Knockdown condizionale combinato e formazione di sfere adattate Per studiare un gene associato alla staminalizza delle cellule staminali del cancro gastrico derivato dal paziente
9 maggio 2020
In questo protocollo, presentiamo un progetto sperimentale utilizzando un sistema di knockdown condizionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare l'effetto della clusterina sullo stelo dei GCSC derivati dal paziente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare sia in vitro che in vivo la funzione dei geni associati alla derivazione in diversi tipi di CSC.
Le cellule staminali tumorali sono implicate nella metastasi recidiva del cancro sulla resistenza ai farmaci. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente per studiare le funzioni dei geni chiave nelle cellule staminali tumorali. Utilizzando un sistema di abbattimento condizionale e un saggio adattato di formazione della sfera, questo metodo è facilmente adattabile per studiare le funzioni in vitro e in vivo sui geni associati alla staminali in diversi tipi di cellule staminali tumorali.
A dimostrare la procedura, saranno Yuting Li e Xiangyu Tan, assistenti di ricerca del mio laboratorio. Per generare particelle di lentivirus, seminare quattro milioni di cellule di imballaggio lentivirale 293T in una piastra di Petri da 100 millimetri con 10 millilitri di DMEM integrati con FBS al 10%. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, assicurandosi che le cellule siano confluenti dal 50 all'80% il giorno della trasfezione.
Portare il siero ridotto a temperatura medio-ambiente e preparare i tubi A e B secondo le indicazioni manoscritte. Aggiungere il contenuto del tubo A al tubo B.Mescolare bene e incubare il tubo per 15 minuti a temperatura ambiente per preparare complessi lipidico-DNA. Rimuovere cinque millilitri di mezzo dal piatto di coltura cellulare.
Quindi aggiungere cinque millilitri del complesso lipidico-DNA nel piatto di coltura cellulare cadere saggiamente e ruotare delicatamente il piatto. Incubare il piatto di coltura per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, rimuovere con cura il mezzo di trasfezione e sostituirlo con 10 millilitri di DMEM pre-riscaldato integrato con 10%FBS.
Incubare le cellule per altre 24 ore. Circa 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere 10 millilitri di lentivirus contenenti supernanti e filtrarli con un filtro pour da 0,45 micrometri per rimuovere i detriti cellulari. Tutti i vasi, le punte, i filtri e le siringhe di coltura cellulare possono contenere lentivirus e devono essere trattati con candeggina al 10% prima dello smaltimento.
Trasferire un supernatante chiarificato in un contenitore sterile. Aggiungere il concentratore Lenti-X e mescolare con un'inversione delicata. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, centrifuga il campione a 1500 volte G per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere con cura il supernatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet nella parte inferiore. Sospendere delicatamente il pellet in un millilitro di DMEM integrato con 10%FBS e conservarlo a meno 80 gradi Celsius.
Semina 6 milioni di cellule staminali tumorali gastriche o GCSC in una piastra di Petri da 100 millimetri con 10 millilitri di DMEM integrati con FBS al 10%. Coltura delle cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, aspirare il mezzo dal piatto e aggiungere le particelle lentivirali concentrate diluite con quattro millimetri di mezzo DMEM completo, contenenti reagente di Polibrene.
Riportare le cellule nell'incubatrice per 18 ore. Il polibrene deve essere testato in diverse condizioni per determinare la concentrazione effettiva, che di solito è nell'intervallo da due a 10 milligrammi per millilitro. Dopo 18 ore, sostituire il mezzo con 10 millilitri di DMEM con 10%FBS e riportare le cellule nell'incubatrice per 24 ore.
Quindi, aspirare il supernatante con i detriti cellulari e aggiungere DMEM fresco integrato con 10%FBS e 2,5 microgrammi per millilitro di Puromicina. Incubare le cellule per altre 24 ore. Quindi, cambiare nuovamente il mezzo in DMEM fresco integrato con 10%FBS e cinque microgrammi per millilitro Puromicina.
Dopo un'altra incubazione 24 ore su 24, sciacquare due volte i GCSC aderenti con cinque millilitri di DPBS senza calcio e magnesio. Dissociare le cellule con un millilitro di soluzione di dissociazione cellulare pre-riscaldata e incubarle per due o tre minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere cinque millilitri di mezzo di coltura completo GCSC fresco pre-riscaldato alla sospensione cellulare.
Erogare tre millilitri di questa sospensione in un tubo di centrifuga da 15 millilitri per la crioconservazione e gli altri tre millilitri in un altro tubo per l'induzione con doxiciclina. Centrifuga entrambi i tubi a 800 volte G per cinque minuti. Quindi, aspirare il supernatante dal tubo B e sospendere di nuovo le cellule in un millilitro di mezzo di coltura completo GCSC fresco preri warmed.
Semina un numero appropriato di cellule in una nuova piastra di Petri da 100 millimetri con 10 millilitri di mezzo di coltura completo GCSC preri warmed fresco e 2,5 microgrammi per doxiciclina millilitro. Quindi, incubare il piatto per 48 ore. Utilizzare un contatore di celle automatizzato per determinare la densità di un campione di cellule da 10 microliter.
Quindi, regolare il volume con un mezzo di coltura completo GCSC pre-riscaldato per ottenere una concentrazione di 20.000 cellule vitali per millilitro. Erogare 100 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una nuova piastra di coltura a 96 punti di attacco ultra bassa. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
La formazione della sfera dovrebbe avvenire entro tre o 10 giorni. Immagine della formazione della sfera tumorale ogni due giorni. Le cellule staminali del cancro gastrico dell'adenocarcinoma gastrico umano primario sono state coltivate in un mezzo di coltura privo di siero.
Dopo sei giorni, le celle si espansero dal fenotipo a singola cella a sfere di grandi dimensioni. Per valutare la funzione della clusterina nei GCSC, le sequenze di RNA a tornante corto contro il clusterina sono state clonate nel vettore Tet-GV307-RFP-Puro. Le cellule trasfette con il vettore di espressione sono state trattate con doxiciclina per 48 ore.
Quindi, l'espressione della clusterina è stata verificata dalla macchia occidentale e quantificata dalla densitometria. La presenza di doxiciclina e il knockdown della clusterina nei GCSC hanno inibito la formazione di sfere tumorali. Mentre non è stata osservata alcuna inibizione della formazione di sfere tumorali nelle cellule trasdotto con i controlli strapazzati dell'shRNA, indicando che la doxiciclina da sola non ha inibito la formazione della sfera tumorale.
Questi risultati suggeriscono che dopo il silenziamento del clusterin, i GCSC crescono lentamente e non possono formare sfere tumorali. Sulla base di questi dati, la clusterina svolge un ruolo fondamentale nel promuovere l'attività di auto-rinnovamento dei GCSC, indicando che potrebbe essere un promettente obiettivo farmacologico per la soppressione delle cellule staminali tumorali nei pazienti con cancro gastrico. Le sfere tumorali dovrebbero essere solide strutture rotonde su cellule individuali o aggregate, non dovrebbero essere considerate sfere tumorali.
Tuttavia, alcune cellule staminali tumorali potrebbero non formare strutture tipiche della sfera tumorale. Questa procedura può essere seguita con altri metodi per esaminare le cellule staminali tumorali per il potenziale rinnovabile in vitro. Ad esempio, è possibile studiare l'espressione di marcatori correlati alla stelo.
Il protocollo può essere esteso per studiare le funzioni dei geni critici nelle cellule staminali tumorali come la staminali sulla sopravvivenza.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un disegno sperimentale che utilizza un sistema di knockdown condizionale e un test di formazione di sfere adattato per studiare l'effetto del clusterin sulla stemness delle GCSC derivate da pazienti. Può essere facilmente adattato sia per studi in vitro che in vivo di geni associati alla stemness in vari tipi di cellule staminali cancerose.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Biologia del cancro
- Ricerca sulle cellule staminali
- Analisi della funzione genica
Sfondo
- Le cellule staminali cancerose (CSC) contribuiscono alla recidiva e alla metastasi del cancro.
- Comprendere il ruolo di specifici geni nelle CSC è cruciale per sviluppare terapie mirate.
- Questo protocollo si concentra sul gene clusterin e il suo impatto sulla stemness.
- Il metodo permette un'applicazione flessibile in diversi tipi di cancro.
Obiettivo dello studio
- Indagare il ruolo del clusterin nella stemness delle GCSC derivate da pazienti.
- Fornire un metodo affidabile per studiare i geni associati alla stemness.
- Migliorare la comprensione della biologia delle CSC e dei potenziali bersagli terapeutici.
Metodi utilizzati
- Sistema di knockdown condizionale per il silenziamento genico.
- Test di formazione di sfere adattato per valutare la stemness.
- Disegni sperimentali in vitro e in vivo.
- Uso di particelle lentivirali per la consegna genica.
Risultati principali
- Ha dimostrato la procedura per generare particelle di lentivirus.
- Ha fornito approfondimenti sugli effetti del clusterin sulle GCSC.
- Ha mostrato l'adattabilità del metodo per vari tipi di CSC.
- Ha evidenziato l'importanza di studiare i geni associati alla stemness.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per studiare il ruolo del clusterin nelle cellule staminali cancerose.
- Può essere adattato per diversi tipi di cellule staminali cancerose.
- Questa ricerca potrebbe portare a nuove intuizioni nelle strategie di trattamento del cancro.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of stemness-associated genes in patient-derived gastric cancer stem cells, supporting target validation in oncology discovery. By combining conditional knockdown with an adapted sphere formation assay, it provides quantitative, reproducible readouts for assessing gene function in cancer stemness pathways. The approach enhances predictive confidence in early-stage target selection and portfolio prioritization for gastric cancer therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking clusterin knockdown to reduced sphere formation, clarifying its role in GCSC self-renewal.
- Operational Value: Enables functional target validation through inducible, reversible gene silencing in a disease-relevant system.
- Predictive Value: Supports preclinical go/no-go decisions by demonstrating that clusterin inhibition impairs tumorigenic potential in vitro.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable sphere formation metrics suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Uses lentiviral delivery and puromycin selection to ensure consistent knockdown efficiency across experiments.
- Scalability: Compatible with 96-well ultra-low attachment plates, enabling parallel testing of multiple genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses patient-derived gastric cancer stem cells, maintaining phenotypic fidelity to human tumor biology.
- Translational Continuity: Bridges in vitro stemness assessment with potential in vivo validation of clusterin as a therapeutic target.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic evidence to prioritize clusterin in preclinical pipelines targeting cancer stem cell-driven relapse and resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling target validation after initial hit identification and before lead optimization in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking gene knockdown to functional stemness outcomes via sphere formation.
- Screening: Generates quantitative, imaging-based readouts that can be automated for compound or genetic suppressor screens.
- Analytics: Enables densitometric analysis of Western blots and sphere quantification for objective comparison of genetic conditions.
- Translational Research: Connects in vitro stemness phenotypes to potential in vivo models through conserved assay adaptability.
- Enterprise Reuse: The conditional knockdown-sphere formation platform is reusable across stemness-associated genes and cancer types beyond gastric cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stemness gene function through inducible, reversible knockdown in primary-derived cells.
- Operational Value: Standardizes stemness assessment via sphere formation, improving inter-lab reproducibility and assay transferability.
- Strategic Value: Increases confidence in target selection by providing causal evidence linking gene suppression to loss of tumorigenic potential.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets like clusterin based on functional validation in patient-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral production, cell culture, and molecular biology techniques including transfection and selection.
- Depends on access to ultra-low attachment plates, automated cell counters, and Western blotting infrastructure for validation.
- Necessitates standardization of doxycycline induction and puromycin selection timing across laboratories for consistent knockdown.
- Requires optimization of polybrene concentration and lentiviral titer for efficient transduction of primary gastric cancer stem cells.
- Limited by the dependency on sphere formation as a stemness readout, which may not capture all stemness phenotypes in heterogeneous cultures.
