Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali
December 3rd, 2020
Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.
Utilizzando la microscopia intravitale, questo protocollo consente la visualizzazione in tempo reale del tessuto intestinale fino a una risoluzione a singola cellula e lo studio di processi altamente dinamici come lo spargimento cellulare. In combinazione con gli esperimenti di tracciante standard, questo protocollo consente l'identificazione sia dei disturbi della permeabilità intestinale in vivo che della distinzione tra permeabilità para e transcellulare. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato come base per lo sviluppo di ulteriori approcci di microscopia intravitale per visualizzare altri processi cellulari altamente dinamici di interesse all'interno di vari tessuti.
La dimostrazione visiva di questo metodo è essenziale per comprendere le fasi di preparazione chirurgica e posizionare l'animale vivente in modo da facilitare l'acquisizione dell'immagine sulla superficie della mucosa intestinale. Prima di iniziare la procedura, accendere la base e la scatola dello scanner di un microscopio a scansione laser confocale e premere start per accendere il computer. Avviare il software di acquisizione delle immagini e selezionare la configurazione appropriata.
Per impostare la risoluzione dell'immagine appropriata, selezionare configurazione, hardware, risoluzione, profondità di bit e 12. Nel menu di acquisizione, selezionate XYZT per la modalità di acquisizione dell'immagine e impostate l'obiettivo su 20 o 40X. Per impostare l'impostazione di acquisizione sequenziale, fate clic su cerca e aggiungete e selezionate tra i fotogrammi.
Per configurare la prima sequenza, attivare la scatola laser visibile. Impostare il tubo fotomoltiplicatore uno su e definire la lunghezza d'onda di emissione. Per configurare la seconda sequenza, attivare la scatola laser visibile.
Impostare il tubo fotomoltiplicatore due su e definire la lunghezza d'onda di emissione. Quindi attivare i laser appropriati. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedino, utilizzare un cotton fioc per applicare un unguento agli occhi del topo anestetizzato e fare un'incisione di un centimetro nella regione ventricolare sinistra dell'addome.
Utilizzare le forcep per esternarizzare un segmento da tre a cinque centimetri dell'intestino. Fare due piccole incisioni nella parte superiore e inferiore del segmento intestinale e introdurre una micropipetta di vetro nel lume intestinale. Quindi utilizzare l'elettrocauterizzazione per aprire longitudinalmente il segmento intestinale esteriore lungo il lato anti-mesenterico ed esporre la mucosa.
Risciacquare brevemente il tessuto con soluzione salina per rimuovere il contenuto fecale. Per la colorazione della superficie della mucosa intestinale, applicare 100 microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione di acriflavina in goccioline sulla superficie mucosa esposta e lasciare che la macchia si sviluppi per tre minuti prima di lavare la soluzione rimanente con PBS. Successivamente, applicare 100 microlitri di una soluzione di dextran di rodimina millilitro per millilitro in goccioline alla mucosa per un'incubazione di tre minuti prima del lavaggio con PBS.
Quindi posizionare la supina del mouse anestetizzata su uno scivolo di copertura montato sulla camera risciacquata con soluzione salina di 37 gradi Celsius, regolando la posizione se necessario, e posizionare la preparazione sullo stadio del microscopio invertito. Immediatamente dopo aver posizionato il mouse sul palco, accendere la sorgente luminosa e regolare la posizione XY fino a quando l'asse di illuminazione non è focalizzato sulla preparazione del tessuto. Per selezionare il campo visivo, selezionare il cubo di filtro appropriato.
Aprire l'otturatore e utilizzare le ruote macro e micro per concentrarsi sulla superficie della mucosa intestinale. Regolare la posizione XY per individuare un'area in cui è possibile visualizzare diversi villi all'interno del campo visivo e modificare il cubo del filtro per verificare che la colorazione di rodimina dextran sia visibile anche in quell'area. Quando è stata identificata un'area di interesse, avviare l'acquisizione dell'immagine e selezionare la sequenza uno per regolare la potenza, il guadagno e l'offset laser per la prima sequenza.
Quindi selezionare la sequenza due e regolare la potenza, il guadagno e l'offset laser per la seconda sequenza. Per definire l'intervallo Z-stack, aprite il menu di consegna z-stack. Utilizzare il controllo Z-access per concentrarsi sulla superficie della mucosa e fare clic su begin.
Concentrati sul limite inferiore di dove il segnale è ancora rilevabile e fai clic sull'estremità. Definire il numero di Z-stack, evitando time-lapse superiori a due minuti per due punti di tempo consecutivi e aprire il menu di tempo per selezionare riduci a icona e acquisire fino all'arresto. Per definire la media della linea, selezionare cercarne uno, la media delle linee due, cercarne due e la media della linea due.
Quindi, per acquisire immagini, impostare il formato su 1024 x 1024 pixel e la velocità su 400 e fare clic su Avvia. I topi condizionali carenti di GGTasi, specifici delle cellule epiteliali intestinali, hanno sviluppato una grave patologia intestinale, come dimostrato da un aumento del punteggio di danno istologico dell'intestino tenue e dall'aumento della permeabilità epiteliale intestinale può anche essere rilevato tramite tracciante in esperimenti in vivo utilizzando FITC-dextran somministrato per via orale. Gli eventi di spargimento cellulare potrebbero essere identificati come cellule che si spostano fuori dal monostrato epiteliale nel lume, portando a spazi temporanei nel soffitto dell'epitelio che vengono infine chiusi dal contatto tra le cellule vicine, un cosiddetto effetto cerniera.
Queste lacune si osservano sia nei topi carenti di controllo che in quello GGTase, sebbene la frequenza di questi fenomeni sia più alta in quest'ultimo. È interessante notare che anche altre cellule sembrano assumere dextran. Questi cosiddetti eventi cellulari permeabili si verificano anche principalmente nei topi knockout condizionali.
L'immunostaining di proteine di giunzione correlate al citoscheletro e strette di interesse può essere eseguita per identificare obiettivi specifici che contribuiscono a potenziali interruzioni della permeabilità epiteliale determinate tramite microscopia intravitale. Questo metodo può essere utilizzato per l'analisi di altri fenomeni sulla superficie della mucosa intestinale, come la perdita endoteliale o la comunicazione epiteliale immunitaria nel contesto dell'infezione intestinale.
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Panoramica
Questo protocollo utilizza la microscopia intravitale per visualizzare lo sfogliamento delle cellule epiteliali intestinali in tempo reale all'interno di animali viventi. Il metodo permette l'imaging della mucosa intestinale a risoluzione di singola cellula, facilitando lo studio dei processi cellulari dinamici.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Tecniche di microscopia
Sfondo
- La microscopia intravitale fornisce informazioni sulla dinamica dei tessuti vivi.
- Comprendere la permeabilità intestinale è cruciale per vari studi biologici.
- Lo sfogliamento cellulare è un processo significativo per la salute e la malattia intestinale.
- L'imaging in tempo reale migliora lo studio dei comportamenti cellulari.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare lo sfogliamento delle cellule epiteliali intestinali in vivo.
- Identificare disturbi di permeabilità nella barriera intestinale.
- Distinguere tra meccanismi di permeabilità para e transcellulare.
Metodi utilizzati
- Microscopia intravitale per l'imaging in tempo reale.
- Colorazione topica della mucosa intestinale con acriflavina e rodaminaB-destrano.
- Microscopia confocale per ottenere una risoluzione di singola cellula.
- Esperimenti con traccianti standard per valutare la permeabilità.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dello sfogliamento cellulare in tessuto intestinale vivo.
- Identificazione di processi dinamici che influenzano la permeabilità intestinale.
- Dimostrazione dell'applicabilità del metodo ad altri tessuti.
- Migliore comprensione della preparazione chirurgica per l'imaging.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per studiare la dinamica intestinale.
- L'imaging in tempo reale può portare a nuove intuizioni sui processi cellulari.
- Questo metodo può ispirare ulteriori ricerche in vari contesti biologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Intravital microscopy enables real-time visualization of intestinal epithelial dynamics, providing direct observation of barrier function and cellular shedding in vivo. This approach supports mechanistic de-risking in gastrointestinal target validation by linking molecular perturbations to functional permeability outcomes. The method enhances predictive confidence in preclinical models by delivering quantitative, spatially resolved data on epithelial integrity and repair processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating genetic or pharmacological interventions with real-time epithelial shedding and barrier leakage events.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct visualization of intestinal permeability disturbances in living systems.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing between paracellular and transcellular permeability mechanisms, informing mechanism-based risk assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline shedding and permeability phenotypes in disease-relevant models.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through quantitative imaging of tracer flux and cellular extrusion events.
- Platform Value: Highlights screening readiness and scalability by enabling longitudinal monitoring of dynamic intestinal processes in anesthetized preparations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment by connecting intravital observations to histological damage scores and tracer-based permeability assays.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by permitting longitudinal assessment of epithelial repair and barrier restoration.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking value by identifying permeable cell events and zipper-mediated restitution as functional readouts of epithelial resilience.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, supporting iterative refinement of gastrointestinal targets based on functional barrier outcomes.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking by enabling real-time correlation of molecular modifications with epithelial shedding and barrier function.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article through standardized tracer delivery and confocal imaging of dextran flux across the intestinal mucosa.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including Z-stack acquisition, line averaging, and time-lapse imaging of shedding frequency and gap formation.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it by linking intravital shedding events to increased histological damage and FITC-dextran permeability in conditional knockout models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique by emphasizing its applicability to other highly dynamic cellular processes in various tissues beyond intestinal mucosa.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in intravital microscopy, surgical preparation, and confocal imaging.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including confocal laser scanning microscope, appropriate objectives (20X/40X), and sequential acquisition capabilities.
- Cross-team standardization requirements for staining protocols (acriflavine and rhodamine-B dextran), Z-stack configuration, and time-lapse parameters.
- Adaptation considerations across model systems, including transgenic reporter strains and conditional knockout models for cell-type-specific analysis.
- Practical limitations supported by source material: optical properties of tissue, imaging technology, and microscope configuration determine working distance and resolution.
