Identificazione ad alto contenuto di velocità effettiva della resistenza a Pseudomonas syringae pv. Pomodoro nel pomodoro utilizzando Seedling Flood Assay
10 marzo 2020
Il saggio sull'alluvione delle piantine facilita lo screening rapido delle adesioni di pomodoro selvatico per la resistenza al batterio delle siringhe Pseudomonas. Questo test, utilizzato in combinazione con il test della crescita batterica delle piantine, può aiutare a caratterizzare ulteriormente la resistenza sottostante al batterio e può essere utilizzato per lo screening delle popolazioni di mappatura per determinare la base genetica della resistenza.
Questo protocollo ad alta produttività consente un rapido screening delle piantine di pomodoro dalle adesioni selvatiche all'agente patogeno batterico Pseudomonas syringae. Il test di alluvione delle piantine riduce al minimo i tempi di crescita delle piante e le esigenze della camera di crescita, consente un rapido turnover delle piante e consente di testare campioni di grandi dimensioni. Questo saggio è un potente strumento che può essere utilizzato per migliorare la resistenza nelle adesioni selvagge e in altre linee con background genetici complessi.
Il protocollo fornisce indicazioni specifiche per l'innocuazione delle inondazioni di due ceppi pseudomonas siringae. Tuttavia, è versatile e può essere modificato per rilevare la resistenza dell'ospite ad altri agenti patogeni batterici. A dimostrare la procedura sarà Yana Hasan, specialista di ricerca nel mio laboratorio.
Inizia coltivando le piantine di pomodoro. Posizionare i semi di pomodoro in un tubo di microcentrifugo da 2,2 millilitri e aggiungere due millilitri di soluzione di candeggina al 50%. Scuotere il tubo per 25 minuti, quindi rimuovere la soluzione di candeggina con una pipetta.
Aggiungere due millilitri di acqua ultra pura e lavare i semi invertendo il tubo cinque volte. Aspirare il liquido dal tubo e ripetere il lavaggio altre quattro volte. Dopo il lavaggio finale, aggiungere due millilitri di acqua ultra pura e versare i semi in una piastra di Petri sterile.
Sterilizzare le forcep fenicotteri in etanolo, quindi usarle per trasferire da cinque a sette semi su una piastra da 100 per 25 millilitri con 0,5 XMS più 0,8% di supporto di agar. Sigillare i bordi della piastra con nastro chirurgico. Assicurarsi che le piastre siano impilate piatte e a faccia in su.
Stratificare i semi sterilizzati a quattro gradi Celsius al buio per almeno tre giorni per sincronizzare la germinazione. Dopo tre giorni, orientare verticalmente le piastre in modo che le radici crescano lungo la superficie del piatto e la linea dei semi sia orientata orizzontalmente. Trasferire i semi in una camera di crescita impostata su 22 gradi Celsius con un ciclo scuro di 16 ore di luce e 8 ore.
Far crescere le piantine per dieci giorni nella camera, a quel punto in genere esicheranno cotyledon completamente emersi ed espansi e prime foglie vere emergenti. Striati batteri freschi sull'agar KB appropriato con uno stuzzicadenti piatto e sterile. Per PstT1, incubare la piastra a 28 gradi Celsius per 48 ore prima di utilizzare i batteri nell'esperimento di alluvione.
Per preparare l'inoculo, resopend aseticamente i batteri in sterile, dieci cloruri di magnesio millimolare ad una densità ottica di 0,1. Quindi effettuare due diluizioni seriali per ottenere una concentrazione di lavoro con un OD600 di 0075. Preparare anche una diluizione da uno a dieci di un copolimero ten millimolare di ten millimolare di tensioattivi.
Vortice e aggiungerlo ai batteri, girando il tubo per mescolare. Trasferire le piastre con le piantine vecchie di dieci giorni dalla camera di crescita all'armadio di biosicurezza e rimuovere il nastro chirurgico. Quindi trasferire sei millilitri di inoculo su ogni piastra.
Spingere delicatamente le piantine nell'inoculo con una punta di pipetta e avviare un timer per tre minuti. Tenere una piastra in ogni mano e inclinare la parte anteriore del piatto verso il basso per immergere i cotyledon e le foglie delle piantine. Ruotare l'inoculo da un lato all'altro da cinque a sette volte, quindi ribaltare le piastre per coprire le radici con l'inoculo.
Inclinare nuovamente le piastre verso il basso e ripetere il ciclo per un totale di tre minuti. Versare l'inoculo dalle piastre, impostarle su una superficie piana e versare per la seconda volta qualsiasi inoculo residuo. Avvolgere di nuovo i piatti e rimetterli nella camera di crescita.
Le cultivar Moneymaker-PtoR e Moneymaker-PtoS sono state inondate di PSTDC3000 e fenotipate da sette a dieci giorni dopo le inondazioni. Le piantine Moneymaker-PtoR trasportano l'ammasso genico PtoPRF ed erano resistenti al PSTDC3000. Mentre le piantine Moneymaker-PtoS quasi isogeniche, che non sono in grado di riconoscere gli effettori PSTDC3000, AVRPto o AVRPto-B sono morte rapidamente, entro sette giorni dall'alluvione.
Piantine vecchie di dieci giorni sono state inondate di PstT1 e fenotipate almeno dieci giorni dopo le inondazioni. Le adesioni sensibili erano morte, avevano meristemi apicale marroni e mancavano di nuova crescita. Al contrario, le piantine resistenti mostrava un alto livello di nuova crescita verde e sopravvissero all'infezione da PstT1.
I test di crescita batterica sono stati eseguiti per confermare quantitativamente la resistenza PstT1 e Solanum NeoRici LA1329. C'era una differenza di log 1.7 nella crescita batterica tra LA1329 resistente e suscettibile e una differenza di log 1.6 tra la1329 resistente e Moneymaker-PtoS, che era correlata con i risultati fenotipiche. Quando si esegue questo saggio, le cose più importanti da ricordare sono prestare molta attenzione alla tecnica asettica in tutto il protocollo e assicurarsi che tutte le piantine sul piatto siano completamente allagate.
Assicurarsi di autoclave infetti tessuto vegetale e batteri e smaltire i materiali in conformità con le normative appropriate.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
L'assay di inondazione dei giovani germogli consente uno screening rapido di accessioni di pomodoro selvatico per la resistenza al batterio Pseudomonas syringae. Questo protocollo ad alto rendimento riduce al minimo il tempo di crescita delle piante e permette di testare efficientemente grandi dimensioni campionarie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Patologia vegetale
- Genetica
- Microbiologia
Sfondo
- Il saggio di inondazione delle piantine è progettato per l'analisi di piantine di pomodoro.
- Pseudomonas syringae è un patogeno batterico significativo che colpisce i pomodori.
- Questo saggio può essere adattato per altri patogeni batterici.
- Permette l'identificazione della resistenza genetica in accessioni selvatiche di pomodoro.
Scopo dello studio
- Effettuare lo screening di accessioni selvatiche di pomodoro per la resistenza a Pseudomonas syringae.
- Caratterizzare la base genetica della resistenza in popolazioni di mappatura.
- Fornire un metodo ad alto rendimento per testare ampie dimensioni campionarie.
Metodi Utilizzati
- Inoculazione per allagamento di piantine di pomodoro con ceppi di Pseudomonas syringae.
- Valutazione della crescita batterica nelle piantine.
- Confronto dei livelli di resistenza tra diversi accessi.
- Utilizzo di condizioni in camera di crescita per ottimizzare la crescita delle piante.
Risultati principali
- Il saggio identifica in modo efficace gli accessi di pomodoro resistenti.
- Consente un rapido ricambio e la valutazione di grandi dimensioni campionarie.
- Versatilità dimostrata nel rilevare la resistenza a diversi patogeni batterici.
- Facilita ulteriori analisi genetiche dei caratteri di resistenza.
Conclusioni
- Il saggio di inondazione delle piantine è uno strumento efficace per analizzare la resistenza nei pomodori.
- Può essere adattato per applicazioni più ampie in patologia vegetale.
- Questo metodo aumenta l'efficienza della selezione della resistenza nella ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'identificazione rapida della resistenza patogena nei sistemi vegetali supporta la validazione precoce delle proteine bersaglio nella scoperta di agrochimici e biopesticidi. Il saggio di allagamento su piantine consente lo screening fenotipico ad alto rendimento di germoplasma selvatico, accelerando l'individuazione di caratteristiche di resistenza con valore predittivo per i processi di protezione delle colture. Questo approccio riduce il rischio biologico mediante la validazione funzionale dei meccanismi di resistenza prima di avviare prove in campo, che richiedono notevoli risorse.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga i meccanismi delle interazioni ospite-patogeno per chiarire le vie di resistenza nel pomodoro.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di loci genetici mediante fenotipi di sopravvivenza distinti o metriche quantitative di crescita.
- Valore predittivo: Favorisce la selezione di candidati alla resistenza correlando gli esiti fenotipici con saggi di crescita batterica.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera fenotipi di resistenza riproducibili in piantine di 10 giorni, consentendo la valutazione su larga scala del germoplasma.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di inoculazione e allagamento per garantire un'esposizione costante al patogeno tra i diversi campioni.
- Scalabilità: Riduce il tempo di crescita e l'ingombro in camera climatica, permettendo un rapido ricambio e la prova di numerose accessioni diverse.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Collega i fenotipi di resistenza delle piantine a risultati rilevanti per il campo attraverso la correlazione con dati sulla proliferazione batterica.
- De-risking meccanicistico: Distingue la suscettibilità indotta da effettori (ad esempio, riconoscimento di AvrPto) dalla resistenza a spettro ampio utilizzando linee quasi isogeniche.
- Continuità preclinica: Fornisce uno schermo primario scalabile che orienta la mappatura genetica e la validazione del tratto in fasi successive.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla selezione del germoplasma all'identificazione del capostipite, consentendo un rilevamento precoce del tratto di resistenza prima della mappatura genetica o della validazione in campo.
- Biologia della scoperta: Verifica gli effetti del genotipo dell'ospite sulla sopravvivenza del patogeno e sul vigore delle piantine dopo inoculazione controllata mediante allagamento.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi (misurazione della nuova crescita) e qualitativi (sopravvivenza/morte) per la valutazione della resistenza.
- Analisi: Permette di correlare la resistenza fenotipica alle differenze nella crescita batterica (ad esempio, una riduzione di 1,6–1,7 log) per convalidare i risultati positivi.
- Ricerca traslazionale: Collega i saggi su piantine alla convalida dei geni di resistenza attraverso confronti tra linee quasi isogeniche.
- Riutilizzo su larga scala: Adattabile a diversi ceppi di Pseudomonas syringae e ad altri patogeni batterici con modifiche minime del protocollo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica collegando i fenotipi di resistenza a contesti genetici definiti (ad esempio, presenza/assenza di Pto/Prf).
- Valore operativo: Aumenta la produttività grazie a un ciclo di crescita ridotto e a un'inoculazione standardizzata per allagamento.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del carattere di resistenza fornendo una conferma fenotipica e quantitativa precoce.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione mirata degli accessi selvatici in base alla forza della resistenza validata e alla trattabilità genetica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella tecnica asettica, nella manipolazione di agenti patogeni e nella crescita delle piante in condizioni controllate.
- Dipende dall'utilizzo di una cappa biosicurezza, camere di crescita con cicli precisi di luce/temperatura e spettrofotometria per la standardizzazione dell'inoculo.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i tempi di allagamento, i cicli di inclinazione e il volume dell'inoculo, al fine di garantire la riproducibilità tra esperimenti.
- L'adattamento a nuovi ceppi patogeni richiede l'ottimizzazione dell'OD600 batterico e della concentrazione del tensioattivo, mantenendo al contempo la vitalità delle piantine.
- L'accuratezza della valutazione fenotipica dipende da periodi di incubazione post-allagamento costanti e da una valutazione oggettiva della nuova crescita verde.
