Name: Visualizzazione e analisi delle arterie dellarco faringo utilizzando immunohistochimica a monte intero e ricostruzione 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Scopri come visualizzare e analizzare le arterie dell'arco faringeo in embrioni di topo con immunofluorescenza a monte intero, clearing tissutale e ricostruzione 3D. Questo metodo permette di quantificare le cellule endoteliali e studiare lo sviluppo vascolare.

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Ringraziamo Brianna Alexander, Caolan O'Donnell e Michael Warkala per un'attenta lettura e modifica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dai finanziamenti del National Heart, Lung and Blood Institute del NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 a SA; AJR è supportato da NHLBI HL103920-08S1 e dall'Istituto Nazionale di Artrite e Musculoscheletrie e Malattie della Pelle Sovvenzionia T32052283-11.

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<li>Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Clearing+and+Dehydration+of+GFP+Expressing+Mouse+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains.</a> PLoS One. 7 (3), e33916(2012).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La capacità di visualizzare l'endotelio negli embrioni di topo in 3D ha fornito nuove intuizioni sul loro sviluppo3. Qui presentiamo un protocollo che consente l'imaging 3D ad alta risoluzione degli embrioni, la visualizzazione della connettività vascolare e analisi quantitative della formazione di PAA. Questo protocollo può essere impiegato per vedere come le alterazioni genetiche o gli insulti ambientali influiscono sullo sviluppo PAA. La procedura qui riportata utilizza anticorpi contro VEGFR2 ...

Durante l'embriogenesi del topo, le arterie dell'arco fantasma (PAA) sorgono come coppie simmetriche e bilaterali di arterie che collegano il cuore con le aortae dorsali1. Man mano che l'embrione si sviluppa, la prima e la seconda coppia di PAA regrediscono, mentre le 3rd,4the 6PAA subiscono una serie di eventi di rimodellamento asimmetrici per formare le arterie dell'arco aortico2.
I PAA 3, 4 e 6 si sviluppano attraverso la vasculogenesi, che è la formazione de novo dei vasi sanguigni3. I difetti nella formazione o nel rimodellamento di queste arterie ad arco danno origine a vari difetti cardiaci congeniti, come quelli osservati nei pazienti con sindrome di DiGeorge4,5. Pertanto, comprendere i meccanismi che regolano lo sviluppo dei PAA può portare a una migliore comprensione dell'eziologia delle malattie cardiache congenite (CHD).
Gli attuali approcci per la visualizzazione e l'analisi dello sviluppo PAA includono l'immunofluorescenza delle sezioni tissutali, i calchi vascolare, l'iniezione di inchiostro dell'India, la microscopia episcopica ad alta risoluzione e/o l'immunohistochimica a monte intero1,4,5,6,7. Qui, descriviamo un protocollo che combina l'immunofluorescenza a montaggio intero, la microscopia confocale e il rendering delle immagini 3D al fine di raccogliere, analizzare e quantificare i dati volumetrici, la connettività vascolare e l'identità cellulare. Inoltre, dettagliamo un metodo per compartimentare e quantificare il numero di EC in ogni arco faringeo come mezzo per studiare la formazione del plesso vascolare dell'arco faringeo e il suo rimodellamento nei PAA. Mentre questo protocollo è progettato per l'analisi dello sviluppo PAA, può essere utilizzato per analizzare altre reti vascolari in via di sviluppo.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>PBS10X02</td><td></td></tr><tr><td>20x obiettivo ad immersione in acqua</td><td>Nikon</td><td>MRD77200</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1613101</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-capra</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-topo</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td></td></tr> Software di <tr><td>analisi</td><td>Imaris 9.2.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcool benzilico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>305197</td><td></td></tr><tr><td>Benzoato di benzile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.18701.0100</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di copertura</td><td>VWR</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (5 mg/mL stock)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes (2.0 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon (50 mL)</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Pozzetti veloci</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664113</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-VEGFR2</td><td>R& D Sistemi, Inc.</td><td>AF644</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>A1HD25</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-ERG</td><td>Abcam</td><td>ab214341</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri (35 mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri (60 mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-105</td><td></td></tr><tr><td>Stampi in plastica</td><td>VWR</td><td>18000-128</td><td></td></tr><tr><td>Scapels</td><td>Exelint International Co.</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Fisher Scientific BP</td><td>151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione e analisi delle arterie dell'arco faringo utilizzando immunohistochimica a monte intero e ricostruzione 3d

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

La formazione o il rimodellamento improprio delle arterie dell'arco faringeo (PAA) 3, 4 e 6 contribuiscono ad alcune delle forme più gravi di malattia cardiaca congenita. Per studiare la formazione di PAA, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza immunofluorescenza a montaggio intero accoppiato con la radura del tessuto alcool/benzyl benzoate (BABB) e la microscopia confocale. Ciò consente la visualizzazione dell'endotelio dell'arco faringeo ad una risoluzione cellulare fine e la connettività 3D della vascolatura. Utilizzando il software, abbiamo stabilito un protocollo per quantificare il numero di cellule endoteliali (EC) nelle PAA, così come il numero di EC all'interno del plesso vascolare che circonda i PAA all'interno degli archi pharyngeal 3, 4 e 6. Se applicata all'intero embrione, questa metodologia fornisce una visualizzazione completa e un'analisi quantitativa della vascolatura embrionale.

L'intero protocollo di immunofluorescenza montato qui produce risultati chiari e puliti, consentendo la ricostruzione 3D dell'endotelio dell'arco fariano, come si vede nella Figura 1A. È importante incubare gli embrioni per una quantità sufficiente di tempo in ogni soluzione anticorpale per garantire una completa penetrazione attraverso il campione, nonché lavare accuratamente gli embrioni dopo l'incubazione dell'anticorpo. Nella <strong clas...

Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare e analizzare le arterie dell'arco faringeo 3, 4 e 6 degli embrioni di topo usando immunofluorescenza a montaggio intero, radura dei tessuti, microscopia confocale e ricostruzione 3D.

Visualizzazione e analisi delle arterie dell'arco faringo utilizzando immunohistochimica a monte intero e ricostruzione 3D

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Questo metodo consente di compartimentare ogni arco faringeo. I numeri delle cellule endoteliali possono quindi essere quantificati in ogni arco come mezzo per studiare lo sviluppo dell'arteria dell'arco faringeo. I principali vantaggi di questo approccio sono la capacità di visualizzare la relazione tra le diverse strutture vascolari e la capacità di determinare quantitativamente come le strutture hanno influenzato i mutanti.Le arterie ad arco aortico sono comunemente mutate nelle malattie cardiache congenite. Il nostro metodo consente lo studio di come le mutazioni alterano il processo fisiologico di formazione e rimodellamento dei vasi. Sebbene usiamo questo metodo per ottenere informazioni sui meccanismi delle malattie cardiache congenite, può essere applicato ad altri sistemi in particolare con l'avvento della microscopia a fogli di luce.Iniziare utilizzando una pipetta di vetro per trasferire ogni giorno embrionale di topo 9.5 o 10.5 embrione in singoli due tubi millilitro contenenti un millilitro di PBS. Dopo la fissazione, utilizzare le forcep fini per pizzicare con cura l'embrione appena sopra l'arto posteriore e fare un taglio trasversale per rimuovere la metà posteriore dell'embrione. Per permeabilizzare gli embrioni, sostituire il PBS con PBST e posizionare gli embrioni a quattro gradi Celsius con delicata agitazione durante la notte.Il giorno successivo, sostituire il PBST con 600 microlitri di tampone di blocco senza toccare gli embrioni per un'incubazione da 16 a 18 ore a quattro gradi Celsius con delicata agitazione. La mattina seguente, sostituire il tampone di blocco con 600 microlitri dell'anticorpo primario di interesse per tubo per un'incubazione da quattro a cinque giorni a quattro gradi Celsius con delicata agitazione. Alla fine dell'incubazione, lavare gli embrioni in un millilitro di PBST per quattro o cinque ore con agitazione delicata a temperatura ambiente che cambia il PBS ogni ora, seguita da un'incubazione notturna in PBST fresco a quattro gradi Celsius e da quattro a cinque lavaggi aggiuntivi di un'ora il giorno successivo.Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il PBST in ogni tubo con 600 microlitri della soluzione anticorpale secondaria appropriata per un'incubazione da quattro a cinque giorni a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare gli embrioni in un millilitro di PBST fresco per lavaggio come appena dimostrato e utilizzare una pipetta di vetro per trasferire delicatamente ogni embrione in singoli stampi di paraffina di plastica. Rimuovere con cura qualsiasi PBST da ogni embrione e orientare ogni embrione in posizione sagittale.Quindi aggiungere rapidamente circa 500 microlitri di agarosio caldo ad ogni stampo fino a quando ogni embrione non è appena coperto e posizionare gli stampi sul ghiaccio coperto di foglio di alluminio fino a quando l'agarosio non si è solidificato. Per la disidratazione dei campioni embrionali, utilizzare un bisturi pulito per tagliare un blocco di agarosio intorno a ciascun embrione e utilizzare le forcep per afferrare l'agarosio per il trasferimento in un tubo etichettato con due millilitri contenente un millilitro di 25%metanolo. Dopo un'incubazione di un'ora con delicata agitazione al buio, sostituire il 25% di metanolo con un millilitro di 50%metanolo per tubo per un'ulteriore incubazione di un'ora al buio.Dopo la fine della disidratazione, sostituire il 100% di metanolo con un millilitro del 50%BABB per un'incubazione di un'ora con delicata agitazione al buio. Al termine dell'incubazione, sostituire il 50%BABB con un millilitro di 100%BABB per tubo per un'incubazione di un'ora con delicata agitazione al buio, seguita da una seconda incubazione con 100%BABB come appena dimostrato. Per montare gli embrioni per l'imaging, rimuovere l'adesivo da un paraurti veloce e posizionare il paraurti su un coprispazzo di vetro 24 per sei millilitri numero 1.5.Applicare una leggera pressione sull'adesivo per rimuovere eventuali bolle d'aria tra la coverlip e il paraurti e scartare con cura il 100%BABB da ogni tubo. Quindi utilizzare forcep fini per trasferire con cura l'embrione nel pozzo veloce senza toccare l'embrione e posizionare un secondo coverslip sul paraurti. Per far emergere l'endotelio nell'intero terzo arco faringeo, aprire l'immagine di interesse per il software e fare clic su aggiungi nuova superficie.Fate doppio clic sulla superficie uno e rinominare la nuova superficie in terzo arco faringeo. Selezionate salta creazione automatica (Skip automatic creation), modificate manualmente e impostate l'orientamento della superficie sul piano YZ. Utilizzare la posizione della fetta per posizionare il terzo piano superficiale dell'arco faringeo dove si collegano il terzo PAA e l'aorta dorsale.Ruotare l'immagine in modo che il terzo piano della superficie dell'arco faringeo sia in vista e disattivare l'orto sezionatore. In modalità contorno disegno, selezionate la funzione modalità di disegno a distanza e regolate le impostazioni dei parametri in base alle esigenze. Una volta impostati tutti i parametri, premere ESC e fare clic su disegno per tracciare il perimetro del terzo arco faringeo con il cursore del mouse.Quindi utilizzare la posizione della fetta per spostare da 10 a 25 fette e tracciare il perimetro dell'arco faringeo. Una volta tracciato l'intero arco, fate clic su crea superficie (Create Surface) per generare la superficie della regione tracciata. Per mascherare le strutture superfici, nel menu modifica selezionate la selezione della maschera per il terzo PAA e DAPI e fate clic su OK. Rinominare quindi il nuovo canale come PAA DAPI.Ripetere questo passaggio per i canali rimanenti. Per visualizzare il plesso endoteliale separatamente dal PAA, selezionare la selezione della maschera per il terzo PAA e selezionare DAPI. Deselezionate selezionare voxel esterni alla superficie e selezionare voxel all'interno della superficie.Impostare voxel selezionati all'interno della superficie su zero e fare clic su OK. Rinominare il nuovo canale come DAPI non PAA. Ripetere questo passaggio per i canali rimanenti. Selezionare la selezione della maschera per la terza PA e selezionare DAPI non PAA e fare clic su OK. Rinominare il nuovo canale come DAPI inplexus.Ripetere questo passaggio per i canali rimanenti. Per quantificare le singole cellule endoteliali all'interno di ogni struttura di interesse, nel pannello di regolazione del display, spegnere tutti i canali ad eccezione del canale PAA ERG. Nel menu delle proprietà fare clic su Aggiungi nuovi punti e fare clic per rinominare le macchie di un numero totale PAA di celle endoteliali.Fare clic sulla freccia blu e selezionare il canale PAA ERG per il canale di origine. Regolare il diametro XY stimato a quattro micrometri e fare clic sulla freccia blu per passare al pannello successivo. Utilizzare la scala mobile per regolare il numero di punti per garantire che ogni nucleo di cellule endoteliali positive ERG sia rappresentato da un punto.Fare quindi clic sulla doppia freccia verde e disattivare il canale PAA ERG nel pannello di regolazione dello schermo. Attivate il canale PAA VEGFR2 per visualizzare l'endotelio PAA e fate clic su modifica e aggiunge/elimina (Edit and add/delete) per selezionare la superficie dell'oggetto. Quindi premere ESC e tenere premuto MAIUSC per eliminare eventuali punti non positivi a VEGFR2 e fare clic sulla scheda statistiche per determinare il numero totale di celle endoteliali.L'immunofluorescenza a montaggio intero produce risultati chiari e puliti che consentono la ricostruzione 3D dell'endotelio ad arco faringeo. In questa immagine, la presenza dei grandi punti luminosi è il risultato di particolato nelle soluzioni anticorpali o tampone di blocco. Dopo l'arco faringeo e la colorazione superficiale PAA, l'uso della funzione maschera consente di separare visivamente e analizzare in modo indipendente le regioni superficiali.Il mascheramento consente anche l'analisi individuale e la quantificazione dei numeri di cellule endoteliali all'interno di ogni struttura. Ad esempio, qui la caratteristica spot è stata utilizzata per quantificare il numero totale di cellule endoteliali sia nel PAA che nel plesso assegnando un singolo punto per ogni nucleo che esprime ERG. In questa immagine, si può osservare una macchia negativa VEGFR2 positiva ERG generata dalla funzione spot.Pertanto, è essenziale verificare che ogni punto riconosciuto dal software rappresenti effettivamente una singola cella endoteliale. Per ottenere immagini pulite e chiare, ricorda di far girare giù tutte le soluzioni e di lavare correttamente e accuratamente ogni embrione dopo le incubazioni di anticorpi. È importante ricordare che BABB è corrosivo e tossico.Maneggiare e scartare correttamente il solvente e assicurarsi di sigillare completamente gli embrioni fusi per evitare perdite di BABB.

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