Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati
30 marzo 2020
Descriviamo un metodo di colorazione rapida per eseguire l'imaging multispettrale sui tessuti congelati.
Questo metodo è utile per rilevare e co-localizzare più biomarcatori in una singola criosezione, inclusi marcatori che normalmente non sono rilevabili nelle sezioni di paraffina. Utilizzando questo metodo di colorazione sperimentale, il tempo di colorazione è significativamente ridotto e il metodo può essere eseguito in qualsiasi laboratorio. A dimostrare questo metodo sarà Dinesh Jaishankar.
È un abile postdoc del laboratorio, e anche il nucleo di valutazione dell'immunoterapia, responsabile delle strutture. Quando si selezionano gli anticorpi per l'analisi, considerare i set di filtri di eccitazione ed emissione disponibili sul sistema di imaging semi-automatizzato. E dopo aver testato varie combinazioni di anticorpi primari coniugati al fluoroforo, preparate i fluorofori da utilizzare in modo da avere una sovrapposizione spettrale minima come suggerito nella tabella.
Per la colorazione multiplex, preparare un cocktail di anticorpi con fluorofori compatibili a delusioni ottimali predeterminate e aggiungere il cocktail alle sezioni tissutali di interesse. Per la colorazione a marcatore singolo, aggiungere l'anticorpo coniugato primario solo alla diapositiva. Per tutte le colorazioni, includere uno scivolo non macchiato di controllo che subisce la stessa procedura di colorazione senza l'aggiunta di un anticorpo coniugato primario.
Dopo un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente protetta dalla luce, lavare gli scivoli due volte con PBS per cinque minuti per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, ricollere le diapositive macchiate multiplex con DAPI per sette minuti a temperatura ambiente protette dalla luce, seguite da due lavaggi di cinque minuti in PBS. Per creare una libreria spettrale, impostare la potenza della lampada del sistema di imaging multispettrale sul 100% e aprire il software operativo al microscopio.
Selezionare Modifica protocollo e nuovo protocollo. Immettere un nome di protocollo e selezionare Fluorescenza in modalità di imaging. Quindi fornire un nome di studio e caricare le singole diapositive macchiate sul palco.
Fate clic su Modifica esposizione (Edit Exposure) e utilizzate le opzioni messa a fuoco automatica ed esposizione automatica per regolare i tempi di esposizione e acquisire istantanee per le singole diapositive macchiate. Dopo aver imaging delle singole diapositive macchiate, salvare il protocollo. E nel software di machine learning sotto la scheda Build Library, carica ogni singola immagine macchiata.
Selezionare il piano appropriato e fare clic su Estrai. Il software estrae automaticamente il segnale fluorescente selezionato nel pavimento. Per salvare il colore estratto, fare clic su Salva per archiviare.
È possibile creare un nuovo gruppo o archiviare il colore estratto in un gruppo esistente. Per l'imaging multispettrale, una volta creata e verificata la libreria spettrale, regolare la messa a fuoco e i tempi di esposizione sulla diapositiva macchiata multiplex come dimostrato e aprire diapositive digitalizzate per creare una nuova attività. Fornire un ID diapositiva e selezionare un protocollo.
In Attività selezionare l'analisi dell'intera diapositiva per eseguire un'analisi completa delle diapositive nella diapositiva macchiata multiplex. Nell'intera immagine di scansione delle diapositive selezionare le aree di interesse nell'immagine. Queste aree verranno scansionate utilizzando i tempi di esposizione impostati in precedenza sulla diapositiva multiplex da utilizzare per l'unmixing spettrale e l'analisi.
Nel software operativo al microscopio selezionare acquisisci campi MSI in attività, quindi fare clic su Process Slide per acquisire aree di interesse con un ingrandimento di 20x. Una volta acquisite le aree di interesse, nel software di machine learning fare clic su File e Apri nella scheda analisi manuale per caricare le immagini macchiate multiplex. Selezionate l'origine della libreria spettrale e fate clic su Seleziona piani (Select Floors) per scegliere la libreria spettrale salvata in precedenza.
Fare clic su File e apri per caricare l'immagine non macchiata. Quindi fare clic sull'icona del marcatore di inchiostro ad autofluorescenza e disegnare una linea o un'area nella diapositiva non macchiata per identificare l'autofluorescenza all'interno del tessuto. Quindi, nella scheda Modifica marcatori e colori assegnare i nomi per ogni marcatore e fare clic su Prepara tutto.
Dopo aver verificato l'immagine spettralmente non mixata, nel software di machine learning, selezionare le opzioni di membrana citoplasmatica e marcatore dal pannello. E usando il pulsante con i puntini di sospensione, selezionare usa questo segnale per trovare, per configurare il marcatore per rilevare i nuclei, il citoplasma o la membrana. quando si sceglie un marcatore citoplasmatico o a membrana, selezionare l'opzione Usa il segnale per facilitare la scissione nucleare.
Il software rileverà e creerà automaticamente maschere individuali per il nucleo, il citoplasma e la membrana. Utilizzare la visualizzazione patologia per un marcatore specifico e le opzioni di configurazione nel software per regolare le maschere e fare clic su Segmento tutto per creare una mappa di segmentazione cellulare. Dopo la segmentazione delle celle, selezionare i marcatori per fenotipare le celle positive.
Inoltre, selezionare almeno cinque celle non macchiate con il marcatore scelto per fenotipare le celle negative. Quindi fare clic su Addestra classificatore per addestrare il software per rilevare automaticamente tutte le celle macchiate con i marcatori selezionati all'interno dell'immagine. Verrà creata una mappa fenotipo.
Come dimostrano queste immagini, gli anticorpi convalidati per la citometria a flusso potrebbero essere utilizzati per visualizzare la colorazione dei tessuti utilizzando il filtro tonnibile a cristalli liquidi nel sistema di imaging semi-automatizzato. Qui si può osservare un'immagine spettralmente non mixata della tonsille umana congelata che include l'etichettatura delle cellule B e delle cellule proliferanti all'interno del centro germinale follicolare e la regione inter follicolare delle cellule T. L'opzione visualizzazioni patologia consente la visualizzazione del modello di colorazione individuale per ogni marcatore all'interno del tessuto di interesse, suggerendo che il metodo di colorazione multiplex e l'imaging spettrale funzionano sul tessuto congelato.
Come dimostrato su una sezione tumorale del topo congelata, l'imaging multispettrale può anche essere utilizzato per visualizzare le cellule T infiltrazioni tumorali e altre lignaggi delle cellule mieloidi tra cui macrofagi associati al tumore. È possibile generare mappe di segmentazione cellulare e fenotipo e il numero di celle macchiate per ogni marcatore analizzato dal software, dimostrando che il software può essere utilizzato per la quantificazione della colorazione multispettrale sui tessuti congelati. Per qualcuno di nuovo 6 alla tecnica, è importante conoscere le caratteristiche specifiche dei fluorocromi e preparare diapositive della libreria di qualità per l'unmixing spettrale con sovrapposizione spettrale minima.
È anche importante eseguire la titolazione degli anticorpi. A nostro avviso, questo metodo può fornire informazioni sul comodino sull'efficacia dell'immunoterapia per il cancro e altre applicazioni terapeutiche, in particolare quando la tempistica è essenziale.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo di colorazione rapido per l'imaging multispettrale su tessuti congelati, che permette la rilevazione e la co-localizzazione di più biomarcatori in una singola sezione criostatica. Il metodo riduce significativamente il tempo di colorazione ed è eseguibile in qualsiasi laboratorio.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biotecnologia
- Immunologia
Sfondo
- Le sezioni paraffiniche tradizionali limitano il rilevamento di alcuni biomarcatori.
- Le sezioni di tessuto congelato garantiscono una migliore conservazione dell'integrità dei biomarcatori.
- L'analisi multispettrale consente l'analisi simultanea di più marcatori.
- Metodi di colorazione rapida aumentano l'efficienza del laboratorio.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo di colorazione rapido ed efficace per tessuti congelati.
- Permettere la rilevazione di biomarcatori che tipicamente non sono rilevabili in sezioni in paraffina.
- Facilitare l'uso di questo metodo in diverse impostazioni di laboratorio.
Metodi Utilizzati
- Selezione di anticorpi appropriati in base ai set di filtri di eccitazione e di emissione.
- Prova di diverse combinazioni di anticorpi primari coniugati con fluorocromi.
- Preparazione dei fluorocromi per minimizzare il sovrapposizione spettrale.
- Dimostrazione del metodo da parte di un postdottorando esperto.
Risultati principali
- Il metodo consente la co-localizzazione di più biomarcatori.
- Il tempo di colorazione è significativamente ridotto rispetto ai metodi tradizionali.
- Può essere eseguito in qualsiasi contesto di laboratorio, aumentandone l'accessibilità.
- Efficacia dimostrata nel rilevamento di marcatori normalmente non rilevabili.
Conclusioni
- Il metodo di colorazione rapida è uno strumento prezioso per i ricercatori.
- Amplia le capacità dell'imaging multispettrale nei tessuti congelati.
- Questo approccio può portare a un'analisi più completa dei biomarcatori.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente un rilevamento rapido di biomarcatori multiplex in sezioni di tessuto congelato, superando una limitazione fondamentale dei saggi basati su FFPE in cui alcuni biomarcatori risultano non rilevabili a causa di artefatti da fissazione o incompatibilità con gli anticorpi. Riducendo i tempi di colorazione e sfruttando sistemi di imaging multispettrale disponibili in commercio, il metodo supporta una verifica più rapida delle ipotesi nei programmi di immunologia e oncologia di scoperta. L'approccio aumenta la sicurezza predittiva nella validazione del bersaglio, permettendo analisi di co-localizzazione spaziale di marcatori immunitari e tumorali in modelli di tessuto clinicamente rilevanti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la rilevazione simultanea di fino a sei marcatori in una singola sezione crioconservata, chiarificando i modelli di co-espressione degli antigeni.
- Valore operativo: Riduce significativamente il tempo di colorazione rispetto ai metodi tradizionali, accelerando i flussi di lavoro per lo screening precoce di biomarcatori.
- Valore predittivo: Supporta la caratterizzazione fenotipica degli infiltrati immunitari (ad esempio, cellule B, cellule T, macrofagi) in tessuti umani e murini congelati, contribuendo alla riduzione del rischio funzionale dei bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi generando librerie spettrali da controlli singolarmente colorati, garantendo un minimo di sovrapposizione spettrale.
- Valore operativo: Utilizza un sistema di imaging multispettrale semi-automatico per standardizzare l'acquisizione e l'analisi, migliorando la riproducibilità tra utenti e laboratori.
- Scalabilità: Permette una valutazione affidabile di composti generando mappe fenotipiche quantitative mediante segmentazione cellulare e rilevamento di marcatori basati sull'apprendimento automatico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Preserva l'integrità dei biomarcatori nei tessuti congelati, offrendo un sistema rilevante per la malattia per il rilevamento di marcatori non accessibili nelle sezioni FFPE.
- Allineamento al Modello Preclinico: Dimostrata utilità nelle sezioni di tumore murino congelate per visualizzare linfociti T infiltranti il tumore e linee mieloidi, supportando la riduzione del rischio meccanicistica negli studi di immunoterapia.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Consente la quantificazione delle cellule colorate per ogni marcatore, fornendo dati per decisioni di avanzamento o interruzione nella priorizzazione degli obiettivi e nel triage del portafoglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino alla validazione preclinica, in particolare per le immunoterapie in cui il contesto spaziale dell'espressione del biomarcatore è fondamentale per il meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'analisi della co-localizzazione di più biomarcatori nell'architettura tissutale integra.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso la creazione di librerie spettrali standardizzate e la scansione completa del vetrino a 20x, assicurando output quantitativi riproducibili.
- Analisi: Genera mappe di segmentazione e mappe fenotipiche tramite software di apprendimento automatico, consentendo un confronto oggettivo tra condizioni di colorazione e popolazioni cellulari.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica preservando l'antigenicità nei tessuti congelati, permettendo la rilevazione di marcatori persi durante la lavorazione in paraffina.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per l'analisi multiplex di biomarcatori in diversi progetti, riducendo la dipendenza da protocolli di colorazione monouso.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica grazie al multiplexing spaziale.
- Valore operativo: Migliora standardizzazione e riproducibilità mediante imaging semi-automatico e separazione spettrale guidata da software.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo decisioni rapide di prosegui/non prosegui e riducendo il rischio biologico in fasi avanzate attraverso una riduzione precoce dei rischi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio fornendo dati quantitativi su biomarcatori con risoluzione spaziale ottenuti da modelli tissutali clinicamente rilevanti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza, selezione di anticorpi in base alla compatibilità tra eccitazione ed emissione e generazione di librerie spettrali.
- È vincolato all'accesso a un sistema di imaging multispettrale semi-automatico dotato di filtro accordabile a cristalli liquidi e software di analisi basato su apprendimento automatico compatibile.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i cocktail di anticorpi, i protocolli di diluizione e i controlli di colorazione, al fine di garantire risultati coerenti tra diversi laboratori.
- Richiede l'adattamento dei pannelli di fluorocromi per minimizzare l'overlap spettrale, in particolare quando si superano sei marcatori o si passa da un tipo di tessuto all'altro.
- Limite pratico: il metodo è ottimizzato per tessuti congelati; le prestazioni su sezioni FFPE non sono supportate e potrebbero richiedere una nuova validazione a causa delle differenze nell'accessibilità degli antigeni.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Antibody and Fluorophore Selecting and Staining
1:52
Spectral Library Preparation
2:59
Multispectral Imaging
3:54
Spectral Unmixing
4:37
Analyzing Multispectral Images via Cell Segmentation and Phenotyping
5:52
Results: Representative Multispectral Imaging and Cell Quantification
7:07
Conclusion
