Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali
3 dicembre 2020
Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.
Utilizzando la microscopia intravitale, questo protocollo consente la visualizzazione in tempo reale del tessuto intestinale fino a una risoluzione a singola cellula e lo studio di processi altamente dinamici come lo spargimento cellulare. In combinazione con gli esperimenti di tracciante standard, questo protocollo consente l'identificazione sia dei disturbi della permeabilità intestinale in vivo che della distinzione tra permeabilità para e transcellulare. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato come base per lo sviluppo di ulteriori approcci di microscopia intravitale per visualizzare altri processi cellulari altamente dinamici di interesse all'interno di vari tessuti.
La dimostrazione visiva di questo metodo è essenziale per comprendere le fasi di preparazione chirurgica e posizionare l'animale vivente in modo da facilitare l'acquisizione dell'immagine sulla superficie della mucosa intestinale. Prima di iniziare la procedura, accendere la base e la scatola dello scanner di un microscopio a scansione laser confocale e premere start per accendere il computer. Avviare il software di acquisizione delle immagini e selezionare la configurazione appropriata.
Per impostare la risoluzione dell'immagine appropriata, selezionare configurazione, hardware, risoluzione, profondità di bit e 12. Nel menu di acquisizione, selezionate XYZT per la modalità di acquisizione dell'immagine e impostate l'obiettivo su 20 o 40X. Per impostare l'impostazione di acquisizione sequenziale, fate clic su cerca e aggiungete e selezionate tra i fotogrammi.
Per configurare la prima sequenza, attivare la scatola laser visibile. Impostare il tubo fotomoltiplicatore uno su e definire la lunghezza d'onda di emissione. Per configurare la seconda sequenza, attivare la scatola laser visibile.
Impostare il tubo fotomoltiplicatore due su e definire la lunghezza d'onda di emissione. Quindi attivare i laser appropriati. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedino, utilizzare un cotton fioc per applicare un unguento agli occhi del topo anestetizzato e fare un'incisione di un centimetro nella regione ventricolare sinistra dell'addome.
Utilizzare le forcep per esternarizzare un segmento da tre a cinque centimetri dell'intestino. Fare due piccole incisioni nella parte superiore e inferiore del segmento intestinale e introdurre una micropipetta di vetro nel lume intestinale. Quindi utilizzare l'elettrocauterizzazione per aprire longitudinalmente il segmento intestinale esteriore lungo il lato anti-mesenterico ed esporre la mucosa.
Risciacquare brevemente il tessuto con soluzione salina per rimuovere il contenuto fecale. Per la colorazione della superficie della mucosa intestinale, applicare 100 microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione di acriflavina in goccioline sulla superficie mucosa esposta e lasciare che la macchia si sviluppi per tre minuti prima di lavare la soluzione rimanente con PBS. Successivamente, applicare 100 microlitri di una soluzione di dextran di rodimina millilitro per millilitro in goccioline alla mucosa per un'incubazione di tre minuti prima del lavaggio con PBS.
Quindi posizionare la supina del mouse anestetizzata su uno scivolo di copertura montato sulla camera risciacquata con soluzione salina di 37 gradi Celsius, regolando la posizione se necessario, e posizionare la preparazione sullo stadio del microscopio invertito. Immediatamente dopo aver posizionato il mouse sul palco, accendere la sorgente luminosa e regolare la posizione XY fino a quando l'asse di illuminazione non è focalizzato sulla preparazione del tessuto. Per selezionare il campo visivo, selezionare il cubo di filtro appropriato.
Aprire l'otturatore e utilizzare le ruote macro e micro per concentrarsi sulla superficie della mucosa intestinale. Regolare la posizione XY per individuare un'area in cui è possibile visualizzare diversi villi all'interno del campo visivo e modificare il cubo del filtro per verificare che la colorazione di rodimina dextran sia visibile anche in quell'area. Quando è stata identificata un'area di interesse, avviare l'acquisizione dell'immagine e selezionare la sequenza uno per regolare la potenza, il guadagno e l'offset laser per la prima sequenza.
Quindi selezionare la sequenza due e regolare la potenza, il guadagno e l'offset laser per la seconda sequenza. Per definire l'intervallo Z-stack, aprite il menu di consegna z-stack. Utilizzare il controllo Z-access per concentrarsi sulla superficie della mucosa e fare clic su begin.
Concentrati sul limite inferiore di dove il segnale è ancora rilevabile e fai clic sull'estremità. Definire il numero di Z-stack, evitando time-lapse superiori a due minuti per due punti di tempo consecutivi e aprire il menu di tempo per selezionare riduci a icona e acquisire fino all'arresto. Per definire la media della linea, selezionare cercarne uno, la media delle linee due, cercarne due e la media della linea due.
Quindi, per acquisire immagini, impostare il formato su 1024 x 1024 pixel e la velocità su 400 e fare clic su Avvia. I topi condizionali carenti di GGTasi, specifici delle cellule epiteliali intestinali, hanno sviluppato una grave patologia intestinale, come dimostrato da un aumento del punteggio di danno istologico dell'intestino tenue e dall'aumento della permeabilità epiteliale intestinale può anche essere rilevato tramite tracciante in esperimenti in vivo utilizzando FITC-dextran somministrato per via orale. Gli eventi di spargimento cellulare potrebbero essere identificati come cellule che si spostano fuori dal monostrato epiteliale nel lume, portando a spazi temporanei nel soffitto dell'epitelio che vengono infine chiusi dal contatto tra le cellule vicine, un cosiddetto effetto cerniera.
Queste lacune si osservano sia nei topi carenti di controllo che in quello GGTase, sebbene la frequenza di questi fenomeni sia più alta in quest'ultimo. È interessante notare che anche altre cellule sembrano assumere dextran. Questi cosiddetti eventi cellulari permeabili si verificano anche principalmente nei topi knockout condizionali.
L'immunostaining di proteine di giunzione correlate al citoscheletro e strette di interesse può essere eseguita per identificare obiettivi specifici che contribuiscono a potenziali interruzioni della permeabilità epiteliale determinate tramite microscopia intravitale. Questo metodo può essere utilizzato per l'analisi di altri fenomeni sulla superficie della mucosa intestinale, come la perdita endoteliale o la comunicazione epiteliale immunitaria nel contesto dell'infezione intestinale.
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Panoramica
Questo protocollo utilizza la microscopia intravitale per visualizzare in tempo reale lo scivolamento delle cellule epiteliali intestinali all'interno di animali vivi. Il metodo consente l'acquisizione di immagini della mucosa intestinale con risoluzione a livello di singola cellula, facilitando lo studio di processi cellulari dinamici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Tecniche di microscopia
Sfondo
- La microscopia intravitale fornisce informazioni sulle dinamiche dei tessuti vivi.
- La comprensione della permeabilità intestinale è fondamentale per diversi studi biologici.
- Il distacco cellulare è un processo significativo per la salute e le malattie dell'intestino.
- L'imaging in tempo reale migliora lo studio dei comportamenti cellulari.
Scopo dello studio
- Visualizzare in vivo il distacco delle cellule epiteliali intestinali.
- Identificare alterazioni della permeabilità della barriera intestinale.
- Distinguere tra meccanismi di permeabilità paracellulari e transcellulari.
Metodi Utilizzati
- Microscopia intravitale per l'immagine in tempo reale.
- Colorazione topica della mucosa intestinale con acriflavina e dextrano-rhodaminaB.
- Microscopia confocale per ottenere una risoluzione a singola cellula.
- Esperimenti standard con traccianti per valutare la permeabilità.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita del distacco cellulare in tessuto intestinale vivo.
- Identificazione dei processi dinamici che influenzano la permeabilità intestinale.
- Dimostrazione dell'applicabilità del metodo ad altri tessuti.
- Migliore comprensione della preparazione chirurgica per l'analisi mediante imaging.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per lo studio della dinamica intestinale.
- L'imaging in tempo reale può portare a nuove intuizioni sui processi cellulari.
- Questo metodo potrebbe ispirare ulteriori ricerche in diversi contesti biologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia intravitale consente la visualizzazione in tempo reale della dinamica dell'epitelio intestinale, fornendo un'osservazione diretta della funzione di barriera e del distacco cellulare in vivo. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli gastrointestinali, collegando perturbazioni molecolari a esiti funzionali di permeabilità. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici fornendo dati quantitativi, risolti spazialmente, sull'integrità epiteliale e sui processi di riparazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche correlando interventi genetici o farmacologici con eventi in tempo reale di desquamazione epiteliale e perdita della barriera.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli attraverso la visualizzazione diretta di alterazioni della permeabilità intestinale in sistemi viventi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio distinguendo tra meccanismi di permeabilità paracellulare e transcellulare, fornendo informazioni per la valutazione del rischio basata sul meccanismo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, stabilendo fenotipi di base per il rilascio cellulare e la permeabilità in modelli pertinenti alle malattie.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità del saggio mediante imaging quantitativo del flusso di traccianti e degli eventi di estrusione cellulare.
- Valore della piattaforma: Evidenzia la prontezza per lo screening e la scalabilità consentendo il monitoraggio longitudinale di processi intestinali dinamici in preparazioni anestetizzate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Illustra la rilevanza per le malattie e l'allineamento con biomarcatori traslazionali collegando osservazioni intravitali a punteggi di danno istologico e saggi di permeabilità basati su traccianti.
- Valore operativo: Descrive la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica consentendo la valutazione longitudinale della riparazione epiteliale e del ripristino della barriera.
- Avanzamento ponderato rispetto al rischio: Si concentra sul valore predittivo di riduzione del rischio identificando eventi cellulari permeabili e la ricostituzione mediata da sistemi a cerniera come letture funzionali della resilienza epiteliale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica, sostenendo un affinamento iterativo dei bersagli gastrointestinali in base ai risultati funzionali della barriera.
- Biologia della Scoperta: Spiega in che modo il metodo supporta la verifica di ipotesi, la chiarificazione di percorsi biologici o la riduzione del rischio biologico, consentendo la correlazione in tempo reale tra modifiche molecolari e distacco epiteliale e funzione della barriera.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio, la riproducibilità o le uscite quantitative supportate dall'articolo tramite somministrazione standardizzata di traccianti e imaging confocale del flusso di dextrano attraverso la mucosa intestinale.
- Analisi: Mette in evidenza misurazioni, letture o uscite statistiche che aiutano i gruppi di lavoro a confrontare diverse condizioni, inclusa l'acquisizione di Z-stack, la media delle linee e l'imaging con lapse temporale della frequenza di distacco e della formazione di lacune.
- Ricerca Translazionale: Collega il metodo a continuità precliniche o allineamento con biomarcatori solo quando la fonte lo supporta, collegando eventi di distacco in vivo a un aumento del danno istologico e della permeabilità al FITC-dextrano in modelli di knockout condizionale.
- Riutilizzo Aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, sottolineandone l'applicabilità ad altri processi cellulari altamente dinamici in vari tessuti oltre alla mucosa intestinale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Decisioni di priorità e avanzamento corrette per il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in microscopia intravitale, preparazione chirurgica e imaging confocale.
- Requisiti di strumentazione e infrastruttura analitica, inclusi microscopio confocale a scansione laser, obiettivi appropriati (20X/40X) e capacità di acquisizione sequenziale.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi per protocolli di colorazione (acriflavina e dextrano rodamina-B), configurazione dello stack Z e parametri per acquisizioni a intervalli di tempo.
- Considerazioni sull'adattamento in diversi sistemi modello, inclusi ceppi con reporter transgenici e modelli knock-out condizionali per analisi specifiche per tipo cellulare.
- Limitazioni pratiche supportate dalla letteratura: le proprietà ottiche del tessuto, la tecnologia di imaging e la configurazione del microscopio determinano la distanza di lavoro e la risoluzione.
