Name: Regolazione magnetica del postcarico nei tessuti cardiaci ingegnerizzati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri la regolazione magnetica del postcarico nei tessuti cardiaci ingegnerizzati utilizzando supporti in silicone magnetici. Questo metodo non invasivo consente studi prolungati sulla maturazione e rimodellamento del tessuto.

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Gli autori ringraziano Jutta Starbatty per il suo sostegno al lavoro di cultura dei tessuti, Axel Kirchhof per la fotografia, Alice Casagrande Cesconetto per il lavoro di editing, e un ringraziamento speciale a B .lent Aksehirlioglu per il supporto tecnico nello sviluppo di questo dispositivo. B.B. è stato sostenuto da un sussidio del Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, M.L.R. da un Whitaker International Postdoctoral Scholar Grant e M.N.H. da fondi del D.H..

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<li>Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+physiological+heart+growth%3A+fundamental+concepts+and+new+players%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).</li>
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</ol>

TE e MNH sono co-fondatori di EHT Technologies GmbH. Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto descrive una nuova tecnica per alterare magneticamente il post-carico nei tessuti cardiaci ingegnerizzati. Questa tecnica si basa sull'uso di uno stadio piezoelettrico per tradurre una piastra di forti magneti verso e lontano da rack magneticamente reattivi di pali in silicone. Più i due set di magneti sono vicini, più forte è il postcarico sperimentato dagli EHT coltivati su di essi.
Ci sono diversi passaggi che sono fondamentali per la produzione di successo e l'u...

Il post carico è il carico sistolico sul ventricolo dopo che ha iniziato a espellere il sangue1. Durante lo sviluppo cardiaco, un afterload appropriato è di importanza critica per la maturazione cardiomiocita2. In età adulta, bassi livelli di post-carico ventricolare (ad esempio, in pazienti costretti a letto con lesioni del midollo spinale di alto livello3 o in casi molto particolari come il volo spaziale4)possono provocare ipotrofia del cuore. Al contrario, un elevato afterload può portare all'ipertrofia cardiaca5. Mentre l'ipertrofia cardiaca negli atleti di resistenza o nelle donne in gravidanza è considerata benefica e fisiologica, l'ipertrofia associata all'ipertensione arteriosa a lungo termine o alla grave stenosi della valvola aortica è dannosa in quanto predispone ad aritmie cardiache e insufficienza cardiaca6. Anche se il tasso di mortalità a 5 anni per i pazienti affetti da insufficienza cardiaca si è ridotto dal 70% negli anni '80dal 6 al 40-50%7 attualmente, c'è ancora un grande bisogno di nuove opzioni terapeutiche per questa condizione altamente prevalente (attualmente 2,2% della popolazione nel mondo occidentale)8.
Al fine di studiare i meccanismi molecolari dell'ipertrofia cardiaca patologica e per testare strategie preventive o terapeutiche per il trattamento di questa malattia, sono stati sviluppati modelli in vivo di postcarico9,10,11,12. Sebbene questi modelli abbiano offerto informazioni utili sugli effetti del postload sulle prestazioni ventricolari, non consentono un controllo preciso sulla magnitudine post-carico. In alternativa, gli studi in vitro del postcarico eseguiti su cuori eccitati e preparati muscolari consentono un controllo più preciso sul carico dei tessuti, ma questi modelli non sono favorevoli agli studi longitudinali13,14,15.
Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un modello in vitro di postload elevato in tessuti cardiaci ingegnerizzati (EHT)16,17. Questo modello è un formato di coltura tridimensionale per le cellule cardiache del ratto incorporate in una matrice di fibrina sospesa tra pali flessibili in silicone cavo. Questi tessuti battono spontaneamente (contro la resistenza dei pali in silicone) ed eseguono un lavoro auxotonico. Abbiamo aumentato il postcarico applicato agli EHT di un fattore 12 negli esperimenti precedenti mediante l'inserimento di bretelle metalliche rigide nei pali in silicone cavo per una settimana. Ciò ha portato a una moltitudine di cambiamenti, caratteristica dell'ipertrofia cardiaca patologica18,19,20: ipertrofia cardiomiocite, necrotosi parziale, un calo della forza contrattile, il compromissione del rilassamento dei tessuti, la riattivazione del programma genico fetale, uno spostamento metabolico dall'ossidazione dell'acido grasso alla glicolisi anaerobica e un aumento della fibrosi. Anche se questa procedura è stata impiegata con successo in diversi studi17,21,22, ha alcuni svantaggi. Ci sono solo due stati, basso o molto alto (12 volte) afterload, e la procedura richiede la gestione manuale degli EHT, che limita la sua flessibilità temporale e pone il rischio di contaminazione.
Recentemente, Leonard ealtri usato una tecnica simile per modulare postload in EHTs coltivati su pali in silicone23. Per limitare il loro movimento di piegatura, sono state posizionate parentesi graffe di lunghezza variabile. Gli autori di questo studio hanno riferito che un singolare aumento di piccole-medie dimensioni dello sviluppo della forza avanzata del carico e della maturazione degli EH di derivazione degli iPO umani, mentre carichi più elevati hanno portato a uno stato patologico. Tuttavia, simile al nostro sistema, questa tecnica consente solo aumenti singolari nel post-caricamento, la cui grandezza è dettata dalla lunghezza delle parentesi graffe. Come tale, le alterazioni fini nel post-caricamento, le modifiche nel postload nel tempo e i regimi di caricamento precisi non sono possibili con queste tecniche.
Qui, forniamo il protocollo per un sistema che può essere utilizzato per modulare la post-resistenza, cioè, dopo il caricamento di EHT magneticamente24. Questa piattaforma facilita la messa a punto del postload, abilita i regimi afterload definiti dall'utente e garantisce la sterilità EHT.

<table><tbody><tr><td>Piastre magnetiche cilindriche</td><td>HKCM</td><td>9962-55184</td><td>h = 14 mm, d = 13 mm</td></tr><tr><td>Cilindrici post magnetici</td><td>HKCM</td><td>9962-63571</td><td>h = 2 mm, d = 0,5 mm</td></tr><tr><td>Filo dentale</td><td>Ormco</td><td>266-1316</td><td>d = 0,016 pollici (0,406 mm)</td></tr><tr><td>GraphPad</td><td>GraphPad Software, La Jolla, California, USA</td><td>versione 6.00 per Windows</td><td></td></tr><tr><td>Software di controllo del movimento per motore piezoelettrico</td><td>Micronix USA</td><td></td><td>download gratuito sulla homepage del produttore</td></tr><tr><td>Controllore di movimento per motore piezoelettrico</td><td>Micronix USA</td><td>MMC-100-01000</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma di analisi ottica della contrattilità</td><td>EHT technologies</td><td>A0001</td><td></td></tr><tr><td>Motore lineare piezoelettrico</td><td>Micronix USA</td><td>PPS-20-15206</td><td>dotato di encoder ottico lineare, incubatore-ambiente compatibile</td></tr><tr><td>Asta Stirene</td><td>Plastruct</td><td>MR-15</td><td>d = 0,015 pollici (0,381 mm)</td></tr><tr><td>Telecamera USB</td><td>Reichelt Elektronik</td><td>REFLECTA 66142</td><td></td></tr></tbody></table>

regolazione magnetica del postcarico nei tessuti cardiaci ingegnerizzati

Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues

Il postcarico è noto per guidare lo sviluppo di stati cardiaci fisiologici e patologici. Di conseguenza, lo studio dei risultati degli stati afterload alterati potrebbe fornire importanti informazioni sui meccanismi che controllano questi processi critici. Tuttavia, attualmente manca una tecnica sperimentale per mettere a punto con precisione il post-tuning nel tessuto cardiaco nel tempo. Qui, viene descritta una tecnica basata su magnetici di recente sviluppo per ottenere questo controllo nei tessuti cardiaci ingegnerizzati (EHT). Al fine di produrre EHT magneticamente reattivi (MR-EHT), i tessuti sono montati su pali in silicone cavo, alcuni dei quali contengono piccoli magneti permanenti. Un secondo set di magneti permanenti è press-fit in una piastra acrilica in modo che siano orientati con la stessa polarità e siano assialmente allineati con i magneti del palo. Per regolare il post-carico, questa piastra di magneti viene tradotta verso (dopo il carico superiore) o in trasferta (postcarica inferiore) dai magneti postali utilizzando uno stadio piezoelettrico dotato di un encoder. Il software di controllo del movimento utilizzato per regolare il posizionamento dello stage consente lo sviluppo di regimi post-caricamento definiti dall'utente, mentre l'encoder assicura che lo stage corregge eventuali incoerenze nella sua posizione. Questo lavoro descrive la fabbricazione, la calibrazione e l'implementazione di questo sistema per consentire lo sviluppo di piattaforme simili in altri laboratori in tutto il mondo. I risultati rappresentativi di due esperimenti separati sono inclusi per esemplificare la gamma di diversi studi che possono essere eseguiti utilizzando questo sistema.

Quantificazione del magnete post rigidità Un palo in silicone magneticamente orientato orizzontalmente è stato montato in una posizione fissa, e un magnete di calibrazione allineato asalizzatamente è stato posizionato a diverse distanze definite ("spazi magneti") da questo palo. I carichi di prova di peso noto sono stati sospesi dalla fine del palo in silicone, causando la piegatura del palo. Questa deviazione è stata quantificata otticamente. È stata osservata una relazione lineare tra la forza gravi...

Questo protocollo fornisce metodi dettagliati che descrivono la fabbricazione e l'implementazione di una piattaforma di regolazione del carico di carico magnetica per tessuti cardiaci ingegnerizzati.

Regolazione magnetica del postcarico nei tessuti cardiaci ingegnerizzati

Afterload is known to drive the development of both physiological and pathological cardiac states. As such, studying the outcomes of altered afterload ...

Questo sistema può essere utilizzato per esporre tessuti cardiaci ingegnerizzati a vari regimi di post-carico, al fine di studiare gli effetti di questi stimoli sullo sviluppo, il rimodellamento e la maturazione della forza tissutale. La nostra tecnica consente di sottoscrivore con precisione i tessuti battitori a un'ampia gamma di routine post-carico personalizzabili per lunghi periodi di coltura senza nemmeno dover aprire la piastra di coltura cellulare. Il nostro metodo potrebbe essere modificato per controllare il post-carico in altri sistemi di coltura del tessuto muscolare, come il muscolo scheletrico, il muscolo liscio o il muscolo papillare asportato.Poiché il nostro approccio ai sistemi è piuttosto unico e presenta aspetti tecnici che molti scienziati non conoscono, la dimostrazione visiva può aiutare a ricreare la nostra configurazione. Per produrre i rack in silicone magneticamente reattivi, acquisire la piastra da 24 pozzi può paddle rack di pali in silicone descritti nel protocollo di testo. Utilizzando una polarità fissa, lubrificare i magneti con acqua e inserirli uno alla volta nei montanti più esterni dei rack in silicone.Utilizzare un pezzo miscelato di filo dentale in acciaio inossidabile per spingerli con cura sul fondo della cavità del palo cavo. In ogni palo possono essere impilati fino a cinque magneti. Utilizzare pinze rotonde per piegare il filo dentale in acciaio inossidabile in bretelle larghe 11,25 millimetri e lunghe 15 millimetri.Per garantire che le dimensioni corrette siano raggiunte, è possibile utilizzare una giga autoprotata per aiutare nella piegatura del filo, quindi utilizzare le frese a filo per tagliare le parentesi graffe e il file per smussare la superficie di taglio. Lubrificare le bretelle o i pali con acqua e inserirli nel rack in silicone fissando il secondo e il terzo al palo più esterno nel processo. Iniziare a preparare il post-caricamento del dispositivo di sintonizzazione come descritto nel protocollo di testo, attaccare al supporto del magnete allo stadio piezoelettrico utilizzando un materiale non magnetico, questo può essere ottenuto utilizzando un pezzo di alluminio a forma di L.Per consentire l'analisi visiva dei tessuti, installare una sorgente luminosa all'interno del dispositivo di sintonizzazione post-carico. Qui è stata utilizzata una serie di LED per illuminare l'ingegnere sui tessuti cardiaci dal basso. Per calibrare il sistema di sintonizzazione post-caricamento, montare uno dei rack in silicone e utilizzare verticalmente materiali non magnetici, in modo che i montanti in silicone magneticamente reattivi siano orientati orizzontalmente.Ora monta uno dei magneti a piastre su uno stadio lineare che viaggia orizzontalmente in modo che sia assialmente allineato con il palo magneticamente reattivo. Posizionare il magnete di calibrazione a una distanza definita dal palo in silicone magneticamente reattivo utilizzando lo stadio orizzontale. Posizionare una fotocamera sul lato di questa configurazione per poter registrare otticamente la deflessione dei pali sotto l'influenza dei carichi di prova.Assicurati che ci sia abbastanza spazio sotto il palo per appendere liberamente i carichi attaccati. Scatta una foto del post in assenza di pesi da utilizzare come riferimento per la posizione neutra dei pali. Senza cambiare la prospettiva della fotocamera, attaccare uno dei carichi all'estremità del palo in silicone, quindi scattare una foto del palo piegato sotto l'influenza del peso.Ora disegna la deflessione del palo di silicone sull'asse x contro la forza gravitazionale di ogni peso di prova sull'asse y. Questo dovrebbe produrre una relazione lineare tra forza e deflessione. Tracciare una funzione di regressione lineare passando attraverso 00 e i dati di acquisizione.La pendenza di questa funzione è la rigidità, k del palo in silicone magneticamente reattivo alla spaziatura del magnete testata. Ripetere questi passaggi con diverse spaziatura tra dmax e un dmin. Qui sono state analizzate deviazioni in otto diverse posizioni del magnete, che vanno da circa 31 millimetri a circa cinque millimetri.Molta funzione di regressione attraverso questi valori. Ad esempio, utilizzare l'adattamento non lineare, una funzione di decadimento di fase nel software di analisi. Questa funzione di regressione descrive la relazione tra spaziatura magnetica e post-carico.Per preparare il dispositivo di sintonizzazione post-caricamento per gli esperimenti, collegare il motore dello stadio piezoelettrico al controller di movimento e collegare il controller di movimento al computer. Assicurarsi che il controller di movimento sia collegato anche a una fonte di alimentazione. Quindi avviare il software della piattaforma del controller di movimento, collegare il software al motore piezo stage selezionando la porta designata come scheda di scena durante l'installazione del software di controllo del movimento e quindi fare clic sul pulsante della porta aperta.Andate al pannello di sistema, selezionate loop aperto, nel menu a discesa loop. Spostare manualmente la piastra magnetica nella posizione più alta, la dmin di spaziatura del magnete più vicina possibile. La piastra magnetica dovrebbe prendere contatto con il supporto della piastra di coltura.Ora vai al Pannello animazione, come il pulsante zero per ripristinare la posizione corrente dello stadio piezo a zero millimetri. Spostare manualmente la lama del magnete nella posizione più bassa possibile, annotare la posizione dell'encoder per determinare l'intervallo di movimento per il motore a stadio piezoelettrico. Impostate i limiti di corsa nel pannello di sistema sui valori all'interno dell'intervallo di movimento determinato nel passaggio precedente.Ciò impedisce alla lama del magnete di urtare la lama di coltura o la parte inferiore del dispositivo di sintonizzazione post-carico. Ancora una volta, spostare la lama magnetica nella posizione più alta e fare clic sul pulsante zero. Vai al pannello di sistema e cambia la modalità del ciclo di feedback in loop chiuso, in questo modo assicura che il palco correggi eventuali errori nel suo posizionamento.Fare clic sul pulsante Salva nella casella parametri archivio per archiviare queste impostazioni nel sistema. Ora posiziona la piastra di coltura di 24 pozzi contenente tessuti cardiaci ingegnerizzati su rack in silicone magneticamente reattivi sul supporto della piastra di coltura. Per calcolare la spaziatura del magnete necessaria per ottenere un postcarico desiderato, risolvere la funzione di regressione non lineare determinata in precedenza per d.Sottrarre dmin dalla spaziatura del magnete calcolata, d. Il risultato è la distanza che la piastra magnetica deve percorrere dalla sua posizione zero per ottenere il post-carico desiderato. Digitate questo valore nel campo di input Posizione destinazione uno nel pannello Movimento e fate clic su Vai (Go) per regolare il postcarico del tessuto cardiaco ingegnerizzato sul valore calcolato.Controllare un MREHT prodotto dai cuori dei topi è stato coltivato in assenza di post-carico magnetico fino a raggiungere un plateau in forza contrattile. In questo giorno, gli MREHt e gli ERU controllati avevano forze meschino simili. Nel corso della settimana successiva, il carico di lavoro esercitato sugli MREHT è stato aumentato in modo incrementale dal punto nove uno a sei punti otto cinque millinewton per millimetro, mentre il carico post-carico per il controllo degli ETT è rimasto costante.La forza contrattile media è aumentata con l'aumento del carico post-carico fino al punto nove cinque millinewton, che segna un aumento di forza di oltre tre volte rispetto al valore medio misurato per gli ETT controllati. La deflessione post,d'altra parte è diminuita rispetto ai tessuti di controllo. Nell'ultimo giorno di coltura la deflessione principale misurata per i MREHT era di un solo punto di un millimetro, rispetto al punto quattro otto millimetri per il controllo degli EHT.Gli ETT rad su pali di silicone magneticamente reattivi sono stati coltivati ad un carico minimo di 9 millimetri per millimetro fino al raggiungere un plateau e una forza contrattile. A partire da oggi, gli MREHT hanno subito un regime di post-carico di sette giorni che espone gli ETI a cicli di post-carico alternati tra il punto nove, uno e sei punti otto cinque millinewton per millimetro. Il carico di controllo degli EHT di controllo è stato mantenuto costante al punto sei zero millinewton per millimetro per l'intera durata della coltura.Le differenze osservate non erano statisticamente significative. Combinato con l'analisi ottica della contrattilità, questo metodo consente la misurazione in tempo reale della risposta contrattile a breve termine a magnitudini fluttuanti del carico post-carico, che potrebbero essere utili per studiare le proprietà fisiologiche muscolari. I magneti forti possono improvvisamente aggrapparsi l'uno all'altro, causando potenzialmente lesioni all'utente e danneggiando i magneti stessi, per evitare questo, mantenere il magnete separato a una distanza di sicurezza.

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