Dimostrazione di una relazione lineare tra il fattore di crescita endoteliale vascolare e l'ormone luteinizzante negli estratti della corteccia renale
22 gennaio 2020
Presentato qui è un protocollo per l'utilizzo di una preparazione di estratto di rene corticale e la normalizzazione totale delle proteine per dimostrare la correlazione tra fattore di crescita endoteliale vascolare e ormone luteinizzante nel rene dei mammiferi.
Il nostro protocollo osserva che l'uso di estratti renali da mucche e suini è una risorsa eccellente ed economica per lo studio della fisiologia renale, in particolare esaminando la correlazione tra il fattore di crescita endoteliale vascolare e altri analiti. È sempre stata una sfida correlare vegf, un fattore di crescita essenziale nell'angiogenesi degli organi, con altre proteine. Questa tecnica ci consente di esaminare l'associazione tra VEGF e aliti come gli ormoni.
Ciò farà sicuramente progredire la nostra base di conoscenze su questo importante fattore di crescita. Questo metodo può essere utile per correlare altri analiti negli estratti corticali renali oltre a quelli menzionati in questo video. La dimostrazione visiva aiuterà gli altri a ottenere risultati riproducibili senza errori di campionamento.
L'uso di tessuti freschi è essenziale per il successo di questa tecnica. È importante ottenere reni interi freschi immediatamente dopo la macellazione da un animale. Trasferire sempre il tessuto in laboratorio sul ghiaccio.
Usa forbici sterili, forcelle, un coltello e piatti petri per sezionare i reni e asportare la porzione di tessuto richiesta. Tagliare delicatamente il rene a metà lungo il piano sagittale e tagliare un pezzo di tessuto dalla regione della corteccia al centro del rene. Tritare il tessuto in piccoli pezzi con il coltello e trasferirlo in un tubo di microfugo con un millilitro di tampone di estrazione della llisi 1X RIPA ghiacciato.
Etichettare il tubo con dettagli specifici del campione e posizionarlo sul ghiaccio. Utilizzare un omogeneizzatore portatile con una sonda sterile per omogeneizzare il tessuto per uno o due minuti fino a quando non sono visibili blocchi, quindi centrifugare immediatamente il tubo a 9.600 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, preparare aliquote separate del campione per ELISA e l'analisi totale delle proteine per evitare cicli multipli di congelamento /disgelo.
Prima di iniziare il saggio, portare tutti i reagenti e la piastra di dosaggio a temperatura ambiente rimuovendo i pozzi in eccesso e conservandoli a quattro gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Diluire il tampone di lavaggio 20X a 300 millilitri con acqua distillata doppia e impostare i pozzi vuoti senza alcuna soluzione. Aggiungere 50 microlitri di standard o campione e altri 50 microlitri di perossidasi di rafano coniugati ad ogni pozzo, quindi aggiungere immediatamente 50 microlitri di soluzione anticorpale ad ogni pozzo e sigillare la piastra.
Mescolare il piatto e incubarlo a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, lavare ogni bene con 200 microlitri di tampone di lavaggio. Aggiungere 50 microlitri di substrato A e substrato B ad ogni pozzo, mescolare delicatamente la piastra toccando sul lato, quindi sigillare e incubarla al buio per 15 minuti a 37 gradi Celsius.
Aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto ad ogni pozzo. Toccare delicatamente la piastra e leggere l'assorbanza a 450 nanometri con uno spettrofotometro. Preparare i reagenti e lavare il tampone come descritto in precedenza, quindi aggiungere 100 microlitri di standard o campione a ciascun pozzo, sigillare la piastra, mescolare bene e incubarla per due ore a 37 gradi Celsius.
Rimuovere il liquido in ogni pozzo e aggiungere 100 microlitri del reagente di rilevamento A.Sigillare la piastra e incubarla per un'altra ora. Successivamente, lavare ogni bene con 400 microlitri di tampone di lavaggio, quindi aggiungere 90 microlitri di soluzione di substrato a ciascun pozzo, toccare delicatamente la piastra e incubarla per un'altra ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'ultima incubazione, aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto ad ogni pozzo, toccare delicatamente la piastra e leggere l'assorbanza a 450 nanometri con uno spettrofotometro.
Stimare la proteina totale degli estratti renali bovini e suini con un saggio BSA standard e utilizzare questa stima per normalizzare i risultati LH e VEGF-A-ELISA. I livelli medio e mediano di LH e VEGF sono stati calcolati sia per gli animali che per i sessi. Dopo aver verificato la normalità dei dati, sono stati utilizzati modelli di regressione lineare per esaminare la relazione tra LH e VEGF.
LH è risultato essere un predittore forte e significativo del VEGF sia nei reni bovini che in quello suino. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di campionare aree identiche in ogni tessuto. Una procedura simile può essere utilizzata per estrarre qualsiasi tipo di tessuto.
Ricorda di normalizzare gli aliti con l'estratto proteico totale di qualsiasi tessuto tu usi.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra la correlazione tra il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e l'ormone luteinizzante (LH) in estratti renali di mammiferi, utilizzando un metodo standardizzato. Lo studio utilizza estratti corticali renali di bovini e suini per approfondire la comprensione della fisiologia renale e delle interazioni proteiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Fisiologia renale
- Analisi dei fattori di crescita
- Tecniche di normalizzazione delle proteine
Sfondo
- L'associazione del VEGF con altre proteine è risultata difficoltosa in studi precedenti.
- L'importanza dell'uso di tessuto renale fresco per ottenere risultati accurati.
- Il progresso dei metodi consente una migliore riproducibilità nei saggi biologici.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di estratti renali di mucca e di maiale per saggi proteici
- ELISA per la quantificazione dei livelli di LH e VEGF
- Analisi di regressione lineare a ciclo per la verifica delle relazioni
Risultati principali
- È stata osservata una correlazione significativa tra LH e VEGF sia nei reni bovini che in quelli suini.
- La normalizzazione dei risultati dell'ELISA rispetto alla proteina totale è stata fondamentale per l'accuratezza.
- Il metodo potrebbe essere applicabile per l'analisi di altri analiti negli estratti renali.
Conclusioni
- Questo studio illustra un metodo affidabile per correlare fattori di crescita importanti nella biologia renale.
- I risultati hanno implicazioni per ulteriori ricerche sull'angiogenesi organica e sulle interazioni ormonali correlate.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Stabilire una relazione quantitativa e lineare tra l'ormone luteinizzante (LH) e il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) negli estratti della corteccia renale affronta una sfida fondamentale nella validazione degli obiettivi per le vie di angiogenesi renale. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva negli studi meccanicistici consentendo misurazioni solide e riproducibili delle interazioni tra ormoni e fattori di crescita in modelli mammiferi di ordine superiore. Il protocollo supporta la continuità traslazionale dalla biologia della scoperta alla ricerca preclinica sfruttando tessuti bovini e suini facilmente accessibili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi del legame meccanicistico tra LH e VEGF nel tessuto renale.
- Supporta la riduzione del rischio biologico quantificando la modulazione del VEGF indotta dagli ormoni.
- Facilita la validazione funzionale del bersaglio per le vie associate all'angiogenesi nei modelli renali.
- Fornisce un quadro riproducibile per il test delle ipotesi in fisiologia renale.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara estratti corticali renali validati per saggi quantitativi successivi.
- Standardizza la normalizzazione dei livelli di analita rispetto alle proteine totali per garantire la riproducibilità del saggio.
- Consente una quantificazione affidabile mediante ELISA di LH e VEGF per flussi di lavoro di screening.
- Permette la scalabilità e l'adattamento del saggio a diverse specie utilizzando fonti di tessuto abbondanti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi rilevanti per la malattia modellando la regolazione del VEGF in mammiferi di ordine superiore.
- Garantisce continuità agli studi traslazionali sui biomarcatori nell'angiogenesi renale.
- Permette decisioni di avanzamento corrette per il rischio, sostenendo output riproducibili e quantitativi.
- Riduce i rischi associati alle assunzioni meccanicistiche prima della selezione del modello preclinico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo test quantitativi delle ipotesi, la standardizzazione dei saggi e l'allineamento dei modelli traslazionali nella ricerca sull'angiogenesi renale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica meccanicistica di ipotesi sulle interazioni LH-VEGF in estratti della corteccia renale.
- Screening: Fornisce risultati ELISA riproducibili e normalizzati per analisi comparative tra campioni e specie.
- Analisi: Offre misurazioni quantitative di variabili dipendenti e risultati di regressione lineare per analisi statistiche solide.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte della ricerca a modelli preclinici utilizzando tessuti di mammiferi fisiologicamente rilevanti.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo scalabile e adattabile per ampi studi di correlazione tra analiti in fisiologia renale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sull'angiogenesi renale.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di lavorazione dei tessuti, la normalizzazione degli analiti e i flussi di lavoro ELISA per garantire la riproducibilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e la selezione del portafoglio fornendo dati robusti e quantitativi.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli e dei percorsi renali in base al rischio per ulteriori sviluppi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione dei tessuti, nell'omogeneizzazione e nell'esecuzione del saggio ELISA.
- Necessita dell'accesso a reni freschi di bovino o suino e a strumentazione analitica per la quantificazione delle proteine e la lettura dei risultati ELISA.
- Richiede una rigorosa normalizzazione e coerenza nel campionamento per garantire la confrontabilità tra i campioni.
- Adattabile ad altri tipi di tessuto e analiti con opportune modifiche del protocollo.
- Dipende dal reperimento immediato del tessuto e dal mantenimento della catena del freddo per preservare l'integrità del campione.
