Name: Identificazione del recettore della superficie cellulare utilizzando schermi genetici CRISPR/Cas9 su scala genomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Scopri l'identificazione di recettori di superficie cellulare con schermi CRISPR/Cas9 su scala genomica. Questo metodo genetico consente di rilevare interazioni recettore-ligando senza ipotesi preliminari sulla biologia dei recettori.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione Wellcome Trust numero 206194 assegnata alla GJW. Ringraziamo la struttura Cytometry Core: Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson e Christopher Hall per l'aiuto con FACS.

<ol><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+biological+systems%3A+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li>
<li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+intercellular+adhesion%3A+the+importance+of+weak+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transient intercellular adhesion: the importance of weak protein-protein interactions.</a> Trends in Biochemical Sciences. 19 (9), 354-358 (1994).</li>
<li>Wood, L., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+identify+extracellular+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to identify extracellular receptor-ligand interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 56, 28-36 (2019).</li>
<li>Bushell, K. M., Söllner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li>
<li>Visser, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+biochemical+screen+reveals+that+FLRTs+and+Unc5s+mediate+neuronal+subtype+recognition+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina.</a> eLife. 4, e08149(2015).</li>
<li>Özkan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+interactome+of+immunoglobulin+and+LRR+proteins+reveals+receptor-ligand+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks.</a> Cell. 154 (1), 228-239 (2013).</li>
<li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Screen+for+Human+Cytomegalovirus+Identifies+Neuropilin-2+as+a+Central+Viral+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor.</a> Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).</li>
<li>Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juno+is+the+egg+Izumo+receptor+and+is+essential+for+mammalian+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization.</a> Nature. 508 (7497), 483-487 (2014).</li>
<li>Mullican, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFRAL+is+the+receptor+for+GDF15+and+the+ligand+promotes+weight+loss+in+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">GFRAL is the receptor for GDF15 and the ligand promotes weight loss in mice and nonhuman primates.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1150-1157 (2017).</li>
<li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+malaria+is+associated+with+parasite+binding+to+endothelial+protein+C+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Severe malaria is associated with parasite binding to endothelial protein C receptor.</a> Nature. 498 (7455), 502-505 (2013).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+identification+of+ligand-receptor+interactions+on+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct identification of ligand-receptor interactions on living cells and tissues.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 997-1001 (2012).</li>
<li>Sobotzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HATRIC-based+identification+of+receptors+for+orphan+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HATRIC-based identification of receptors for orphan ligands.</a> Nature Communications. 9 (1), 1519(2018).</li>
<li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Gebre, M., Nomburg, J. L., Gewurz, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Genetic+Analysis+of+Virus-Host+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li>
<li>Zotova, A., Zotov, I., Filatov, A., Mazurov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+antigen+specificity+of+a+monoclonal+antibody+using+genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determining antigen specificity of a monoclonal antibody using genome-scale CRISPR-Cas9 knockout library.</a> Journal of Immunological Methods. 439, 8-14 (2016).</li>
<li>Puschnik, A. S., Majzoub, K., Ooi, Y. S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+toolbox+to+study+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR toolbox to study virus-host interactions.</a> Nature Reviews. Microbiology. 15 (6), 351-364 (2017).</li>
<li>Kerr, J. S., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidity-based+extracellular+interaction+screening+%28AVEXIS%29+for+the+scalable+detection+of+low-affinity+extracellular+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Avidity-based extracellular interaction screening (AVEXIS) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3881(2012).</li>
<li>Tzelepis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+Dropout+Screen+Identifies+Genetic+Vulnerabilities+and+Therapeutic+Targets+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia.</a> Cell Reports. 17 (4), 1193-1205 (2016).</li>
<li>Sharma, S., Bartholdson, S. J., Couch, A. C. M., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+cellular+pathways+required+for+cell+surface+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of cellular pathways required for cell surface recognition.</a> Genome Research. 28 (9), 1372-1382 (2018).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+pooled+CRISPR+genetic+screens+using+MAGeCKFlute%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute.</a> Nature Protocols. 14 (3), 756-780 (2019).</li>
<li>R Core team. A language and environment for statistical computing. , http://www.R-project.org (2013).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knockout+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens.</a> G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li>
<li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichr%3A+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W90-W97 (2016).</li>
<li>Crosnier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480 (7378), 534-537 (2011).</li>
<li>Kirk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+is+tightly+associated+with+lactate+transporters+MCT1+and+MCT4+and+facilitates+their+cell+surface+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression.</a> The EMBO Journal. 19 (15), 3896-3904 (2000).</li>
<li>Chong, Z. S., Ohnishi, S., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled+extracellular+receptor-ligand+interaction+screening+using+CRISPR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation.</a> Genome Biology. 19 (1), 205(2018).</li>
<li>van der Meer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Model+Passports-a+hub+for+clinical%2C+genetic+and+functional+datasets+of+preclinical+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell Model Passports-a hub for clinical, genetic and functional datasets of preclinical cancer models.</a> Nucleic Acids Research. 47 (D1), D923-D929 (2019).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric-derived+cell+surface+protein+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.</a> PloS One. 10 (3), e0121314(2015).</li>
<li>Behan, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prioritization+of+cancer+therapeutic+targets+using+CRISPR-Cas9+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens.</a> Nature. 568 (7753), 511-516 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Viene descritta una strategia di screening basata su CRISPR per identificare i geni che codificano i componenti cellulari coinvolti nel riconoscimento cellulare. Un approccio simile che utilizza l'attivazione CRISPR fornisce anche un'alternativa genetica per identificare i recettori che interagiscono direttamente delle proteine ricombinanti senza la necessità di generare grandi librerie proteiche26. Tuttavia, uno dei principali vantaggi di questo approccio è che è applicabile alle interazioni mediate da molecole di superficie originariamente visualizzate sulla cellula e non dipende dalla sovraespressione dei recettori, che può influenzare l'avidità di legame del recettore. A differenza di altri metodi, quindi, questa tecnica non fa supposizioni per quanto riguarda la natura biochimica o la biologia cellulare dei recettori e offre l'opportunità di studiare le interazioni mediate da proteine normalmente difficili da studiare utilizzando approcci biochimici, come proteine molto grandi, o quelli che attraversano la membrana più volte o formano complessi con altre proteine e molecole diverse da proteine come glicani, glicolipidi e fosfoipi. Data la natura della scala genomica del metodo, questo approccio ha anche il vantaggio di identificare non solo il recettore, ma anche componenti cellulari aggiuntivi necessari per l'evento di legame, fornendo così approfondimenti sulla biologia cellulare del recettore.
Una delle principali limitazioni di questo metodo quando lo si utilizza per identificare il recettore di una proteina orfana è il requisito iniziale per identificare prima una linea cellulare che si lega alla proteina. Questo non è sempre facile e identificare una linea cellulare che visualizza un fenotipo vincolante che è anche permissivo agli schermi genetici può essere il passo che limita il tempo per l'implementazione di questo saggio. Alcune linee cellulari tendono a legarsi a più proteine rispetto ad altre. Ciò è particolarmente rilevante per le proteine che legano l'HS, perché queste proteine tendono a legarsi a qualsiasi linea cellulare che visualizza catene laterali HS, indipendentemente dal contesto di legame nativo. Inoltre, abbiamo osservato che l'upregulation dei syndecan (cioè i proteoglicani che contengono HS) nelle linee cellulari porta ad un maggiore legame delle proteine leganti HS26. Questo potrebbe essere un fattore da prendere in considerazione quando si seleziona la linea cellulare per lo screening. Tuttavia, anche importante notare è che il legame additivo di HS non interferisce con il legame a un recettore specifico. Ciò significa che se si osserva l'associazione, è possibile che sia mediata esclusivamente da HS perché l'associazione mediata da HS in questo saggio è additiva piuttosto che codipendente19. In uno scenario di questo tipo, l'approccio di blocco dell'eparina descritto può identificare tali comportamenti senza dover eseguire uno schermo genetico completo.
Una risorsa utile per la scelta delle linee cellulari è Cell Model Passport, che contiene informazioni sulla genomica, la trascrittomica e le condizioni di coltura per le linee cellulari tumorali da 1.000 dollari27. A seconda del contesto biologico, le cellule possono essere scelte in base ai loro profili di espressione. Per facilitare la selezione delle linee cellulari, abbiamo raggruppato 1.000 linee cellulari in Cell Model Passport in base all'espressione di 1.500 dollari di glicoproteine superficiali delle cellule umane preantate28 (Figura supplementare 2; le informazioni sul cluster per ogni linea cellulare insieme alle condizioni di crescita sono fornite nella tabella supplementare 2). Durante il test del legame di una proteina con funzione sconosciuta, è utile selezionare un pannello di linee cellulari rappresentative da ogni cluster per aumentare la possibilità di coprire una vasta gamma di recettori. Data una scelta, si consiglia di scegliere linee cellulari facili da coltura e facili da trasdurare. Poiché queste linee cellulari saranno utilizzate nello screening su scala del genoma, è preferibile che possano essere coltivate facilmente in grandi quantità e siano permissive alla trasduzione lentivirale, perché è il metodo più comunemente disponibile per la consegna di sgRNA per lo screening genetico basato su CRISPR nelle fasi successive.
Generalmente, le selezioni di fenotipi vengono effettuate in un unico tipo. Tuttavia, questo è determinato dalla luminosità della popolazione di cellule macchiate rispetto al controllo. I cicli iterativi delle selezioni potrebbero essere adottati per scenari in cui il rapporto segnale-rumore del fenotipo desiderato è basso, o quando lo scopo dello schermo è quello di identificare mutanti con fenotipi forti. Quando si utilizza un approccio di selezione iterativa per schermi basati su FACS, è importante considerare che il processo di ordinamento può causare la morte delle cellule, principalmente a causa della pura forza della selezionatrice. Pertanto, non tutte le celle raccolte saranno rappresentate nel prossimo ciclo di ordinamento.
La complessità della biblioteca è un fattore molto importante nell'esecuzione di schermi genetici di successo, soprattutto per schermi di selezione negativi perché l'entità dell'esaurimento in questi può essere determinata solo confrontando i risultati con quelli che erano presenti nella libreria di partenza. Per le schermate di selezione negativa, è comune mantenere librerie di complessità 500-1.000. Le schermate di selezione positive, tuttavia, sono più robuste alle dimensioni delle librerie, perché in tali schermi solo un piccolo numero di mutanti dovrebbe essere selezionato per un particolare fenotipo. Pertanto, nella schermata di selezione positiva descritta di seguito, le dimensioni della libreria possono essere ridotte a una complessità di 50-100 volte senza compromettere la qualità dello schermo. Inoltre, in queste schermate è anche possibile utilizzare una libreria di controlli per una determinata linea cellulare in un determinato giorno come "controllo generale" per tutti i campioni ordinati nel giorno per quella determinata linea cellulare. In questo modo si riduce il numero di librerie di controllo che devono essere prodotte e sequenziate.
Un'altra considerazione importante per l'utilizzo di questo approccio sono i limiti degli schermi di perdita di funzione nell'identificazione dei geni essenziali per la crescita delle cellule in vitro. La tempistica degli schermi è cruciale a questo proposito, poiché più a lungo le cellule mutanti sono mantenute in coltura, maggiore è la probabilità che le cellule con mutazioni nei geni essenziali diventino non vitali e non siano più rappresentate nella libreria dei mutanti. I recenti screening genetici eseguiti nell'ambito dell'iniziativa Project Score in oltre 300 linee cellulari mostrano che più geni nella secrezione proteica con annotato da KEGG e nel percorso di glicosilazione N sono spesso identificati come essenziali per un certo numero di linee cellulari (Supplementary Figure 3)29. Questo può essere preso in considerazione quando si progettano schermi se l'effetto dei geni necessari per la proliferazione e la vitalità deve essere studiato nel contesto del processo di riconoscimento cellulare. In questo caso, l'esecuzione di schermi in un momento precoce (ad esempio, giorno 9 posttraduzione) sarebbe generalmente appropriato. Tuttavia, se l'approccio viene utilizzato per identificare alcuni obiettivi con effetti di dimensioni forti anziché percorsi cellulari generali, potrebbe essere opportuno eseguire schermi in un momento successivo (ad esempio, giorno 15-16 posttrasduzione).
I risultati dello screening sono molto robusti; in otto schermi di legame proteico ricombinanti eseguiti in passato, il recettore della superficie cellulare è stato il colpo più alto in ogni caso19. Quando si utilizza questo approccio per identificare il partner di interazione, ci si dovrebbe quindi aspettare che il recettore e i fattori che contribuiscono alla sua presentazione sulla superficie siano identificati con un'elevata fiducia statistica. Una volta eseguito lo schermo e convalidato un colpo utilizzando un singolo knockout di gRNA, è possibile eseguire ulteriori follow-up utilizzando metodi biochimici esistenti come AVEXIS4 e legame saturable diretto di proteine purificate utilizzando la risonanza del plasmone superficiale. L'approccio qui descritto è applicabile a tutte le proteine per le quali è possibile generare una sonda di legame ricombinante solubile.
In sintesi, questo è un approccio knockout CRISPR su scala genomica per identificare le interazioni mediate dalle proteine della superficie cellulare. Questo metodo è generalmente applicabile per identificare le vie cellulari necessarie per il riconoscimento della superficie cellulare in una vasta gamma di contesti biologici diversi, tra cui le cellule proprie di un organismo (ad esempio, il riconoscimento neurale e immunologico), nonché tra le cellule ospiti e le proteine patogene. Questo metodo fornisce un'alternativa genetica agli approcci biochimici progettati per l'identificazione dei recettori, e poiché non richiede alcuna ipotesi preliminare per quanto riguarda la natura biochimica o la biologia cellulare dei recettori ha un grande potenziale per fare scoperte completamente inaspettate.

Le interazioni extracellulari delle proteine del recettore della superficie cellulare dirigono importanti processi biologici come l'organizzazione dei tessuti, il riconoscimento ospite-patogeno e la regolazione immunitaria. Lo studio di queste interazioni è di interesse per la comunità biomedica più ampia, perché i recettori della membrana sono obiettivi utilizzabili di terapie sistematicamente consegnate come gli anticorpi monoclonali. Nonostante la loro importanza, lo studio di queste interazioni rimane tecnicamente impegnativo. Ciò è dovuto principalmente al fatto che i recettori incorporati nella membrana sono anfipatici, rendendoli difficili da isolare dalle membrane biologiche per la manipolazione biochimica, e le loro interazioni sono caratterizzate dalle affinità di interazione deboli (KDs nella gamma M-MM)1. Di conseguenza, molti metodi comunemente utilizzati non sono adatti a rilevare questa classe di interazioni proteiche1,2.
È stata sviluppata una serie di metodi per studiare specificamente le interazioni recettore-ligando extracellulare che prendono in considerazione le loro proprietà biochimiche uniche3 . Alcuni di questi approcci prevedono l'espressione dell'intero ectodominio di un recettore come proteina ricombinante solubile nei sistemi basati su mammiferi o cellule di insetti per garantire che queste proteine contengano modifiche post-traduzionali strutturalmente importanti, come glicani e legami disulfide. Per superare l'associazione a bassa affinità, gli ectodomains sono spesso oligomerizzati per aumentare la loro avidità vincolante. Gli ectoscopi delle proteine avide sono stati utilizzati con successo come sonde di legame per identificare i partner di interazione negli schermi di interazione proteina-proteina ricombinanti diretti4,5,6,7.7 Anche se ampiamente riusciti, i metodi a base di proteine ricombinanti richiedono che l'ectodominio di un recettore della membrana sia prodotto come proteina solubile. Pertanto, è generalmente applicabile solo alle proteine che contengono una regione extracellulare contigua (ad esempio, tipo i, tipo II o ancoraggio gpI) e non è generalmente adatto per i complessi recettori alpinisti e le proteine della membrana che si estendono più volte sulla membrana.
Tecniche di clonazione dell'espressione in cui una libreria di DNA complementari (cDANA) viene trasinfezione in cellule e testata per un fenotipo di guadagno-di-legante sono state utilizzate anche per identificare le interazioni extracellulari-proteine8. La disponibilità di grandi collezioni di plasmidi di espressione cDNA clonati e in sequenza negli ultimi anni ha facilitato metodi in cui le linee cellulari che sovraesprimono i cDNA che codificano i recettori della superficie cellulare vengono sottoposte a screening per l'associazione di proteine ricombinanti per identificare le interazioni9,10. Gli approcci basati sulla sovraespressione del cDNA, a differenza dei metodi ricombinanti basati sulle proteine, offrono la possibilità di identificare le interazioni nel contesto della membrana plasmatica. Tuttavia, il successo dell'utilizzo di costrutti di espressione cDNA dipende dalla capacità delle cellule di sovraesprimere la proteina nella forma correttamente piegata, ma questo spesso richiede fattori accessori cellulari come trasportatori, chaperones e corretto assemblaggio oligomerico. Tradurre un singolo cDNA potrebbe quindi non essere sufficiente per ottenere l'espressione della superficie cellulare.
Le tecniche di screening con costrutti cDNA o sonde proteiche ricombinanti sono ad alta intensità di risorse e richiedono grandi raccolte di cDNA o librerie proteiche ricombinanti. I metodi basati sulla spettrometria di massa specificamente progettati sono stati utilizzati di recente per identificare le interazioni extracellulari che non richiedono l'assemblaggio di grandi librerie. Tuttavia, queste tecniche richiedono la manipolazione chimica della superficie cellulare, che può alterare la natura biochimica delle molecole presenti sulla superficie delle cellule e sono attualmente applicabili solo alle interazioni mediate dalle proteine glicosillate11,12. La maggior parte dei metodi attualmente disponibili si concentra anche pesantemente sulle interazioni tra le proteine, ignorando in gran parte il contributo del microambiente della membrana, comprese molecole come glicani, lipidi e colesterolo.
Il recente sviluppo di un targeting bialleleico altamente efficiente utilizzando approcci basati su CRISPR ha permesso a librerie su scala genomica di cellule prive di geni definiti in un unico pool che possono essere esaminati in modo sistematico e imparziale per identificare i componenti cellulari coinvolti in contesti diversi, tra cui sezionare i processi di segnalazione cellulare, l'identificazione di perturbazioni che conferiscono resistenza a farmaci, tossine e patogeni, e determinare la specificità degli anticorpi13,14,15,16. Qui, descriviamo un test dello screening delle cellule a eliminazione di knockout basato su CRISPR su scala genomica che fornisce un'alternativa agli attuali approcci biochimici per identificare le interazioni recettore-ligando extracellulari. Questo approccio di identificazione delle interazioni mediate dai recettori della membrana da parte dei recettori genetici è particolarmente adatto per i ricercatori che hanno un interesse mirato sui singoli ligandi perché evita la necessità di compilare grandi librerie di cDNA o proteine ricombinanti.
Questo saggio è costituito da tre passaggi principali: 1) Le sonde di legame proteico ricombinante altamente accanite costituite dalle regioni extracellulari di un recettore di interesse sono prodotte e utilizzate nei saggi di legame basati sulla citometria del flusso a fluorescenza; 2) I saggi vincolanti vengono utilizzati per identificare una linea cellulare che esprime il partner di interazione della sonda proteica ricombinante; 3) Viene prodotta una versione che esprime Cas9 della linea cellulare che interagisce con la proteina di interesse e viene eseguita una schermata di knockout basata su genomica CRISPR/Cas9 (Figura 1). In questo screening genetico, il legame di una proteina ricombinante alle linee cellulari viene utilizzato come fenotipo misurabile in cui le cellule all'interno della libreria knockout che hanno perso la capacità di legare la sonda vengono ordinate utilizzando lo smistamento cellulare attivato basato sulla fluorescenza (FACS) e i geni che hanno causato la perdita del fenotipo legante identificato dal sequenziamento. In linea di principio, vengono identificati i geni che codificano il recettore responsabile del legame della sonda avida e quelli necessari per il suo display di superficie cellulare.
Il primo passo di questo protocollo prevede la produzione di acconde proteiche ricombinanti accanite che rappresentano l'ectodominio dei recettori legati alla membrana. Questi recettori sono noti per mantenere frequentemente le loro funzioni di legame extracellulare quando i loro ectodomini sono espressi come una proteina solubile ricombinante1. Per una proteina di interesse, le proteine ricombinanti solubili possono essere prodotte in qualsiasi sistema di espressione proteica eucariotica adatto in qualsiasi formato a condizione che possa essere oligomerizzato per una maggiore avidità vincolante e contiene tag che possono essere utilizzati nei saggi di legame basati sulla citometria basata sulla flutura (ad esempio, tag FLAG, biotina-tag). Protocolli dettagliati per la produzione di ectodomains solubili di recettori della membrana utilizzando il sistema di espressione proteica HEK293, così come diverse tecniche di multimerizzazione e costrutti di espressione proteica per la produzione di proteine penameriche e proteine monomeriche sono stati precedentemente descritti1,17. Il protocollo qui descriverà i passaggi per generare sonde avide fluorescenti da proteine biopoiriche monomeriche coniugandole a streptavidina coniugate a un fluorocro (ad esempio, ficoerythrin, o PE), che può essere utilizzato direttamente nei testdi di legame cellulare e ha il vantaggio di non richiedere un anticorpo secondario per il rilevamento. Sono già stati descritti protocolli generali per l'esecuzione di schermi su scala genomica20,21, quindi il protocollo si concentra principalmente sulle specifiche dell'esecuzione di schermi di legame proteico ricombinanti basati sulla citometria a flusso utilizzando il sistema di screening a eliminazione diretta CRISPR/Cas9 utilizzando la libreria Human V1 ("Yusa")18.

<table><tbody><tr><td>Anti-topo fosfatasi alcalina</td><td>Sigma</td><td>A4656</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Chem-Cruz</td><td>SC-204655</td><td></td></tr><tr><td>Sangue & Maxi Kit DNA per colture cellulari</td><td>Qiagen</td><td>13362</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dietanolammina</td><td>Sigma</td><td>398179</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Kit Sangue e Tessuti</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T confezione cellule</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina LTX con reagente PLUS</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare MoFlo XDP</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni2+-NTA perle di agarosio</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-501-25</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo OX-68</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>p-nitrofenil fosfato</td><td>Sigma</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Colonne di desalinizzazione</td><td>GE healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polipropilene con volume del letto di 5 mL</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K, ricombinante, grado PCR Roche</td><td></td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start ad alta fedeltà 2&times; Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Filtro SCFA</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore</td><td></td><td></td><td></td>cellulare Sony</tr><tr><td>Perline SPRI Sony (perline Agencourt AMPure XP)</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per microtitolazione rivestite di streptavidina</td><td>Nalgene</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina-PE</td><td>Biolegend</td><td>405204</td><td></td></tr></tbody></table>

identificazione del recettore della superficie cellulare utilizzando schermi genetici crispr/cas9 su scala genomica

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

La comunicazione intercellulare mediata da interazioni dirette tra i recettori della superficie cellulare incorporati nella membrana è fondamentale per il normale sviluppo e funzionamento degli organismi multicellulari. Tuttavia, il rilevamento di queste interazioni rimane tecnicamente impegnativo. Questo manoscritto descrive un approccio sistematico di screening genetico CRISPR/Cas9 su scala genomica che rivela i percorsi cellulari necessari per eventi specifici di riconoscimento della superficie cellulare. Questo saggio utilizza proteine ricombinanti prodotte in un sistema di espressione proteica dei mammiferi come acconde di legame avido per identificare i partner di interazione in uno schermo genetico basato sulle cellule. Questo metodo può essere utilizzato per identificare i geni necessari per le interazioni della superficie cellulare rilevate dalle sonde di legame ricombinanti corrispondenti agli ectodomini dei recettori incorporati nella membrana. È importante sottolineare che, data la natura su scala del genoma di questo approccio, ha anche il vantaggio di identificare non solo il recettore diretto, ma anche i componenti cellulari necessari per la presentazione del recettore sulla superficie cellulare, fornendo così preziose informazioni sulla biologia del recettore.

Questo manoscritto descrive un approccio di screening basato sulle cellule su scala genomica per identificare le interazioni recettore-ligando extracellulari.

Identificazione del recettore della superficie cellulare utilizzando schermi genetici CRISPR/Cas9 su scala genomica

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

Il rilevamento delle interazioni tra superfici cellulari utilizzando approcci biochimici attualmente disponibili pone ancora sfide tecniche. Questo protocollo fornisce un'alternativa genetica utilizzando l'approccio di screening cellulare su scala genomica per identificare le interazioni del ligando recettore sulla superficie cellulare. A differenza della maggior parte degli altri metodi esistenti, questo metodo non fa ipotesi riguardo alla biologia dei recettori.Fornisce l'opportunità di identificare le interazioni mediate da una vasta gamma di molecole di superficie cellulare. Le molecole di superficie cellulare sono direttamente accessibili a farmaci come gli anticorpi monoclonali. Pertanto, l'identificazione delle interazioni mediate da queste molecole può avere importanti implicazioni terapeutiche.Questo metodo è generalmente applicabile ai ricercatori interessati ad esplorare i processi di segnalazione e riconoscimento cellulare in una vasta gamma di contesti biologici, comprese le interazioni neurali e immunologiche e le interazioni patogene ospiti. Il protocollo richiede una macchina di smistamento delle celle ad alta velocità effettiva e macchine di sequenziamento di nuova generazione. Assicurarsi che queste strutture siano disponibili prima di avviare il protocollo.Iniziare effettuando otto diluizioni seriali dei campioni di proteine biotinilate in una piastra da 96 porri garantendo che il volume finale di ogni diluizione sia di almeno 200 microlitri e che sia incluso un controllo solo tag. Creare una piastra duplicata dei campioni rimuovendo 100 microlitri da ogni pozzo e trasferendolo in una nuova piastra da 96 porri. Includere un controllo proteico solo tag che verrà utilizzato come sonda di controllo in tutti i saggi di associazione.Aggiungere 100 microlitri da 0,1 microgrammi per millilitro streptavidin-PE ai pozzi di una delle piastre e 100 microlitri di tampone di diluizione ai pozzi dell'altra piastra. Incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, bloccare i pozzi della piastra codificata con streptavidina con il tampone di diluizione per 15 minuti.Dopo aver lavato il piatto, assicurarsi che sia asciutto. Quindi trasferire il volume totale del campione da entrambe le piastre ai singoli pozzi della piastra codificata streptavidina e incubarlo per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare la piastra tre volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio.Aggiungere 100 microlitri di Topo anti-ratto Cd4d3+4 IgG E incubare la piastra per un'altra ora. Ripeti i lavaggi. Aggiungere 100 microlitri di un coniugato di fosfatasi alcalina anti-topo e lasciare la piastra a temperatura ambiente per un'ora.Quindi lavare i pozzi tre volte con tampone di lavaggio e una volta con tampone di diluizione. Preparare il fosfato p-nitrofenile a un milligrammo per millilitro nel tampone di etanolammina colorante e aggiungere 100 microlitri ad ogni pozzo. Dopo un'incubazione di 15 minuti, misurare l'assorbanza hanno ciascuno bene a 405 nanometri.Utilizzare la diluizione minima alla quale non c'è segnale sulla piastra come fattore di diluizione appropriato per creare tetrameri. Incubare la streptavidina-PE e l'appropriata diluizione proteica biotinilata per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi conservare le proteine coniugate in un tubo protetto dalla luce a quattro gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo.Ruotare i tubi conici con i campioni trattati e controllare a 200 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e congelare uno dei tubi a meno 20 gradi Celsius per un uso successivo. Sospendere di nuovo il pellet nell'altro tubo in 10 millilitri di PBS con 1%BSA e mettere da parte 100 microlitri di cellule come controllo negativo su una piastra da 96 pompoli.Quindi aggiungere la proteina ricombinante pre-coniugata alla sospensione cellulare nel tubo conico e nella piastra a 96 po '. Eseguire la colorazione cellulare per almeno un'ora a quattro gradi Celsius su un rotore da banco con una rotazione delicata. Quindi pellettare le cellule a 200 volte G per cinque minuti e rimuovere il supernatante.Dopo aver lavato le cellule due volte, sospenderle in cinque millilitri di PBS. Filtrare le cellule attraverso un colino di 30 micrometri per rimuovere i cluster cellulari. Quindi analizzali con un flusso Sodor.Utilizzare il campione di controllo negativo per gate per le celle positive bfp e pe negative. Quindi ordinare il campione e raccogliere da 500.000 a 1 milione di cellule positive e PE negative BFP in un tubo di centrifugazione da 1,5 millilitri. La gabbia dolorante dipenderà dal legame delle cellule con la proteina, ma normalmente vengono raccolti uno-5% dei campioni negativi di PE.Ora lasciare che le cellule ordinate centrifughino per 500 volte G per cinque minuti, quindi rimuovere con cura il supernatante. Il pellet può essere conservato a meno 20 gradi Celsius per un massimo di sei mesi. Utilizzare la funzione conteggio della magia per mappare le sequenze dalla popolazione non ordinata e ordinata alla libreria di riferimento, che produrrà un file di conteggio non elaborati.Eseguire la funzione di test della magia utilizzando conteggi non elaborati dal campione di controllo non ordinato come controllo e i conteggi dal campione ordinato come trattamento. Aprire il file di riepilogo genico generato e classificare la colonna della classificazione di pausa in ordine crescente. Identificare quindi i riscontri con un tasso di individuazione falso inferiore al punto 0.05.Il recettore è solitamente classificato molto spesso in prima posizione. Infine utilizzare R o un software equivalente per tracciare il robusto punteggio dell'algoritmo di classificazione per la selezione positiva. Gli schermi di abbattimento su scala genomica per l'identificazione del partner legante del TNFSF9 umano e del P falciparum o H5 del TNFSF9 umano e del P falciparum Rh5 sono stati eseguiti rispettivamente nelle cellule NCI-SNU-1 e HEC-293.Il comportamento di legame di Rh5 è stato influenzato sia dal solfato eparano che dal suo noto recettore BSG, mentre il TN-FRSF-9 non ha perso il legame con il suo noto recettore TN-FSF-9. Dopo la pre-incubazione con eparina solubile. La distribuzione GNA nella libreria mutante di controllo rivelò che la complessità della biblioteca fu mantenuta per tutto il corso dell'esperimento.La qualità tecnica degli schermi è stata valutata esaminando la distribuzione dei cambiamenti di piegatura osservati del G-RNA mirati a un insieme di riferimento di geni non essenziali, rispetto alla distribuzione per un insieme di riferimento di geni essenziali. Inoltre, l'arricchimento a livello di percorso ha rivelato che i percorsi essenziali previsti sono stati identificati e significativamente arricchiti nella popolazione di abbandono scolastico. Quando si confronta il campione di controllo con la libreria plasmide originale.Il robusto algoritmo di classificazione o RRA-score fornisce una misura di cui i G-RNA sono costantemente classificati più in alto del previsto. Nella schermata di TNFRSF9, il colpo più alto è stato TNFSF9, che è un partner di binding noto. Inoltre, sono stati identificati anche un certo numero di geni legati alla via TP53.Nel caso di RH5, oltre al recettore noto e al gene richiesto per la produzione di gag solfate, è stato identificato anche il gene SLC16A1. L'approccio di screening è di solito molto robusto e il recettore interagente direttamente dovrebbe essere altamente classificato nella lista dei geni arricchiti in questo ordine di popolazione. È fondamentale convalidare i risultati ottenuti dallo schermo.Se l'interazione è mediata da proteine, gli approcci biochimici progettati per studiare le interazioni binarie delle proteine proteiche, ad esempio, potrebbero essere utilizzati per ulteriori studi di convalida. A causa della natura imparziale della scala genomica di questo approccio, prevediamo che aii contribuirà ad esplorare le interazioni mediate da molecole cellulari difficili da studiare come lipidi, proteine della membrana multipass e glicani. Può anche rivelare nuovi percorsi necessari per il traffico di recettori e la biologia.

cell-surface-receptor-identification-using-genome-scale-crisprcas9

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

La tecnica qui descritta genotipizzazione, che accoppia fluorescente reazione a catena della polimerasi (PCR) per elettroforesi su gel capillare, permette high-throughput genotipizzazione di cloni knockout nucleasi-mediata. Elude limitazioni incontrate da altre tecniche di genotipizzazione ed è più conveniente rispetto ai metodi di sequenziamento.

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per progettare e realizzare targeting multiplex di esaltatori con la proteina di fusione disattivazione SID4X-dCas9-KRAB, noto anche come interferenza di enhancer (Enhancer-i). Questo protocollo consente l'identificazione dei rinforzatori che regolano l'espressione genica e facilita la dissezione delle relazioni tra esaltatori di un gene bersaglio comune di regolazione.

Dissezione della funzione Enhancer usando Multiplex basati su CRISPR Enhancer interferenze nelle linee cellulari

Qui, presentiamo un protocollo per ottimizzare CRISPR-Cas9 per ottenere una maggiore specificità senza la perdita di attività sul bersaglio. Utilizziamo un approccio diretto evoluzione chiamato Sniper-schermo per trovare un mutante Cas9 con le caratteristiche desiderate. Cecchino-Cas9 è compatibile con tronco singolo-guida RNAs e consegna in un formato della ribonucleoproteina, ben note strategie per conseguire maggiore specificità.

Utilizzando il cecchino-Cas9 a minimizzare gli effetti di fuori bersaglio di CRISPR-Cas9 senza la perdita di attività On-target tramite Evolution diretto

Una libreria CRISPR/sgRNA è stata applicata a interrogare i geni di proteina-codificazione. Tuttavia, la fattibilità di una libreria di sgRNA per scoprire la funzione di un confine CTCF nella regolazione genica rimane inesplorata. Qui, descriviamo una raccolta di specifiche sgRNA loci HOX per delucidare la funzione dei confini CTCF in loci HOX .

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca Screening identificazione critico CTCF confini

La tecnologia CRISPR-Cas9 fornisce un metodo efficiente per modificare con precisione il genoma dei mammiferi in qualsiasi tipo di cellula e rappresenta un nuovo mezzo per eseguire schermi genetici a livello di genoma. Qui viene fornito un protocollo dettagliato che illustra i passaggi necessari per il successo delle prestazioni degli schermi CRISPR-Cas9 a livello di genoma raggruppato.

Schermi genetici basati su CRISPR in cellule mammaliane

La Biotinilazione potenziata per illuminazione limitata a posizione specifica AviTag (ALIBi) è un nuovo metodo optogeneticamente attivato sviluppato per il marcatore e la purificazione di affinità delle popolazioni subcellulari di ribosomi per sequenziamento a valle e analisi proteomiche.

Isolamento delle sottopopolazioni subcellulari di ribosomi basato su biotinilazione potenziata da illuminazione limitata da tag peptidico ricombinante specifico per peptidi

Un ostacolo significativo a tecnologie come CRISPR sono gli eventi fuori bersaglio che possono interrompere i geni vitali. CIRCLE-seq ("Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing") è una tecnica progettata per identificare i siti di scissione non intenzionali. Questo metodo mappa l'attività dell'intero genoma di CRISPR-Cas9 con alta sensibilità e senza bias.

CIRCLE-Seq per l'interrogazione dell'editing genetico off-target

L'articolo descrive un protocollo per l'applicazione di un modello in vitro per l'esaurimento per completare uno screening CRISPR knockout per l'intero genoma in cellule T del recettore dell'antigene chimerico del donatore sano.

Esecuzione di uno screening CRISPR knockout in vitro a livello di genoma in cellule T del recettore dell'antigene chimerico

Qui, presentiamo un protocollo che integra la tecnologia CRISPR/Cas9 con il saggio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) per identificare i geni candidati che sono cruciali per l'anomala capacità proliferativa delle cellule staminali ematopoietiche e delle cellule progenitrici.

Valutazione dei geni correlati alla crescita anormale di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche combinando la tecnologia CRISPR/Cas9 con il conteggio delle cellule

Viene fornito un approccio meticoloso e strutturato per selezionare geni resistenti e sensibili alle radiazioni attraverso l'applicazione di un metodo di screening CRISPR/Cas9 per l'intero genoma. Questo protocollo ha anche il potenziale per fungere da quadro versatile per altri sforzi di ricerca che studiano i meccanismi di resistenza ai farmaci chimici somministrati clinicamente.

Screening CRISPR a livello di genoma per svelare geni radiosensibili e radioresistenti

Abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato di screening knockout CRISPR-Cas9 per le cellule CAR T primarie. Riducendo il trasferimento del gDNA tramite la digestione enzimatica e il pulldown delle cassette sgRNA, questo approccio minimizza gli artefatti PCR, garantendo una rilevazione accurata degli sgRNA e un'identificazione robusta dei bersagli genici funzionali.

Migliorare gli schermi CRISPR-Cas9 nelle cellule CAR T: un metodo raffinato per la preparazione delle librerie

Scopri l'identificazione di recettori di superficie cellulare con schermi CRISPR/Cas9 su scala genomica. Questo metodo genetico consente di rilevare interazioni recettore-ligando senza ipotesi preliminari sulla biologia dei recettori.

Identificazione del recettore della superficie cellulare utilizzando schermi genetici CRISPR/Cas9 su scala genomica

Esplora altri video