il numero di premio T32GM008152. Questo lavoro è stato sostenuto dal Northwestern University Microsurgery Core and Behavioral Phenotyping Core.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dei National Institutes of Health (NIH) e sono stati approvati dal Northwestern University Animal Care and Use Committee. Le procedure specifiche sono state eseguite con il protocollo IS00001663.
NOTA: Sono stati utilizzati due ceppi di ratti, i ratti Lewis e i ratti August Copenhagen x Irish (ACI). Gli animali sono stati divisi in tre gruppi di trattamento: allotransplant senza soppressione immunitaria (ACI a Lewis), allotransplant con soppressione immunitaria convenzionale (ACI a Lewis), e isotransplant (da Lewis a Lewis o da ACI ad ACI). Lewis è un ceppo inbred, mentre i ratti ACI rappresentano un tipo selvaggio out-bred, quindi questa combinazione è stata scelta per modellare la risposta di rifiuto peggiore. L'immunosoppressione convenzionale è stata somministrata sottocutaneamente come rapacina 1 mg/kg dal giorno post-operatorio (POD) meno 1 al POD 28 o come FK506 3 mg/kg dal POD 0 al POD 14, e poi una volta ogni settimana in seguito. Sia i ratti maschi che femmine erano beneficiari idonei da 8 a 16 settimane di età, del peso compreso tra 250 e 400 grammi al momento dell'intervento chirurgico.
1. Raccolta degli arti posteriori posteriori destro del donatore
<ol><li>Indurre l'anestesia generale con 5% isoflurane in ossigeno puro attraverso un vaporizzatore con un adeguato sistema di scavenging.</li>
	<li>Confermare un'adeguata profondità di anestesia con pizzico di dita dei piedi, quindi utilizzare tagliacapo per tagliare la pelliccia fuori dell'arto posteriore destro e del sito chirurgico all'inguine destro</li>
	<li>Down-titrate l'isoflurane attraverso un cono naso roditore al 2-2,5%.</li>
	<li>Posizionare il ratto supina con gli arti spalmati spinati ai lati su una scheda operativa con un pad di riscaldamento sotto. Disinfettare la pelle senza peli con il 70% di sfregamento dell'alcol e proteggere il campo chirurgico con garza sterile.</li>
	<li>Utilizzando un microscopio microchirurgico appropriato, strumenti microchirurgici, e con un facile accesso all'elettrocauterino bipolare e monopolare, iniziare la dissezione.</li>
	<li>Utilizzare le forbici per fare un'incisione circonferente della pelle / tessuto sottocutaneo intorno all'hindlimb destro. Iniziare nella piega inguinale medialmente allo stesso livello del legamento inguinale ed estendere dorsal-lateralmente per completare l'incisione circonferente.</li>
	<li>Avendo esposto lo strato muscolare direttamente sotto l'incisione, sezionare e cauterizzare i vasi epigastrici superficiali che conducono dallo strato muscolare alla pelle prossimale / lembo sottocutaneo appena creato.</li>
	<li>Riflettere il lembo prossimale superomedialmente al legamento inguinale e la pelle distale / lembo sottocutaneo inferolateramente al ginocchio.</li>
	<li>Utilizzare un retrattore di filo o una garza laminata per esporre il campo.</li>
	<li>Osservare che l'anatomia inguinale del ratto è simile agli esseri umani; dal laterale al mediale si trovano il nervo, l'arteria e la vena.</li>
	<li>Dizionare il nervo femorale, dividerlo bruscamente al legamento inguinale, prossima alla biforcazione, se possibile. Ritrarre il nervo diviso in modo inferiore, tenendolo al sicuro fuori strada, coperto sotto garza umida.</li>
	<li>Rivolgendo l'attenzione all'arteria femorale e alla vena, utilizzare le cravatte di seta 4 cm 7-0 per ritrarre atraumaticamente i vasi invece di maneggiarli direttamente.</li>
	<li>Ligate tutti i rami dei vasi femorali come si presentano con 7-0 cravatte di seta; dividere i rami tra i legami. Per rami molto piccoli, cautery bipolare può essere utilizzato al posto di cravatte. NOTA: I rami arterioso e venoso che richiedono la divisione includono il iliaco circonflesso superficiale e i vasi muscolari. Il iliaco circonflesso superficiale è di solito più grande e sembra immergersi in profondità come farebbe il profunda femorale negli esseri umani, ma la profunda è assente nelratto 15. Più rami distali dei vasi femorali come il più alto genicolare e il ramo saphenous di solito non richiedono divisione.</li>
	<li>Iniettare sistemicamente 500 unità internazionali di epatina attraverso la vena del pene in un donatore di ratti maschi. Utilizzare la vena epigastrica superficiale se il ratto donatore è femmina.</li>
	<li>Lasciare che l'epaina circondi sistemicamente per 2 minuti prima di procedere con i passaggi successivi.</li>
	<li>Ligate l'arteria femorale con 7-0 cravatte di seta il più prossimale possibile al legamento inguinale e dividere tra le cravatte.</li>
	<li>Simile all'arteria, ligate e dividere la vena femorale.</li>
	<li>Riflettere sia l'arteria che la vena in modo inferiore, in modo sicuro fuori strada, coperto sotto una garza umida insieme al nervo femorale coperto in precedenza. Dissezionare i gruppi muscolari ventrali, facendo attenzione a cauterizzare qualsiasi vaso visibile che sorge. Attenzione all'emostasi qui ridurrà al minimo la perdita di sangue del destinatario dopo la reperfusione.</li>
	<li>Profondo ai gruppi muscolari ventrali, identificare e dividere bruscamente il nervo sciatico prossimale ai suoi rami. Tre rami sciatici sono solitamente visibili: tibiale, peroneale e sural. Tutti e tre dovrebbero essere tutti conservati nell'arto del donatore. Un quarto ramo cutaneo non è in genere visto in questa dissezione15,16.</li>
	<li>Finisci di dividere i restanti gruppi muscolari ventrali e dorsali a livello di coscia media con emostasi meticolosa. Potrebbe essere necessario ritrarre l'arto medialmente per completare la divisione dei muscoli.</li>
	<li>Transect l'osso femore a metà albero utilizzando una sega rotante cordless portatile.</li>
	<li>Dopo aver rimosso l'innesto dell'arto dal donatore, tagliare le estremità legate alla seta dall'arteria femorale laterale dell'innesto e dai ceppi di vena, riasendo così i vasi.</li>
	<li>Inserire un angiocatetro a 24 calibro nel moncone dell'arteria dell'innesto e lavare l'innesto con 250 unità internazionali di epatina diluita in 5 mL di salina normale ghiacciata, guardandola fluire attraverso la vena aperta.</li>
	<li>Lentamente, lavare delicatamente l'innesto per circa 3 minuti. L'eccesso di lavaggio forte può danneggiare l'endotelio.</li>
	<li>Mettere l'innesto in un piatto salino refrigerato nidificato in un secchio di ghiaccio fino al trapianto.</li>
	<li>Eutanasia del ratto donatore con toractomia bilaterale.</li>
	<li>Pulire tutti gli strumenti chirurgici in modo appropriato.</li>
</ol>2. Amputazione dell'arto posteriore destro nativo del destinatario
<ol><li>Indurre l'anestesia con isoflurane al 5%, confermare la profondità, tagliare la pelliccia, posizionare l'animale e disinfettare la pelle con l'alcol come descritto per il ratto donatore.</li>
	<li>Isoflurane down-titrate al 2-2,5% e iniettare analgesia preoperatoria sottocutanea con buprenorfina 1,2 mg/kg e profilassi preoperatoria con enrofloxacina 7,5 mg/kg.</li>
	<li>Come per il donatore, fare un'incisione circonferale nella piega inguinale, riflettere i lembi della pelle assicurando l'emostasi e sezionare il nervo femorale, l'arteria e la vena, legando gli stessi vasi di ramo come sopra.</li>
	<li>Dividere il nervo femorale più distally che per il donatore, ma proximally alla biforcazione, se possibile.</li>
	<li>Dissezionare l'arteria femorale e la vena con spazio sufficiente per bloccare ciascuno separatamente a livello del legamento inguinale. Bloccare la vena e l'arteria con morsetti bulldog microchirurgici. Una volta bloccato, dividere ogni recipiente bruscamente con le forbici.</li>
	<li>Dividere i muscoli ventrale e dorsali della coscia a livello di metà coscia con emostasi meticolosa, ritraendo l'arto medialmente secondo le esigenze.</li>
	<li>Identificare e dividere i nervi sciatici prossimali ai loro punti di diramazione come sopra.</li>
	<li>Transect il femore a metà albero utilizzando la sega.</li>
	<li>Rimuovere l'arto posteriore destro nativo del destinatario e smaltire in modo appropriato.</li>
	<li>Down-titrate l'isoflurane a 1-1,5% attraverso il cono naso.</li>
</ol>3. Impianto dell'arto da donatore a ricevente
<ol><li>Utilizzando la sega elettrica portatile, radere via eventuali irregolarità sia dal donatore che dal femore ricevente.</li>
	<li>Utilizzando la sega, tagliare l'estremità del mozzo di un ago a 18 calibro, che diventerà l'asta intramedullaria del femore.</li>
	<li>Prima di manipolare l'osso, applicare una piccola quantità di cera ossea all'estremità del femore per ridurre il sanguinamento del midollo durante il processo di reaming.</li>
	<li>Coapt le ossa femorali del donatore e del ricevente usando l'ago a 18 calibro come canna intramedullaria. Una certa forza è necessaria, ma non risme o ossa fino a fratturare la corteccia.</li>
	<li>Se necessario, rimuovere l'ago e tagliarlo ad una lunghezza appropriata in modo che entrambe le ossa si adattino senza problemi sopra l'ago senza ago che mostra tra l'osso.</li>
	<li>Posizionare un piccolo supporto come un cuscinetto di garza o una piccola roccia o modellare l'argilla sotto l'arto del donatore per tenerlo lontano dalla tensione.</li>
	<li>Reapproximate i gruppi muscolari ventrali con otto a dieci semplici suture di poliglactina interrotte 5-0 in modo che l'innesto non ruoti intorno all'ago del femore. Questo dà la stabilità dell'arto per gli anastomoses.</li>
	<li>Irrigare periodicamente l'innesto e il campo chirurgico con salina ghiacciata per una migliore visualizzazione e per ridurre le lesioni da reperfusione ischemica calda.</li>
	<li>Allineare le arterie femorali del donatore e del ricevente e anastomose in modo end-to-end utilizzando una semplice sutura di nylon interrotta 10-0, evitando sia la tensione che il looping. L'arteria richiede una media di sei suture.</li>
	<li>Simile all'arteria, anastomose il donatore e le vene femorali riceventi in modo end-to-end. La vena richiede da sei a otto suture. NOTA: La generosa irrigazione salina fredda, la tecnica di movimentazione delle navi atraumatiche e la data di lunga durata per servire come suture di soggiorno per la retrazione della nave sono strumenti importanti per anastomose microchirurgiche efficaci.</li>
	<li>Mettere una piccola quantità di polvere di cellulosa emostatica intorno a entrambi gli anastomosi, quindi rimuovere i morsetti bulldog microchirurgici prossimali sulla vena e l'arteria.</li>
	<li>Ispezionare entrambi gli anastomosi per una buona paenza e flusso. Utilizzare bastoncini di cotone per spingere delicatamente la vena e assicurare una buona emostasi di entrambi gli anastomi. Tenere pressione sui siti di sanguinamento e posizionare più polvere di cellulosa emostatica se necessario. Un'altra sutura può essere posizionata attraverso un foro di sanguinamento a rischio di "back-walling" l'ago solo come ultima risorsa.</li>
	<li>Quando entrambi gli anastomos sono confermati in modo soddisfacente, tagliare tutte le code di sutura di soggiorno lungo rimanenti per abbinare le altre.</li>
	<li>Riposizionare il ratto nella posizione di decubito laterale sinistro, utilizzare l'elettrocautery liberale per raggiungere l'emostasi meticolosa di qualsiasi sanguinamento muscolare di reperfusione.</li>
	<li>Rivolgere l'attenzione agli anastomosi nervosi una volta che l'emostasi muscolare è assicurata. Tagliare indietro tutte le estremità di taglio del nervo che appaiono cencioso.</li>
	<li>Reapproximate i gruppi muscolari dorsali sotto nervo sciatico con semplici suture poliglactin interrotte 5-0.</li>
	<li>Reapproximate il nervo sciatico. Otto a dieci 10-0 nylon neurale semplici suture interrotte di solito sarà sufficiente.</li>
	<li>Riapprequiare i gruppi muscolari dorsali e quindi chiudere la pelle dorsale con 4-0 poliglactin sutura continua.</li>
	<li>Riposizionare il ratto in posizione supina e riavvicinare il nervo femorale. Due o tre 10-0 nylon neurale semplici suture interrotte di solito sarà sufficiente.</li>
	<li>Chiudere la pelle ventrale con 4-0 poliglactin sutura continua. Evitare la coda di sutura in eccesso, che può essere irritante per il ratto una volta sveglio.</li>
</ol>4. Assistenza post-operatoria
<ol><li>Recuperare gli animali nelle loro gabbie con una pastiglie di riscaldamento sotto la gabbia e pronto l'accesso al cibo e all'acqua, monitorando le prime complicazioni ogni giorno per la prima settimana.</li>
	<li>Fornire analgesia post-operatoria con iniezione giornaliera di meloxicam sottocutanea 1 mg/kg attraverso POD 2. Fornire la profilassi antibiotica post-operatoria diluire spray enrofloxacin. Fornire disincentivo per l'autotomia (automutilazione) con Bitter Safe Mist spruzzato due volte al giorno per l'innesto attraverso POD 7.</li>
	<li>Mantenere i ratti trapiantati in gabbie con altri ratti, per stimolare il ritorno alle attività quotidiane e riabilitare l'arto trapiantato.</li>
</ol>5. Test di sensazione post-operatoria
<ol><li>Applicare il test Hargreaves del protocollo di sensazione termica, descritto anche altrove17,18.</li>
	<li>Mettere il ratto nel contenitore di prova e permetterlo di acclimatarsi per 20 minuti. Il vetro dell'apparato è confermato pulito, e la fonte di calore ha confermato di lavorare con il dito dell'investigatore.</li>
	<li>Prima del test, verificare che il ratto sia sveglio e che la zampa testata sia posizionata sopra il rilevatore di movimento infrarosso.</li>
	<li>Trasmettere energia termica al livello di intensità 90. Viene registrato un ritardo di tempo nell'animale che sposta la zampa lontano dalla fonte di calore. Se non si verifica alcun movimento entro 20 secondi, il test viene interrotto per evitare lesioni.</li>
	<li>Ottenere cinque prove per ogni arto testato, escludendo il valore più alto e più basso prima di calcolare il tempo medio di latenza di ritiro per ogni animale.</li>
</ol>6. Test del motore post-operatorio
<ol><li>Utilizzando un tapis roulant per l'analisi dell'andatura e una piattaforma di analisi software integrata, selezionare i candidati per il test del tapis roulant a quattro o sei settimane dopo la chirurgia.</li>
	<li>Tagliare tutte le unghie dei topi uno o due giorni prima del test.</li>
	<li>Acclimatare gli animali nella sala prove per un'ora prima del test e consentire un minuto di pre-test petting per calmare l'ansia.</li>
	<li>Posizionando il topo all'interno del tapis roulant, eseguire il tapis roulant a prova di velocità crescente, da 10 cm/ s, a 14 cm/s, fino all'obiettivo 18 cm/s. Se il ratto è reticente e non può essere persuo a camminare, interrompere il test quel giorno per evitare il condizionamento negativo. Consentire agli esecutori alti di camminare fino a 24 cm/s.</li>
	<li>Sciacquare l'apparato del tapis roulant con il 70% di etanolo tra gli animali testati.</li>
	<li>I parametri di andatura sono e-out dal software proprietario della piattaforma di analisi.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il trapianto di arti, nella categoria più ampia di allotrapianto di componenti vascolarizzati (VCA), ha una promessa terapeutica ampiamente applicabile non ancora mantenuta. I principali ostacoli si trovano in questioni immunologiche irrisolte uniche per VCA e tecniche di recupero neuromotorio attualmente utilizzate. Lo sviluppo di nuove tecniche dipenderà dalla modellazione animale flessibile, robusta e riproducibile.
Molti modelli animali sono stati stabiliti in VCA, ciascuno con vantaggi sp...

Il trapianto di arti nell'ambito della più ampia categoria di allotransplant vasculare-composito (VCA) o allotransplant di tessuto composito (CTA) deve ancora soddisfare la sua promessa terapeutica. Dopo i primi trapianti di mano umana di successo a Lione, Francia e Louisville, Kentucky nel 1998 e 1999, oltre 100 trapianti di estremità superiore sono stati eseguiti in tutto il mondo in pazientiaccuratamente selezionati 1. L'applicabilità più ampia è stata ostacolata da una sostanziale immunosoppressione e da un limitato recupero di neuromotori funzionali. Le attuali strategie di immunosoppressione si traspongono all'85% di incidenza di rigetto acuto a fronte di un'incidenza del 77% dell'infezioneopportunistica 2. D'altra parte, si verifica il recupero funzionale dopo il trapianto di mano; Media Disabilità di spalla e mano (DASH) punteggi migliorano da 71 a 43, ma quel livello di funzione può ancora qualificarsi come una disabilità2. Data la natura non salvavita del trapianto di arti, le attuali tecniche devono essere perfezionate nei modelli animali per fare il passo successivo in VCA.
Dal primo modello di ratto del trapianto di arti nel 19783,sono stati sviluppati molti modelli animali innovativi per far progredire il campo di VCA4, incorporando anastomose con manette vascolari per ridurre al minimo il tempooperativo 5,6, ha trapianti osteomiocutanei per ridurre al minimo l'insulto fisiologico all'animale ricevente7,8,9,10,11e nuovi approcci immunologici7,12,13,14. Il modello ratto del trapianto di arto posteriore destro ortotopico qui presentato qui sottolinea tecniche microchirurgiche meticolose e collaudate nel tempo come gli anastomi vascolari cuciti a mano e la coaptation neurale come investimento iniziale in una piattaforma modello robusta e riproducibile per studiare simultaneamente entrambi gli aspetti dell'attuale limitazione VCA: strategie di immunosoppressione e recupero neuromotore funzionale.

<table><tbody><tr><td>Macchina per anestesia</td><td>Vet Equip</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 0,5 cc</td><td>Exel</td><td>26018</td><td></td></tr><tr><td>Ago calibro 18</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 cc</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Ago calibro 22</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatheter calibro 24</td><td>Sur-Vet</td><td>SROX2419V</td><td></td></tr><tr><td>25- ago di misura</td><td>Exel</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 3 cc</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 5 cc</td><td>Exel</td><td>26230</td><td></td></tr><tr><td>Alcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-600-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Camera di induzione per anestesia</td><td>Vet Equip</td><td>941443</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di evacuazione dei gas anestetici</td><td>Vet Equip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Bipolare elettrocauterizzazione</td><td>Aura</td><td>26-500</td><td></td></tr><tr><td>Nebbia spray amara</td><td>Henry Schein</td><td>5553</td><td></td></tr><tr><td>Cera ossea</td><td>CP Medical</td><td>CPB31A</td><td></td></tr><tr><td>Circuito respiratorio</td><td>Vet Equip</td><td>921413</td><td></td></tr><tr><td>Buprenophine</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496075705</td><td></td></tr><tr><td>Castro-Viejos trascinatori ad ago</td><td>Roboz</td><td>RS-6416</td><td></td></tr><tr><td>Sega rotante a batteria</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncino di cotone</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>Per emostasi</td></tr><tr><td>DigiGait Appparatus e Software</td><td>Specifiche del mouse</td><td>MSI-DIG, DIG-SOFT</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Dumont (#4)</td><td>Roboz</td><td>RS-4972</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Dumont (#5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Norbrook</td><td>ANADA 200-495</td><td></td></tr><tr><td>FK-506</td><td>Astellas</td><td>301601</td><td></td></tr><tr><td>Garza</td><td>Kendall</td><td>1903</td><td></td></tr><tr><td>Garza</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td></td></tr><tr><td>Guanti</td><td>Microflex</td><td>DGP-350-M</td><td></td></tr><tr><td>Tagliacapelli</td><td>Oster</td><td>078005-010-003</td><td></td></tr><tr><td>Elettrocauterizzazione monopolare portatile</td><td>Bovie</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>Hargreaves Apparecchio</td><td>Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italia</td><td>37370</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Walgreens</td><td>126987</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Fresenius Kabi</td><td>42592K</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Corning</td><td>PC-351</td><td>Per il riscaldamento del fluido di risuscitazione</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Suonelli lattati</td><td>Baxter</td><td>2B2074</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri grande</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Per innesto di donatore in soluzione salina refrigerata</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Henry Schein</td><td>49755</td><td></td></tr><tr><td>divaricatore</td><td></td><td></td><td></td>micro Collin Hartmann</tr><tr><td>Forbici da micro dissezione</td><td>Roboz</td><td>RS-5841</td><td></td></tr><tr><td>Polvere di collagene microfibrillare</td><td>BD</td><td>1010590</td><td>Per l'emostasi</td></tr><tr><td>Clip microvascolari</td><td>Roboz</td><td>RS-5420</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina normale</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante oftalmico</td><td>Dechra</td><td>IS4398</td><td></td></tr><tr><td>Rapmicina</td><td>MedChem Express</td><td>HY-10219</td><td></td></tr><tr><td>Piccola capsula di Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>Per liquido</td></tr> <tr><td>di risuscitazione riscaldatoTeli sterili</td><td>ProAdvantage</td><td>N207100</td><td></td></tr><tr><td>Camice chirurgico</td><td>Cardinal Health</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>Mascherina chirurgica</td><td>3M</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio, modello ottico OPMIMD</td><td>Zeiss</td><td>169756</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio, Universal S3</td><td>Zeiss</td><td>243188</td><td></td></tr><tr><td>Suture 10-0 nylon</td><td>Covidien</td><td>N2512</td><td></td></tr><tr><td>Sutura 5-0 vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J213H</td><td></td></tr><tr><td>Sutura 7-0 cravatta di seta</td><td>Teleflex</td><td>103-S</td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore per strumenti ad ultrasuoni</td><td>Roboz</td><td>RS-9911</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per dilatazione dei vasi</td><td>Roboz</td><td>RS-5047</td><td></td></tr></tbody></table>

fare il passo successivo: un modello di trapianto di arto hind di coaptation neurale per massimizzare il recupero funzionale nel ratto

Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat

Il trapianto di arti in particolare e l'allotrapianto composito vascolarizzato (VCA) in generale hanno un'ampia promessa terapeutica che sono state ostacolate dalle attuali limitazioni dell'immunosoppressione e del recupero funzionale del neuromotore. Molti modelli animali sono stati sviluppati per studiare caratteristiche uniche della VCA, ma qui presentiamo un robusto modello riproducibile di trapianto ortotopico degli arti posteriori nei ratti progettati per studiare simultaneamente entrambi gli aspetti dell'attuale limitazione VCA: strategie di immunosoppressione e recupero neuromotore funzionale. Al centro del modello riposa un impegno per meticolose tecniche microchirurgiche testate nel tempo come anastomose vascolari cucite a mano e coaptation neurale cucite a mano del nervo femorale e del nervo sciatico. Questo approccio produce ricostruzioni durevoli degli arti che consentono animali più longevi in grado di riabilitazione, ripresa delle attività quotidiane e test funzionali. Con il trattamento a breve termine di agenti immunosoppressivi convenzionali, gli animali allotrapiantati sono sopravvissuti fino a 70 giorni dopo il trapianto e gli animali isotrapiantati forniscono controlli di lunga durata oltre i 200 giorni post-operatori. La prova del recupero funzionale neurologico è presente entro 30 giorni dopo l'intervento operativo. Questo modello non solo fornisce una piattaforma utile per interrogare questioni immunologiche uniche per la VCA e la rigenerazione dei nervi, ma consente anche di testare in vivo nuove strategie terapeutiche specificamente su misura per VCA.

La sopravvivenza e il recupero dipendono da una tecnica chirurgica meticolosa. L'attenzione agli anastomosi vascolari e agli anastomosi neurali, così come la coaptation ossea come descritto sopra è fondamentale massimizzare il successo di questo modello. Nella Figura 1 sono illustrati i risultati di progettazione operativa e di analisi rappresentativa.
La mortalità complessiva dipendeva dalla strategia di immunosoppressione, con la maggior parte degli animali isot...

Questo protocollo presenta un modello robusto e riproducibile di allotransplant composito vascolarizzato (VCA) orientato allo studio simultaneo dell'immunologia e del recupero funzionale. Il tempo investito in una tecnica meticolosa in un trapianto ortotopico dell'arto posteriore della coscia destra con anastomose vascolari cucite a mano e coaptation neurale produce la capacità di studiare il recupero funzionale.

Fare il passo successivo: un modello di trapianto di arto hind di coaptation neurale per massimizzare il recupero funzionale nel ratto

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current ...

Questo video fornirà una descrizione dettagliata, come eseguire un arto posteriore destro ortotopico, ratto trapiantato della coscia media. L'arto posteriore destro del ratto donatore viene amputato a livello della coscia media, quindi conservato sul ghiaccio. Anche l'arto posteriore destro del ratto ricevente viene amputato a livello della coscia media.L'arto del ratto donatore viene quindi attaccato al ratto ricevente. Descriveremo come riattaccare i sistemi osseo, arteria, vena, nervosa, muscolare e cutanea. Il trapianto di arti, più specificamente, l'allotrapianto composito vascolarizzato, VCA, ha un'ampia promessa terapeutica.Ma attualmente è limitato da tecniche, immunosoppressione e scarso recupero neuromotorio funzionale. Il nostro modello enfatizza meticolose tecniche microchirurgiche collaudate nel tempo, come l'anastomosi vascolare cucita a mano e la coaattamento neurale. Abbiamo eseguito più di 200 di questi interventi in più di un anno.Sebbene ci sia una curva di apprendimento iniziale al microchirurgo iniziale, usando questo video per imparare il nostro metodo e il loro impegno nella pratica dedicata, qualsiasi microchirurgo sarà in grado di padroneggiare questo modello. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health, NIH, e sono stati approvati dal Northwestern University Animal Care and Use Committee. Le procedure specifiche sono state eseguite su un protocollo IS 00001663.Selezionare un topo di età compresa tra 8 e 16 settimane di peso compreso tra 250 e 400 grammi al momento dell'intervento chirurgico. Indurre l'anestesia generale con il 5% di isoflurane attraverso un vaporizzatore prima di tagliare la pelliccia dell'arto posteriore del ratto. Utilizzando un cono del naso per mantenere l'anestesia tra il due e il 2,5% posizionare il topo sulla scheda operativa con un riscaldatore sotto.Disinfettare la pelle senza peli con alcool sfregamento al 70% e proteggere il campo chirurgico con garza sterile. Utilizzando un microscopio microchirurgico appropriato e gli strumenti microchirurgici qui mostrati, insieme all'elettrocauteria bipolare e monopolare di facile accesso, sarai pronto per iniziare la dissezione. Usa le forbici per fare un'incisione circonferenziale e cutanea intorno all'arto posteriore destro.Iniziare immediatamente nella piega inguinale all'incirca allo stesso livello del legamento inguinale ed estendere dorsalmente lateralmente per completare l'incisione circonferenziale. E poi esporre lo strato muscolare direttamente sotto l'incisione, sezionare e cauterizzare i vasi epigastrici superficiali, che portano dallo strato muscolare al lembo prossimale della pelle appena creato. Riflettere il lembo prossimale superomedialmente al legamento inguinale e il lembo della pelle distale inferolatermente al ginocchio.Utilizzare un riavvolgitore a filo o una garza arrotolata per esporre il campo. Osservato che l'anatomia inguinale del ratto è simile all'uomo;dal laterale al mediale si trovano il nervo, l'arteria e la vena. Sezionare il nervo femorale, dividerlo bruscamente al legamento inguinale prossimale alla biforcazione, se possibile.Ritrai il nervo diviso in modo inferiore, tenendolo al sicuro fuori strada, coperto sotto una garza umida. Rivolgendo l'attenzione all'arteria femorale e alla vena utilizzare cravatte di seta lunghe quattro centimetri 7-0 per ritrarre atraummaticamente i vasi invece di maneggiarli direttamente. Prestare molta attenzione ora migliorerà il risultato anastomotico finale.Ligate tutti i rami dei vasi femorali con cravatte di seta 7-0. Dividi i rami tra i legami. I rami arteriosi e venosi che richiedono divisione includono l'iliaco circonflesso superficiale e i vasi muscolari.L'iliac circonflesso superficiale è solitamente più grande e sembra immergersi in profondità come farebbe il femorale profunda negli esseri umani, ma il profunda è assente nel ratto. Rami più distale dei vasi femorali, come il genicolare più alto e il ramo safenoso di solito non richiedono divisione. Ora ligate l'arteria femorale con 7-0 cravatte di seta il più prossimali possibile al legamento inguinale e dividere tra i legami.Simile all'arteria, ligate e dividere la vena femorale. Riflettere sia l'arteria che la vena in modo inferiore, in modo sicuro fuori strada, coperto sotto una garza umida insieme al nervo femorale coperto in precedenza. Sezionare i gruppi muscolari ventrali, facendo attenzione a cauterizzare qualsiasi vaso visibile che si presenta.L'attenzione all'emostasi ora ridurrà al minimo la perdita di sangue del ricevente durante la riprofusione in seguito. In profondità ai gruppi muscolari ventrali, identificare e dividere bruscamente il nervo sciatico prossimale ai suoi rami. Tutti e tre i rami sciatici sono solitamente visibili, tibiali, peroneali e surali.Tutti e tre dovrebbero essere conservati nell'arto del donatore. Un quarto ramo cutaneo non è tipicamente visto in questa dissezione. Termina di dividere i restanti gruppi muscolari ventrali e dorsali a livello della coscia media con un'emostasi meticolosa.Potrebbe essere necessario ritrarre l'arto medialmente per completare la divisione dei muscoli. Traseliare l'osso del femore a medio albero utilizzando una sega rotante cordless portatile. L'arto è ora libero dal donatore.Dopo aver rimosso l'innesto degli arti dal donatore, tagliare le estremità legate alla seta dall'arteria femorale laterale dell'innesto e dai ceppi delle vene, riafaperturando così i vasi. Inserire un angiocatetere calibro 24 nel ceppo dell'arteria di innesto e lavare l'innesto con 250 unità internazionali di eparina diluite in 5 millilitri di soluzione salina normale ghiacciata, facendo attenzione a vederlo scorrere fuori dalla vena aperta. Lentamente, sciacquare delicatamente l'innesto per circa tre minuti.L'eccesso di lavaggio forzato può danneggiare l'endotelio. Posizionare l'innesto in un piatto salino refrigerato annidato in un secchio di ghiaccio fino al trapianto. Eutanasia del ratto donatore con toracotomia bilaterale.L'intervento chirurgico al ricevente inizia in modo simile alla chirurgia del donatore, anestetizzando il topo, tagliando la pelliccia, facendo un'incisione circonferenziale nella piega inguinale, riflettendo i lembi della pelle, sezionando il nervo femorale, l'arteria e la vena. E legare gli stessi vasi di ramo descritti in precedenza. Tuttavia, durante questa operazione, dividere il nervo femorale più distally che per il donatore, ma prossimamente alla biforcazione, se possibile.Dividere e liberare l'arteria e la vena femorale e bloccarle prossimalmente rispettivamente a livello del legamento inguinale con morsetti bulldog microchirurgici. Continuare l'intervento come descritto in precedenza, dividendo i muscoli avallanti ventrali della coscia a livello della coscia media con un'emostasi meticolosa, mentre si ritrae l'arto medialmente se necessario. Identificare e dividere il nervo sciatico prossimale al punto di diramazione e traseleggere il femore a medio albero utilizzando la sega rotante.Rimuovere l'arto posteriore destro nativo del destinatario e smaltire in modo appropriato in conformità con le linee guida locali del comitato per la cura e l'uso degli animali. In questa fase è molto importante abbassare l'isoflurane all'1,5 per cento attraverso il cono del naso. Troppa anestesia durante questa parte meno dolorosa della procedura porterà alla morte del topo.È tempo di coapt le ossa insieme. Utilizzando la sega rotante portatile, radere eventuali irregolarità sia dal donatore che dalle estremità del femore ricevente. Tagliare l'estremità del mozzo di un ago calibro 18, che diventerà l'asta intramidollare del femore.Prima di manipolare l'osso, applicare una piccola quantità di cera ossea sull'estremità del taglio del femore per ridurre il sanguinamento del midollo durante il processo di alesatura. Coapt il donatore e le ossa femorali riceventi usando l'ago calibro 18 come asta intramidollare. Una certa forza è necessaria, ma non alesare nessuna delle due ossa al punto da fratturare la corteccia.Se necessario, rimuovere l'ago e tagliarlo a una lunghezza inappropriata in modo che entrambe le ossa si adattino senza intoppi sull'ago senza che l'ago si mostri tra l'osso. Posizionare un piccolo supporto come un cuscinetto di garza o una piccola roccia o modellare l'argilla sotto l'arto donatore per tenerlo fuori dalla tensione. Riapprossimare i gruppi muscolari ventrali con da otto a 10 semplici suture di poliglactina interrotte da 5 a 0 in modo che l'innesto non ruoti attorno all'ago del femore.Questo dà stabilità agli arti per l'anastomosi. Ora inizia l'anastomosi. Irrigare periodicamente l'innesto e il campo chirurgico con soluzione salina ghiacciata per una migliore visualizzazione e ridurre le lesioni da riperfusione ischemica.Allineare le arterie femorali donatrici e riceventi e l'anastomosi in modo end-to-end utilizzando una semplice sutura di nylon 10-0 interrotta, evitando sia la tensione che il looping. L'arteria richiede una media di sei suture. Simile all'arteria, anastomoso le vene femorali donatrici e riceventi in modo end-to-end.La vena richiede da sei a otto suture. La generosa irrigazione salina fredda, la tecnica di movimentazione atraumatica dei vasi e l'abbandono di lunghe code per fungere da suture di permanenza per la retrazione dei vasi sono strumenti importanti per un'efficace anastomosi microchirurgica. Posizionare una moderata quantità di polvere di cellulosa emostatica su entrambe le anastomosi e successivamente rimuovere i morsetti del bulldog microchirurgico prossimale sulla vena e sull'arteria.Ispezionare entrambe le anastomosi per una buona persistenza e flusso. Utilizzare bastoncini di cotone per pungere delicatamente la vena e ispezionare per una buona emostasi su entrambe le anastomosi. Quando entrambe le anastomosi sono confermate soddisfacenti, tagliare eventuali code di sutura a lunga permanenza rimanenti per abbinarle alle altre.Riposizionando il ratto nella posizione del decubito laterale sinistro, utilizzare l'elettrocauteria liberale per ottenere un'emostasi meticolosa di qualsiasi sanguinamento muscolare di riperfusione. L'attenzione è rivolta all'anastomosi nervosa una volta assicurata l'emostasi muscolare. Riapprossimare i gruppi muscolari dorsali che si trovano direttamente sotto il nervo sciatico con semplici suture di poliglactina interrotte 5-0.Tagliare indietro tutte le estremità nervose che appaiono lacero. Riavvicinare il nervo sciatico con 10-0 suture di nylon che cercano morsi epineurali. Di solito sono sufficienti da otto a 10 semplici suture interrotte.Riapprossimare i restanti gruppi muscolari dorsali con 5-0 suture di poliglatina. Quindi chiudere la pelle dorsale con 4-0 sutura a corsa continua di poliglactina. Riposizionando il topo in posizione supina, riapprossimare il nervo femorale con sutura di nylon 10-0, ancora una volta, cercando morsi epineurali.Di solito sono sufficienti da due a tre semplici suture interrotte. Chiudere la pelle ventrale rimanente allo stesso modo della pelle dorsale. Evita l'eccesso di coda di sutura, che può essere irritante per il topo una volta sveglio.Una volta che gli animali sono fuori dalla finestra postoperatoria immediata, possono essere testati per il recupero neuromotorio. Il test di Hargreaves viene utilizzato per testare la sensazione termica. Posizionare il topo nel contenitore di prova e consentirlo di acclimatarsi per 20 minuti.Il vetro dell'apparecchio è confermato pulito e si conferma che la fonte di calore sta lavorando con il dito dell'investigatore. Prima del test, verificare che il ratto sia sveglio e che la zampa testata sia posizionata sopra il rilevatore di movimento a infrarossi. Trasmettere energia termica al livello di intensità 90.Viene registrato un ritardo nel tempo in cui l'animale allontana la zampa dalla fonte di calore. Se non si verifica alcun movimento entro 20 secondi, il test viene interrotto per prevenire lesioni. Ottenere cinque prove per arto testato, escluso il valore più alto e più basso prima di calcolare il tempo medio di latenza di astinenza per ciascun animale.Ecco il design operativo raffigurato in formato cartone animato. L'arto posteriore destro dei ratti donatori e riceventi viene amputato a livello della coscia media come sezione trasversale sciatica. L'arteria femorale, la vena e il nervo, così come il nervo sciatico e l'osso del femore devono quindi essere ricollegati nell'intervento chirurgico al ricevente.Il modello può essere utilizzato per mostrare effetti differenziali di sopravvivenza della soppressione immunitaria e della strategia di trapianto. Con questa tecnica, la sopravvivenza a lungo termine è realizzabile. Il modello può essere utilizzato per indagare il recupero sensoriale dei nervi, che può essere evidente per quattro settimane postoperatoriamente.La funzione motoria può anche essere interrogata utilizzando una piattaforma di analisi dell'andatura. Qui, abbiamo presentato una piattaforma modello di ratto con caratteristiche di sopravvivenza favorevoli, che usiamo per sondare il recupero sensoriale e motorio come si vede nelle figure in corso. Trapianto di arti nella più ampia categoria di VCA, l'allotrapianto dei componenti vascolarizzati ha una promessa terapeutica ampiamente applicabile non è ancora stata mantenuta.I principali blocchi stradali sono le attuali tecniche di immunosoppressione e recupero neuromotorio. Lo sviluppo di nuove tecniche dipenderà da una modellazione animale flessibile, robusta e riproducibile. Utilizzando questa piattaforma, speriamo che gli investigatori siano in grado di avanzare molteplici sfaccettature del trapianto di arti.Grazie per la visione e buona fortuna nei tuoi prossimi passi.

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