Name: Un metodo di co-cultura per studiare lescrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Scopri un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali usando cellule della polpa dentale e neuroni del ganglio trigeminale. Questa tecnica consente di analizzare le interazioni cellulari in vitro.

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Questo lavoro è stato sostenuto da a) il National Institutes of Health/NIAMS (numeri di sovvenzione R01 AR062507 e R01 AR053860 a RS), b) l'Università dell'Alabama presso Birmingham Dental Academic Research Training (DART) grant (numero T90DE022736 (PI MacDougall)) a SBP dal National Institute of Dental and Craniofacial/National Research Institutes of Health, c) un Centro globale UAB per i disturbi craniofacciali, orali e odontoiatrici (GC-CODED) Pilota e facilità di fattibilità a SBP e d) l'Istituto Nazionale di Odontoiatria e Craniofacial Ricerca/ Istituti nazionali di salute K99 DE024406 sovvenzione a SBP.

Tutti gli esperimenti con i topi sono stati approvati dall'UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Preparazione piastra
NOTA: i coverlips possono essere utilizzati per l'immagine di celle DP alla fine del saggio. Assicurarsi che il coperchio della piastra sia acceso durante tutte le fasi di incubazione e risciacquo al di fuori del cofano di coltura dei tessuti sterili per evitare la contaminazione durante la lavorazione del campione.
<ol><li>
Preparazione coverslip
	<ol>
<li>Autoclave correle.</li>
		<li>Filtrare l'acqua ultrapura sotto il cofano.</li>
		<li>Trasferire i copricopertine su una piastra di 24 pozze e coprire ciascuno con 400 litri di 0,1 mg/mL poli-D-lisina.</li>
		<li>Lasciare in ammollo i copricapi, immersi per 5 min, su un rocker a 12 giri/m o shaker orbitale a 40-50 giri/mm. Assicurarsi che il coperchio sia acceso per evitare la contaminazione.</li>
		<li>Sciacquare le coverlips con acqua ultrapura filtrata per circa 5 min su un rocker a 12 giri/m o shaker a 50 giri/. Ripetere.</li>
		<li>Lasciare asciugare i coperchi per almeno 2 h sotto il cofano con il coperchio della piastra spento per facilitare l'evaporazione. Questi copricopertine devono essere utilizzati entro 48 h.</li>
		<li>Le cellule di pesiamo DP in cima coprono i loronubi e il processo alla fine del saggio per l'immunofluorescenza (sezione 3.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Filtri di rivestimento
	<ol>
<li>Lamino diluito a 10 g/mL. Filtrare la laminina diluita sotto il cofano.</li>
		<li>Pipette 450-500 -L di 10 g/mL di laminina in ogni pozzo di una piastra di 24 pozze.</li>
		<li>Mettere il filtro transwell, 3 om porosity, in un pozzo in modo che contatti la soluzione di laminina e lasciarlo in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 2 h o per una notte. I pori del filtro dovrebbero consentire ad alcune delle soluzioni di diffondersi e rivestire sia la parte superiore che quella inferiore del filtro. Questi filtri devono essere utilizzati entro 48 h o essere refrigerati a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Placcatura cellulare con manipolazione genetica opzionale
<ol><li>Topi: L'alterazione genetica delle cellule DP può essere eseguita (ma non è necessaria) per studiare le interazioni mesenchimal-neuronale. Vedere le sezioni 2.3 e 2.4 per le variazioni genetiche suggerite.</li>
	<li>Dissezione, dispersione e placcatura DP (Figura 1) NOTA: Per la dissezione DP, utilizzare pinze ultra-fine e dritte. I bordi ultra-fini permetteranno all'utente di cuneo il bordo della pinna tra la struttura mineralizzata e il tessuto DP.<ol><li>Raccogliere topi P5-P8. In questa fase, i denti dovrebbero essere mineralizzanti e la radice è aperta.</li>
		<li>Anestesizzare i neonati tramite ipotermia mettendoli in un piatto nel frigorifero a 4 gradi centigradi fino a quando non si muovono più o rispondono al tatto. Eutanasia i neonati per decapitazione e in conformità con le procedure IACUC presso l'impianto designato.</li>
		<li>Preparare un 3-5 mL di 0.25% trypsin-EDTA in un tubo conico 50 mL per raccogliere il DP da ogni topo. Ciò faciliterà la digestione della polpa dentale dai topi postnatali. Utilizzare più di 3 mL se digerire il tessuto da più di 10 topi postnatali.</li>
		<li>Posizionare la testa su un sottopad usa e getta in modo che la bocca sia verso il soffitto e la base del collo sia piatta sulla superficie di lavoro. Utilizzare una lama di rasoio in un movimento di segatura per separare la mandibole dalla mascella.</li>
		<li>Facoltativamente, rimuovere la lingua con le forbici o con pinze per consentire un accesso più facile ai molari.</li>
		<li>Posizionare la testa aperta in un piatto in cima a un tampone di garza sterile e posizionare il campione sotto un microscopio sezionante (Figura 1D).</li>
		<li>Rimuovere il tessuto osseo alveolare che circonda i primi molari. I denti submandibolali non sono completamente eruttati a questo punto. Inserire le pinze nell'apertura alveolar e prendere in giro il tessuto lontano dal dente verso il lato buccale (guancia) o linguale (lingua) della bocca. I denti mascellari richiedono la completa rimozione della fessura intorno al dente per l'esposizione e la rimozione.</li>
		<li>Trasferire delicatamente i primi molari submandibolari e mascellari (M1) in un piatto di coltura cellulare separato con 1x salina con buffer di fosfato (PBS).</li>
		<li>Ripetere 2.2.4-2.2.8 fino a quando non vengono raccolti tutti i M1. Conservare il piatto contenente gli M1 sul ghiaccio durante la raccolta.</li>
		<li>Rimuovere l'organo esterno smaltato (EOE) che circonda l'esterno di ogni M1. Questo può essere fatto in alternativa dopo il passaggio 2.2.11.This can alternatively be done after step 2.2.11.</li>
		<li>Con un set di pinze, ruotare l'M1 in modo che le cuspidi siano abbassate e la radice aperta sia esposta. Ci sarà un'apertura ovale sul fondo del dente, e tessuto DP opaco incapsulato da un sottile strato di dentina e smalto.</li>
		<li>Utilizzando la punta delle pinze, allentare delicatamente il DP eseguendo un braccio delle pinze intorno alla circonferenza interna del tessuto mineralizzato. Togliere il tessuto DP dalla struttura mineralizzata e trasferirlo in un terzo piatto contenente 1x PBS. Rimuovere l'EOE se non era già separato (Figura 1E).</li>
		<li>Trasferire tutto il tessuto DP allo 0,25% trypsin-EDTA in un tubo conico da 50 mL. Vorticare la miscela e mettere in un bagno d'acqua tiepida 37 gradi per 10 min. Questo può essere fatto con le stesse pinze o con lunghe pinze fiala. Il tessuto sarà difficile da disperdere e richiederà vortice ogni 3-4 min. NON superare 10 min trypsinizzazione dal momento che la trypsin può danneggiare le membrane cellulari.</li>
		<li>Sotto un cofano sterile, aggiungere i mezzi di comunicazione di cocoltura riscaldati (Tabella 1) ad un rapporto finale di almeno 1:1 media per provare per inattivare l'enzima. I rapporti più grandi sono accettabili se si desidera una maggiore dispersione dei tessuti.</li>
		<li>Pipette il supporto su e giù più volte con una pipetta da 10 mL per disperdere ulteriormente il DP nei media. Fare attenzione a evitare grandi bolle. La completa dispersione è quasi impossibile a causa della natura appiccicosa del tessuto. Tuttavia, non è necessario poiché le cellule migreranno verso l'esterno dal tessuto una volta placcate.</li>
		<li>Trasferire 1 mL del DP disperso in ogni pozzo di una piastra di coltura dei tessuti a 24 pozze(Figura 1F).</li>
		<li>Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi centigradi e consentire alle cellule di attaccarsi e migrare dal tessuto non disperso per 48 h prima di cambiare supporto. Le cellule primarie devono essere placcate a concentrazioni relativamente elevate per raggiungere l'85-90% di confluenza entro 1 settimana. Se questo non viene raggiunto dopo 1 settimana, scartare la piastra.</li>
	</ol></li>
	<li>Manipolazione genetica opzionale delle cellule DP
	<ol>
<li>Per alterare le vie di segnalazione cellulare, raccogliere le cellule DP da topi ad urlo genetico o da topi in cui un gene di interesse è affiancato da siti loxP. In quest'ultimo caso, il gene può essere eliminato utilizzando la ricombinani Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) per rimuovere il gene affiancato, come descritto di seguito. Utilizzare Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) come virus di controllo per garantire che l'infezione virale non causi una risposta cellulare. NOTA: Ad-eGFP è controllato dal promotore CMV, che è molto forte. Ad-Cre-GFP è regolata da un IRES, una regione interna di regolamentazione tra Cre e GFP, che non è molto forte. Ciò si traduce in una fluorescenza più luminosa nelle cellule Ad-eGFP rispetto alle cellule Ad-Cre-GFP. Confermare i livelli di infezione equivalenti in base al numero totale di cellule fluorescing, non sui livelli di fluorescenza cellulare.</li>
		<li>Preparare 500 litri di supporti contenenti virus e 10 g/mL di polibrene per pozzo. La polibrena assiste con l'infezione virale nelle cellule vicine alla confluenza10. Questo protocollo si basa su una molteplicità di infezioni (MOI) di 100 per Ad-eGFP e 200 Ad-Cre-GFP per un'infezione genica efficiente con un effetto minimo o nullo sulla vitalità cellulare. Il numero di celle stimato è 4 x 104 celle / pozzetto di una piastra di 24 pozze: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60809/60809equ01.jpg">
</li>
		<li>Mescolare i supporti con un breve vortice o pipettaggio e aggiungere 500 L ad ogni pozzo.</li>
		<li>Dopo 24 h, aggiungere altri 500 l di supporti di co-coltura che non contengono polibrene o virus aggiuntivi.</li>
		<li>Dopo un totale di 48 h, aspirare i media contenenti virus e sostituirli con nuovi media di co-cultura. A questo punto, i neuroni TG possono essere aggiunti in cima filtri transwell.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissezione, dispersione e placcatura dei neuroni trigemini NOTA: In questo protocollo, l'imaging della escrescenza di neurite nella co-coltura con cellule DP è stato ottimizzato utilizzando l'adolescente (6-settimana-vecchio) B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Topi da parte del I sistemi nervosi centrali e periferici dei topi Thy1-YFP hanno un tag di proteina fluorescente gialla (YFP) la cui espressione inizia intorno al P6-P10 nei neuroni e aumenta esponenzialmente in tutto il sistema nervoso durante la vita postnatale e adulta11,12. YFP e GFP hanno conservato sequenze che permettono a questi nervi di essere macchiati con anticorpi anti-GFP, con conseguente macchia pan-neuronale. In definitiva, questi topi consentono una migliore visualizzazione e quantificazione dei neuroni utilizzati e cresciuti nella coltura cellulare.<ol><li>Topi adolescenti eutanasi con anidride carbonica seguiti da lussazione cervicale.</li>
		<li>Decapitare i topi e rimuovere la pelle dal cranio. Assicurati di includere un numero equivalente di maschi e femmine.</li>
		<li>Inserire la punta di un paio di forbici micro-dissecting nella base del cranio. Tagliare lungo la sutura sagittale del cranio (Figura 1A).</li>
		<li>Fai quattro piccoli tagli orizzontali: due lungo le suture coronali dalle orecchie e due lungo le suture lambdoid alla base del cranio. Questo dovrebbe creare due lembi di osso.</li>
		<li>Utilizzare le pinze per sbucciare i due lembi di osso. Questo dovrebbe rivelare il cervello.</li>
		<li>Togliete il cervello. Trasferire la testa in un piatto di coltura tissutale con 1x PBS e mettere al microscopio.</li>
		<li>Individuare i gangli TG, facilmente visibili nei roditori13, alloggiati nella materia dura tra il cervello e l'osso del processo mascellare (Figura 1B).</li>
		<li>Tagliare i tre rami che viaggiano agli occhi, mascella e mandibola e trasferire i gangli a freddo 1x PBS utilizzando pinze sottili dritte. Conservare il piatto contenente i gangli TG sul ghiaccio durante la raccolta.</li>
		<li>Una volta raccolti tutti i fasci TG, trasferire i gangli in un tubo conico da 50 mL contenente 5 mg/mL di tipo di collagenae filtrato sterile II utilizzando pinze a fiala.</li>
		<li>Vorticare la collagenasi con il fascio TG e posizionare il tubo in un bagno d'acqua 37 c per 25-30 min. Durante questo periodo, prendere il tubo conico fuori dal bagno d'acqua, vortice, e tornare al bagno ogni 5-10 min.</li>
		<li>Centrifugare la soluzione neuronacollagee-TG per 2 min a 643 x g.</li>
		<li>Sotto un cofano di coltura tissutale, aspirare delicatamente la collagenasi con una micropipetta.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL dell'1% di trypsin e vortice filtrati sterilemente. Collocare il tubo conico in un bagno d'acqua di 37 gradi per 5 min.</li>
		<li>Centrifugare il mix trypsin-TG per 5 min a 643 x g. Rimuovere la parte superiore della trypsin con una micropipetta, in modo che i neuroni TG non vengano rimossi. Ci sarà ancora liquido nel tubo.</li>
		<li>Aggiungere un numero sufficiente di supporti per disattivare la trypsin rimanente (a un rapporto 1:1 o inferiore tra la trypsin e il supporto).</li>
		<li>Contare il numero di cellule e diluire la soluzione a 200.000 celle/mL (250 - L di 50.000 celle contenenti celle).</li>
		<li>Posizionare i filtri transwell rivestiti dalla sezione 1.2 in pozzi con DP.</li>
		<li>Diluire la soluzione contenente celle in modo che ci siano 200.000 celle/mL. Pipetta 250 - L sul filtro transwell, e la coltura delle cellule a 37 gradi centigradi durante la notte (Figura 1F).</li>
		<li>Il giorno successivo, sostituire i media con 1 mL di supporti di co-coltura con 1 uridina M e 15 -M 5'-fluor-2'deoxyuridina per fermare la proliferazione eccessiva di cellule mesenchymal che possono impedire la crescita neurite. Facoltativo: aggiungere fattori di crescita o inibitori in questo supporto se si tenta di ulteriori manipolazioni.</li>
		<li>Coltura le celle per ulteriori punti temporali desiderati. Questo protocollo è stato ottimizzato per 5 giorni totali di cultura con i media cambiati solo il giorno 2 per aggiungere inibitori mitotici. Periodi di tempo più lunghi richiederanno ulteriori modifiche ai supporti.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Raccolta ed elaborazione dei campioni
<ol><li>Colorazione trigeminale
	<ol>
<li>Pipetta 1 mL aliquote di sterile 1x PBS in una piastra di 24 pozze sotto un cappuccio di coltura dei tessuti per ogni filtro transwell da elaborare.</li>
		<li>Rimuovere il liquido in cima al filtro rimosso con una pipetta da 200-1.000 l,fare attenzione a lasciare intatti gli strati cellulari. Le cellule attaccate devono rimanere attaccate e le cellule non attaccate si allentano durante questa delicata pipettatura. Un filtro a vuoto può danneggiare lo strato cellulare e non è raccomandato per l'aspirazione.</li>
		<li>Trasferire il filtro alla piastra 1x PBS, assicurandosi di rimuovere lo strato superiore dei supporti come indicato nel passaggio precedente.</li>
		<li>Posizionare la piastra con tutti i filtri transwell e coperchi su un rocker a 12 giri/m o 40-50 rpm su uno shaker orbitale per 10 min.</li>
		<li>Aspirati il PBS, incluso lo strato superiore come descritto sopra, aggiungere 500 luna di 1xPBS e posizionare sul rocker o shaker orbitale per un ulteriore 5-10 min risciacquo.</li>
		<li>Aspirati il 1x PBS ancora una volta e sostituire con 4% paraformaldeide (PFA). Utilizzare almeno 500 l in modo che l'intera superficie del filtro sia sommersa. Posizionare la piastra su un rocker a 12 giri/m lma o agitatore orbitale a 40-50 giri a temperatura ambiente per 1 h.</li>
		<li>Rimuovere il PFA e sciacquare le piastre due volte per 5-10 min ciascuno su un rocker con 500 L di 1x PBS.</li>
		<li>Blocco con 10% di semastro bovino albumina (BSA) - 5% siero di capra / asino, a seconda dell'animale ospite anticorpale secondario, in 0.05% Tween-1xPBS (PBST). Utilizzare 450-500 l di soluzione in modo che il filtro sia immerso nel liquido. NOTA: In questa fase, queste piastre possono essere conservate a 4 gradi centigradi per diversi mesi per essere lavorate in un secondo momento. Utilizzare il parafilm per sigillare la piastra per garantire che l'evaporazione non si verifichi e controllare regolarmente l'evaporazione in modo che le superfici del filtro rimangano sommerse.</li>
		<li>Rimuovere il blocco e aggiungere 450-500 l di anticorpo primario in 1% BSA-PBST senza un ulteriore risciacquo. Incubare a 4 gradi centigradi, a dondolo dolcemente.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e risciacquare con 500 L di 1xPBST su un rocker, 3 volte, a temperatura ambiente</li>
		<li>Rimuovere il PBST, aggiungere anticorpo secondario e incubare su un rocker durante la notte a 4 gradi centigradi avvolto in un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori dalla degradazione leggera. Risciacquare di nuovo, 3 volte, con 1x PBST su un rocker a temperatura ambiente. Sostituire con 1x PBS. NOTA: A questo punto, la piastra può essere conservata per diversi mesi a 4 gradi centigradi se avvolta in un foglio di alluminio per prevenire la degradazione del fluoroforo. Utilizzare il parafilm per sigillare la piastra per garantire che l'evaporazione non si verifichi e controllare regolarmente l'evaporazione in modo che le superfici del filtro rimangano sommerse. E 'meglio immaginare entro un mese.</li>
		<li>Per una imaging ottimale, utilizzare i neuroni del topo Thy1-YFP con un anticorpo anti-GFP per macchiare specificamente gli afferenti neuronali ben al di sopra dei livelli di fondo. Utilizzare Anti-Neurofilament 200 per macchiare con precisione le strutture assonali se i topi Thy1-YFP non sono disponibili.</li>
		<li>Immagine come desiderato. I filtri non devono essere placcati e possono invece essere posizionati in cima a un coperchio o a un vetrino per l'imaging con un microscopio invertito. NOTA: le aree del filtro non conterranno strutture afferenti. Scatta diverse immagini con una profondità z-stack che cattura tutte le strutture afferenti. Utilizzare il software di cucitura per visualizzare la escrescenza neurite su grandi aree, o (preferibilmente) intere regioni di filtro.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccolta di RNA, proteine e supporti
	<ol>
<li>Mentre i filtri di trasbelno sono in fase di elaborazione, raccogliere i supporti in tubi senza RNAse/DNAse e congelare per i saggi successivi (ELISA, proteomica, ecc.).</li>
		<li>Subito dopo la raccolta dei media, buffer di lisi è o Radio Immuno Precipitazionation Assay (RIPA) tampone con inibitori di proteine e fosforasi nei pozzi. Questo protocollo è stato ottimizzato per 100 l/well in una piastra di 24 pozze.</li>
		<li>Consentire ai buffer di lesi le cellule per 5 minuti, quindi raschiare ogni filtro con una nuova punta di pipetta e raccogliere i campioni di cellule in tubi senza RNAse/DNAse. Congelare la lisi per i saggi futuri (PCR semi-quantitativo e/o quantitativo, macchia occidentale, ecc.).</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescenza facoltativa delle cellule della polpa dentale:
	<ol>
<li>Sollevare delicatamentei da sezione 1.1 con pinze e trasferirli in diversi pozzi con 4% PFA per 1 h con dondolo.</li>
		<li>Aspirare PFA e risciacquare le coverlips due volte con 1x PBS. Seguire questo con permeabilizzazione, blocco e immunofluorescenza per marcatori di interesse con tecniche di immunofluorescenza standard.</li>
	</ol></li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le attività quotidiane della cavità orale richiedono che i denti percepiscano stimoli esterni e infiammazione interna al fine di consentire un corretto utilizzo e manutenzione. Tuttavia, sono disponibili solo informazioni limitate per quanto riguarda i segnali che guidano i processi di sviluppo dell'innervazione dei denti. Questo protocollo fornisce un metodo per isolare e co-cultura cellule primarie DP e neuroni TG al fine di studiare la comunicazione incrociata tra le due popolazioni. Diverse variabili sono state ottim...

L'innervazione dentale consente ai denti di rilevare pressione, temperatura e infiammazione, che sono tutti cruciali per l'uso e il mantenimento dell'organo dentale. Il mancato rilevamento del dolore dentale associato alla carie dentale e al trauma porta alla progressione della malattia. Pertanto, una corretta innervazione è un requisito per la normale crescita, funzione e cura dei denti.
Mentre la maggior parte degli organi sono completamente funzionali e innervati dal momento della nascita, lo sviluppo dei denti si estende nella vita adulta, con l'innervazione dei denti e la mineralizzazione che si verificano in concerto durante le fasi postnatali1,2. È interessante notare che la polpa dentale (DP) mesenchyme inizialmente secerne segnali repellenti durante l'embriogenesi per impedire l'ingresso dell'assone nell'organo dentale in via di sviluppo, che successivamente si sposta alla secrezione di fattori attrattivi come il dente si avvicina all'eruzione3,4. Durante le fasi postnatali, gli assoni afferenti del nervo trigeminale (TG) penetrano dentro e in tutto il dente intorno al momento in cui inizia la deposizione della dentina (rivisto a Pagella, P. et al.5). Diversi studi in vivo hanno dimostrato che le interazioni neuronale-mesenchymal guidano l'innervazione dentale nei topi (rivisti a Luukko, K. et al.6),ma sono disponibili pochi dettagli dei meccanismi molecolari.
Le co-culture cellulari forniscono ambienti controllati in cui gli investigatori possono manipolare le interazioni tra popolazioni neuronali e mesenchimale. Gli esperimenti di co-cultura consentono di approfondire i percorsi di segnalazione che guidano l'innervazione e lo sviluppo dei denti. Tuttavia, molti dei metodi convenzionali utilizzati per studiare le cellule in co-cultura presentano sfide tecniche. Per esempio, la colorazione viola cristallina della crescita di neurite può non macchiare specificamente le cellule di Schwann incluse nelle dispersioni dei pacchetti TG, e ci possono essere picchi di intensità del colore con risposte relativamente piccole7. Le camere microfluidiche offrono un'opzione interessante, ma sono considerevolmente più costose dei filtri transwell8,9 e consentono solo lo studio delle risposte neuronali alle secrezioni DP. Per affrontare questi problemi, abbiamo sviluppato un protocollo che consente: a) precisa colorazione e imaging della crescita di TG neurite in risposta alle secrezioni DP, b) modificazione genetica delle cellule DP e/o neuroni TG per studiare percorsi di segnalazione specifici, e c) indagine delle risposte delle cellule DP a fattori secreti dai neuroni TG. Questo protocollo offre la possibilità di studiare con precisione diverse caratteristiche dell'innervazione dei denti nell'ambiente controllato di un saggio di co-cultura in vitro.

<table><tbody><tr><td>5-Fluoro-2'-deossiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>Usato come inibitore mitotico a 15 &mu; Concentrazione M in terreni di co-coltura, giorno 2</td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>Piastra di co-coltura</td></tr><tr><td>Alexa-546 anti-pollo</td><td>Invitrogen</td><td>A-11040</td><td>Secondario alla crescita di neuriti marcati con anticorpi anti-GFP, diluizione 1:500 Anticorpo</td></tr><tr><td>anti-GFP</td><td>Aves Lab, Inc</td><td>GFP-1010</td><td>Anticorpo primario per marcare i neuroni Thy1-YFP, diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Neurofilamento 200 anticorpi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NO142</td><td>Anticorpo primario monoclonale per marcare i neuroni, diluizione 1:1000, alternativa se i topi YFP non sono disponibili</td></tr><tr><td>B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>12603</td><td>Tgfbr2f/f modello murino utilizzato per cellule pulpare dentali nel protocollo</td></tr><tr><td>ottimizzato B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3709</td><td>Thy1-YFP genotipo del modello murino utilizzato per i neuroni trigeminali</td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo II</td><td>Millipore</td><td>234155-100MG</td><td>Utilizzato per disperdere i neuroni del trigemino</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino fetale</td><td>Gibco</td><td>10437</td><td>Additivo per terreni di co-coltura</td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>11413-11</td><td>Pinze fini per la dissezione TG</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Riveste gli inserti del transwell alla concentrazione finale di 10 &mu; g/ml, la soluzione madre è assunta a 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Tampone di lisi (tampone RLT)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Estrae l'RNA dalle cellule della polpa dentale dopo la co-coltura</td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Additivo ai terreni di co-coltura</td></tr><tr><td>Forbici per micro-dissezione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>Forbici da dissezione per aprire il cranio</td></tr><tr><td>Coperchio del microscopio Vetro</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-81</td><td>Vetrino coprioggetto circolare per la coltura cellulare opzionale e l'elaborazione dell'immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Terreno essenziale minimo a</td><td>Gibco</td><td>12571063</td><td>Base del terreno di co-coltura</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>Additivo antibiotico per terreni di co-coltura</td></tr><tr><td>Inibitore della fosfatasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04 906 837 001</td><td>Additivo per RIPA Tampone per l'estrazione di proteine dalle cellule della polpa dentale co-coltura</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>Utilizzato per aiutare nella trasfezione delle cellule della polpa dentale</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>Rivestimento del vetrino coprioggetto per favorire l'adesione cellulare della polpa dentale</td></tr><tr><td>Inibitori della proteasi</td><td>Millipore</td><td>05 892 791 001</td><td>Additivo al tampone RIPA per l'estrazione di proteine dalle cellule della polpa dentale dopo la co-coltura</td></tr><tr><td>Provette Eppendorf prive di RNAsi/DNAsi</td><td>Denville</td><td>C-2172</td><td>Provette presterilizzate da 1,7 ml per la raccolta di RNA, DNA o proteine alla fine del test</td></tr><tr><td>Inserto per colture cellulari ThinCert Greiner</td><td>Bio-One</td><td>662631</td><td>Inserti Transwell per neuroni trigeminali in saggi di co-coltura</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Utilizzato per disperdere le cellule della polpa dentale</td></tr><tr><td>Tripsina di tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-7409</td><td>Utilizzato per disperdere neuroni trigeminali</td></tr><tr><td>Pinze ultra fini</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>11370-40</td><td>Pinze ultra fini per dissezione</td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>Usato come inibitore mitotico a 1 &mu; Concentrazione di M in terreni di co-coltura,</td></tr><tr><td>Giorno 2 Sistema di filtrazione sottovuoto</td><td>Millipore</td><td>SCNY00060</td><td>Filtro monouso Steriflip, 50 &mu; m filtro a rete in nylon</td></tr><tr><td>Pinze per fiale</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>110006-15</td><td>Pinze lunghe per il trasferimento di tessuti a coniche</td></tr></tbody></table>

un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

L'innervazione dentale consente ai denti di rilevare pressione, temperatura e infiammazione, che sono tutti cruciali per l'uso e il mantenimento dell'organo dentale. Senza l'innervazione sensoriale, le attività orali quotidiane causerebbero danni irreparabili. Nonostante la sua importanza, i ruoli di innervazione nello sviluppo e nella manutenzione dei denti sono stati in gran parte trascurati. Diversi studi hanno dimostrato che le cellule DP secernono proteine della matrice extracellulare e segnali paracrini per attirare e guidare gli assoni TG dentro e in tutto il dente. Tuttavia, pochi studi hanno fornito informazioni dettagliate sul crosstalk tra il DP mesenchyme e afferenti neuronali. Per colmare questa lacuna nella conoscenza, i ricercatori hanno iniziato a utilizzare le co-culture e una varietà di tecniche per studiare queste interazioni. Qui, dimostriamo i molteplici passaggi coinvolti nella co-cultura delle cellule DP primarie con neuroni TG dispersi su un filtro transwell sovrastante con pori di grande diametro per consentire la crescita assonale attraverso i pori. Le cellule DP primarie con il gene di interesse affiancato da siti loxP sono state utilizzate per facilitare la delezione genica utilizzando un sistema ricombinase Adenovirus-Cre-GFP. L'utilizzo di neuroni TG del topo Thy1-YFP ha permesso una precisa imaging afferente, con espressione ben al di sopra dei livelli di fondo mediante microscopia confocale. Le risposte del DP possono essere studiate attraverso la raccolta e l'analisi di proteine o RNA, o in alternativa, attraverso la colorazione immunofluorescente delle cellule DP placcate su coperture in vetro rimovibile. I media possono essere analizzati utilizzando tecniche come le analisi proteomiche, anche se ciò richiederà l'esaurimento dell'album a causa della presenza di siero bovino fetale nei media. Questo protocollo fornisce un metodo semplice che può essere manipolato per studiare le risposte morfologiche, genetiche e citoscheletriche dei neuroni TG e delle cellule DP in risposta all'ambiente controllato di un saggio di co-cultura.

Questi risultati mostrano che l'escrescenza di TG neurite è stata aumentata in presenza di cellule primarie DP nel pozzo sottostante rispetto al controllo della monocoltura neurite TG (Figura 2A,C). C'è una certa variabilità saggio-saggio-saggio nella escrescenza neurite. Pertanto, una monocoltura neuronale TG dovrebbe essere inclusa in tutti i saggi come un controllo per rilevare i livelli basali di escrescenza neurite. Le cellule primarie del mouse Tgfbr2f/f son...

Descriviamo l'isolamento, la dispersione e la placcatura delle cellule primarie della polpa dentale (DP) con neuroni trigeminali (TG) coltivati in cima ai filtri transwell sovrastanti. Le risposte cellulari delle cellule DP possono essere analizzate con l'immunofluorescenza o l'analisi RNA/proteina. L'immunofluorescenza dei marcatori neuronali con microscopia confocale consente l'analisi delle risposte di escrescenza neurite.

Un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata di come co-coltura delle cellule staminali della polpa dentale con i neuroni trigeminali. Con esso, possiamo indagare su più risposte guidate dal loro crosstalk. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di studiare e manipolare una o entrambe le popolazioni cellulari e misurare con precisione i risultati.Questo metodo ha una rilevanza diretta per la ricerca neurale e potrebbe fornire informazioni sulla ricerca su come le cellule staminali della polpa dentale riparano il tessuto neurale danneggiato da eventi traumatici o malattie neurodegenerative. Ci sono diverse fasi di questa tecnica da imparare e può essere difficile mantenere il tratto di tutti. Questo protocollo descrive in dettaglio ogni fase per aiutare in questo.La polpa dentale e i gangli sono difficili da disperdere e richiedono vari vortici e pipettaggio. Anche in questo caso non otterrai la piena dispersione, quindi sarà necessaria l'ottimizzazione e le repliche. Dopo l'eutanasia del mouse, posizionare la testa sul sottopad monouso in modo che la bocca sia verso il soffitto e la base del collo sia piatta sulla superficie di lavoro.Utilizzare una lama di rasoio e un movimento di segatura per separare la mascella dalla mascella. Rimuovere la lingua con forbici o forcep per consentire un accesso più facile ai molari. Posizionare la testa aperta nel piatto in cima a un tampone di garza sterile e posizionare il campione sotto il microscopio di sezionazione.Rimuovere il tessuto osseo alveolare che circonda i primi molari. Inserire le forcelle nell'apertura alveolare e stuzzicare il tessuto lontano dal dente verso il buccle o il lato linguale della bocca. Raccogliere tutti i primi molari mascellari e trasferire delicatamente i primi molari submandibolari e mascellari in un piatto separato di coltura cellulare con 1X PBS sul ghiaccio.Rimuovere l'organo esterno in smalto che circonda l'esterno di ogni primo molare mascellare. Con un set di forcep ruotare il molare in modo che le cuspidi siano verso il basso e la radice aperta sia esposta. C'è un'apertura ovale sul fondo del dente e tessuto opaco della polpa dentale incapsulato da un sottile strato di dentina e smalto.Usando la punta delle forcep, allentare delicatamente la polpa dentale facendo scorrere un braccio delle forcep attorno alla circonferenza interna del tessuto mineralizzato. Rimuovere il tessuto della polpa dentale dalla struttura mineralizzata e trasferirlo in un terzo piatto contenente 1X PBS. Rimuovere l'organo esterno in smalto se non era già separato.Trasferire tutto il tessuto della polpa dentale allo 0,25% di EDTA di tripside in un tubo conico da 50 millilitri. Vortice la miscela e posizionare in un bagno d'acqua calda di 37 gradi Celsius per 10 minuti. Sotto un cappuccio sterile, aggiungere i supporti di co-coltura riscaldati a un rapporto finale di almeno uno a uno per la tripparina per inattivare l'enzima.Pipettare il supporto su e giù più volte con una pipetta da 10 millilitri per disperdere ulteriormente la polpa dentale nel supporto, evitare grandi bolle. Trasferire un millilitro della polpa dentale dispersa in ogni pozzo della piastra di coltura tissutale a 24 pozzi. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.E permettere alle cellule di attaccarsi e migrare dal tessuto non disperso per 48 ore prima di cambiare il supporto. Dopo l'eutanasia e la rimozione della pelle, inserire la punta di un paio di micro forbici sezionanti nella base del cranio. Tagliare lungo la sutura sagittale del cranio.Fai quattro piccoli tagli orizzontali lungo le suture coronali dalle orecchie fino a lungo le suture lambdoidi della base del cranio. Questo crea due lembi di osso. Usa le forcep per sbucciare i due lembi di osso per rivelare il cervello.Individuare i gangli trigeminali ospitati nella dura madre tra il cervello e l'osso del processo mascellare. Taglia i tre rami che viaggiano verso gli occhi, mascellae e mattiglia. E usa le forcette sottili a bordo dritto per trasferire i gangli al freddo 1X PBS in un piatto sul ghiaccio.Una volta raccolti tutti i fasci trigeminali, utilizzare i file forcep per trasferire i gangli in un tubo conico da 50 millilitri contenente cinque milligrammi per millilitro di collagenasi filtrata sterile di tipo II.Vortice la miscela e posizionare il tubo nel bagno d'acqua Celsius di 37 gradi per 25-30 minuti. Ogni cinque o dieci minuti, togliere il tubo dal bagno d'acqua, dal vortice e tornare al bagno. Centrifugare la soluzione di neurone trigeminale di collagenasi per due minuti a 643xg.Sotto una cappa di coltura tissutale, aspirare delicatamente la collagenasi con un micropipetto e aggiungere cinque millilitri di tripina filtrata sterile all'1%di tipo II.Quindi posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 25-30 minuti e in questo vortice di tempo il tubo brevemente ogni cinque minuti. Aggiungere supporti con un rapporto uno-a-uno tra tripina e supporto per disattivare la tripina rimanente. Contare il numero di cellule e diluire la miscela a 200.000 cellule per millilitro nei mezzi.Posizionare i filtri transwell rivestiti in pozzi con polpa dentale. Pipettare 250 microlitri sul filtro transwell e coltura delle cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno dopo, sostituire il supporto con un millilitro di mezzi di co-coltura integrati con un uridina micromolare e 15 micromolare 5-Fluoro-2'deossiuridina per fermare la sovra proliferazione delle cellule mesenchimali che può prevenire la crescita della neurite.È necessario aggiungere inibitori mitotici il secondo giorno o la crescita della neurite non si verificherà. In questo studio, la crescita della neurite trigeminale è stata aumentata in presenza di cellule primarie della polpa dentale nel pozzo sottostante rispetto al controllo della monocoltura di neurite trigeminale. Le cellule primarie isolate dal topo del recettore TGF-beta 2 flox/flox erano equivalenti in numero dopo iniezioni di ade-Cre-GFP o ade-eGFP.La PCR semi-quantitativa dimostra che l'adenovirus-Cre-GFP ha eliminato il gene affiancato trasformando il recettore beta del fattore di crescita 2 con adenovirus-eGFP che funge da vettore virale di controllo. Nelle colture con la trasformazione del recettore beta del fattore di crescita 2, la crescita della neurite è diminuita. L'imaging a campo brillante dei filtri transwell dopo la colorazione viola cristallina delle popolazioni cellulari mostra che i pori di grandi dimensioni sono prevalenti.La grande freccia indica una cellula con morfologia mesenchimale mentre la piccola freccia punta a una cellula di morfologia neuronale. Il viola cristallo ha macchiato entrambe le cellule senza pregiudizi. Inoltre, la colorazione ad immunofluorescenza della tubulina beta-III con un anticorpo secondario alexa 488 mostra una colorazione non specifica di più cellule rendendo difficile l'imaging di strutture afferenti.Poiché né le cellule della polpa dentale né i neuroni trigeminali si disperdono facilmente, ogni ricercatore dovrà ottimizzare le proprie procedure di placcatura. Se si colturano le cellule della polpa dentale da sole in pozzi separati è possibile utilizzare l'immunofluorescenza o è possibile quantificare i livelli di RNA o proteine per determinare come le cellule della polpa dentale stanno rispondendo ai neuroni. Ricorda di sbiancare tutti i contenitori o le punte che entrano in contatto con l'adenovirus.Assicurati di scartare correttamente i rasoi in un bidone affilato.

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Biologia dello sviluppo

Dimostriamo come sezionare e cultura pulcino ganglio statoacoustic E4 ed E6 espianti midollo spinale. Espianti sono coltivate sotto siero senza condizioni in gel di collagene 3D per 24 ore. Reattività dei neuriti è testato con fattore di crescita integrata medie e con le proteine ​​rivestite perline.

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Questo video mostra una tecnica per stabilire una co-coltura di neuroni trigemino e cellule primarie della polpa dentale utilizzando un filtro transwell. In questa condizione fisicamente separata, le cellule mesenchimali ottenute dal tessuto pulpare dentale secernono molecole di segnalazione paracrina che attraversano i pori, promuovendo la differenziazione e la migrazione dei neuroni verso le cellule mesenchimali stabilendo un sistema di co-coltura.

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Questo video dimostra l'utilizzo di un dispositivo microfluidico per studiare le interazioni tra la polpa germinale dei denti e i gangli del trigemino. Mostra il posizionamento dei tessuti all'interno del dispositivo microfluidico e fornisce una visualizzazione dettagliata della crescita dei neuriti trigeminali verso il germe del dente attraverso le microscanalature del dispositivo. Inoltre, evidenzia il ruolo dei fattori molecolari derivati dai denti nel promuovere o inibire l'estensione dei...

Analisi delle interazioni tra germe dei denti e gangli del trigemino utilizzando un sistema di co-coltura microfluidica

Gangli spinali (DRG) sono strutture che contengono i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico. Quando dissociato, possono essere co-coltura con cellule staminali derivate da tessuto adiposo SC-like (ASC), che fornisce un modello valido per lo studio in vitro rigenerazione e mielinizzazione nervo, imitando l'ambiente in vivo presso il sito di lesione.

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Le co-colture rappresentano un metodo prezioso per studiare le interazioni tra nervi e tessuti e organi bersaglio. I sistemi microfluidici consentono la co-coltura di gangli e interi organi o tessuti in via di sviluppo in diversi terreni di coltura, rappresentando così un valido strumento per lo studio in vitro del crosstalk tra neuroni e i loro bersagli.

Analisi di sviluppo di denti Germ innervazione Uso di dispositivi Microfluidic Co-cultura

Forniamo i protocolli per la valutazione delle cellule staminali mesenchimali isolate da polpa dentale e interazioni delle cellule di carcinoma della prostata basati su metodi diretti e indiretti di co-coltura. Mezzo di condizione e trans-pozzo membrane sono adatte per analizzare attività paracrina indiretta. Seeding differenzialmente macchiato le cellule insieme è un modello appropriato per interazione diretto cellula-cellula.

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Qui presentiamo un protocollo per isolamento umano Dental Pulp Stem Cells e propagazione al fine di valutare l'espressione della proteina del prion durante il processo di differenziamento neuronale.

Isolamento, propagazione e l'espressione della proteina del Prion durante il differenziamento di cellule staminali polpa dentaria umana

Qui, forniamo un metodo per analizzare il comportamento degli assoni in crescita in matrici 3D, imitando il loro sviluppo naturale.

Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso

Questo articolo fornisce una guida passo passo per stabilire una coltura primaria di cellule staminali di polpa dentale utilizzando il metodo della coltura di espiantazione e la caratterizzazione di queste cellule in base alle linee guida ICSCRT. Le cellule isolate da questo protocollo possono essere considerate come cellule staminali mesenchimali per ulteriori applicazioni.

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Questo protocollo descrive i metodi per stabilire colture intere e dissociate di gangli della radice dorsale di topo (DRG) e il loro utilizzo per valutare le interazioni tumore-nervo.

Definizione di modelli in vitro di coltura dei gangli della radice dorsale: approcci complementari per lo studio del crosstalk cancro-nervo

Scopri un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali usando cellule della polpa dentale e neuroni del ganglio trigeminale. Questa tecnica consente di analizzare le interazioni cellulari in vitro.

Un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

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