Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza

Quantificare i cambiamenti conformazionali nelle singole biomolecole sotto flusso di taglio è utile per comprendere la funzione e la biofisica delle macromolecole come proteine e DNA. La microscopia a fluorescenza consente la visualizzazione in situ in tempo reale di singole molecole in ambienti di flusso fisiologico ad alta risoluzione temporale e spaziale. Questo non ha eguali con altre tecniche come AFM.

Caratterizzando la forza di taglio sotto la quale le proteine il nostro DNA ha cambiamenti conformazionali globali, si possono progettare meglio farmaci che imitano queste proprietà biofisiche. Questo protocollo può essere ampiamente applicato per studiare il comportamento o altri polimeri, specialmente bio polimeri, in condizioni di flusso variabili e per indagare la reologia di fluidi complessi. La tempistica dei passaggi è fondamentale per il successo.

Ti consigliamo di praticare più volte il trattamento superficiale del dispositivo microfluidico e i passaggi di microscopia a fluorescenza per eseguirli in modo efficiente. Catturare cambiamenti conformazionali nelle biomolecole è un fenomeno visivo e dinamico meglio visto sulla pellicola. Gli scienziati comprenderanno meglio questo metodo dopo aver visto la microscopia a base di proteine e DNA in tempo reale presentata in questo video.

Per preparare il dispositivo microfluidico, aggiungere cinque parti di base in elastomero siliconico a un agente polimerizzante di una parte in una barca di pesatura. e mescolare accuratamente il contenuto per un minuto per creare una soluzione PDMS pre-curata. Posizionare il wafer di silicio principale in una piastra di Petri di plastica e versare la soluzione PDMS sul wafer per creare uno strato di cinque millimetri.

Coprire il piatto e lasciarlo in un essiccatore sotto vuoto per un'ora per rimuovere le bolle d'aria. Quindi incubare la piastra di Petri coperta a 60 gradi Celsius durante la notte per curare il PDMS in un solido flessibile, che si tradurrà in canali microfluidici modellati nel PDMS all'interfaccia del wafer PDMS. Il giorno successivo, utilizzare un rasoio per tagliare rettangoli di 20 per 10 millimetri intorno a ciascun canale microfluidico nel PDMS e rimuovere i blocchi rettangolari con una pinzetta.

Utilizzare un ago con estremità smussata calibro 25 con bordi affilati per perforare un foro di diametro di 0,5 millimetri ad un'estremità del canale, assicurandosi che il foro attraversa completamente il blocco PDMS. Utilizzare un ago sottile per perforare il PDMS dal foro e ripetere il processo all'altra estremità del canale. Posizionare il blocco PDMS con il lato del canale verso l'alto e il coverslip nella camera di una macchina di incollaggio al plasma e avviare il trattamento.

Al termine del trattamento, posizionare rapidamente il blocco PDMS su un coverslip in modo che il canale sia in contatto con lo scivolo. Applicare pressione sui bordi del blocco, quindi posizionare l'assieme PDMS coverslip su una piastra calda a 115 gradi Celsius per 15 minuti per rinforzare il legame permanente. Infine, inserire un 10 centimetri di lunghezza.

Tubo di diametro interno di 0,25 millimetri nel foro di uscita nella parte superiore del blocco PDMS per consentire al fluido di fluire facilmente fuori dal canale. Per gli esperimenti von Willebrand factor o VWF iniettare fino a 10 microlitri da 10 microgrammi per millilitro BSA-Biotina sciolti in 1X PBS sterile nell'ingresso del dispositivo microfluidico. Trattenere alcuni microlitri di BSA-Biotina nella punta della pipetta dopo l'iniezione e lasciare che la punta rimanga incorporata nell'ingresso.

Consentire alla BSA-Biotina di incubare nel dispositivo per due ore, il che si tradurrà in BSA non specificamente legante alla superficie del coverslip. Quindi rimuovere la punta della pipetta e iniettare fino a 10 microlitri di soluzione di blocco della caseina nel canale. Lasciare incubare la soluzione di caseina per 30 minuti in modo che possa bloccare eventuali siti liberi e ridurre il legame non specifico delle biomolecole alla superficie.

Rimuovere la punta e iniettare fino a 10 microlitri di streptavidina in PBS sterile nel canale, che si legherà ai gruppi di biotina della BSA-Biotina. Successivamente, iniettare fino a 10 microlitri di soluzione detergente per lavare via la streptavidina in eccesso. Rimuovere la punta e iniettare VWF in soluzione di caseina o DNA lambda.

Incubare VWF per tre minuti o DNA lambda per 45 minuti. Quindi iniettare cinque biotina senza millimolare per bloccare i siti di legame di streptavidina in eccesso. Caricare un millilitro di soluzione di blocco della caseina in una siringa e fissarlo in una pompa per siringhe.

Quindi attaccare un'estremità del tubo all'ago della siringa e scorrere nella soluzione per rimuovere le bolle d'aria. Circa tre minuti dopo l'iniezione libera di biotina attaccare l'altra estremità del tubo all'ingresso del dispositivo microfluidico. Selezionare l'obiettivo di ingrandimento più alto del TIRF o del microscopio a fluorescenza confocale.

Se necessario, aggiungere una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo. Posizionare il dispositivo microfluidico sullo stadio del microscopio in modo che il coverslip sia a filo con l'obiettivo. Avviare la microscopia a campo luminoso e regolare la messa a fuoco in modo che funzioni come detriti e bolle siano visibili.

Quindi regolare lo stadio nelle direzioni X e Y fino a quando il bordo del canale microfluidico è visibile e divide in due il fotogramma. Passare al canale FITC e regolare il livello Z e l'angolo TIRF in base alle esigenze fino a distinguere le singole molecole globulari verdi. Regola l'intensità del laser e il tempo di esposizione per visualizzare le molecole fluorescenti senza fotolicenza troppo rapidamente.

Quindi regolare il contrasto per visualizzare meglio le molecole. Esattamente cinque minuti dopo l'iniezione gratuita di biotina, avviare e interrompere il flusso dalla pompa della siringa per osservare i cambiamenti nella conformazione molecolare utilizzando portate tra 5000 e 30.000 microlitri all'ora. Con VWF è fondamentale applicare almeno una piccola quantità di flusso, come 30 secondi di flusso di 10.000 microliter all'ora esattamente cinque minuti dopo l'iniezione di biotina libera.

Ripeti questo in varie aree del dispositivo microfluidico e individua molecole che possono estendersi e rilassarsi su più cicli di avvio e arresto del flusso. Si noti quanto tempo ci vuole perché le molecole raggiungano la massima estensione e completa rilassamento e registrino video del comportamento continuo delle molecole sotto flusso di taglio. La flessibilità di una molecola per cambiare la conferma è spesso dimostrata dalla sua capacità di allungarsi man mano che vengono applicate velocità di taglio più elevate a causa dell'aumento del flusso.

La curva di estensione rispetto alla velocità di taglio di una molecola del fattore di von Willebrand è utile per caratterizzare le proprietà biomeccaniche della proteina. Analogamente, le immagini di microscopia a fluorescenza del DNA lambda mostrano un aumento dell'estensione a tassi di taglio più elevati a 30 secondi e un rilassamento graduale oltre due minuti dopo l'arresto del flusso. Quando si lavora con VWF, ricordarsi di incubarlo solo per tre minuti e biotina libera per cinque minuti prima di iniziare il flusso.

Questo è fondamentale per formare il numero ottimale o i collegamenti biotina-streptavidina necessari per lo svelamento reversibile. Questo metodo può essere adattato per visualizzare le interazioni in tempo reale tra più biomolecole e caratterizzare le loro funzioni. Ad esempio, si potrebbe comprendere meglio la formazione della spina piastrinica visualizzando il VWF che si dipana sotto taglio elevato e il suo legame con la molecola di adesione piastrinica GPIb-alpha con questo metodo.