Effetto delle formulazioni lacrimali artificiali sull'attività metabolica delle cellule epiteliali corneali umane dopo l'esposizione all'essiccazione

Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare in un modello in vitro se le formulazioni di lacrime artificiali possono proteggere le cellule epiteliali corneali umane dall'essiccazione. Questo metodo può essere utilizzato per aiutare a identificare le formulazioni per l'occhio secco che possono aiutare nella protezione oculare per le persone con sintomi di occhio secco. Questo test utilizza una misura molto sensibile per rilevare l'attività metabolica delle cellule epiteliali corneali.

Di conseguenza, è possibile rilevare piccoli cambiamenti nella salute delle cellule corneali dovuti all'essiccazione. A dimostrare la procedura oggi saranno Parisa Mirzapour, Nijani Nagaarudkumaran e Adeline Suko. Inizia coltivando cellule epiteliali corneali umane immortalizzate in fiasche rivestite di collagene con 20 millilitri di DMEM/F12 contenenti il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica, cambiando il terreno ogni due o tre giorni.

Una volta che le cellule sono quasi confluenti, rimuovere il terreno di coltura cellulare e aggiungere da quattro a sei millilitri di terreno di dissociazione cellulare a ciascun pallone. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius fino al distacco, controllandole periodicamente al microscopio. Aggiungere da due a sei millilitri di DMEM/F12 con il 10% di FBS a ciascun pallone e trasferire il contenuto in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Centrifugare le celle a 450-500 volte g per cinque minuti. Quindi aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un terreno preriscaldato. Determinare la concentrazione cellulare con un emocitometro e calcolare il volume che contiene 100.000 cellule.

Aggiungere il terreno a ciascun pozzetto di una piastra di coltura rivestita di collagene I a 48 pozzetti, insieme al volume calcolato delle cellule, assicurandosi che il volume finale in ciascun pozzetto sia di 0,5 millilitri. Quindi incubare le cellule per 24 ore. Per la procedura di controllo, rimuovere i terreni di coltura dai pozzetti e trattare immediatamente le cellule con 150 microlitri di una formulazione di prova o di una soluzione di controllo dei terreni.

Quindi incubare le cellule per 30 minuti. Rimuovere la soluzione di prova dalle cellule e aggiungere 0,5 millilitri di soluzione colorante metabolica al 10%. Incubare le cellule per altre quattro ore.

Dopo l'incubazione, rimuovere 100 microlitri di soluzione colorante da ciascun pozzetto e trasferirlo in una piastra a 96 pozzetti. Utilizzare un lettore di piastre per misurare la fluorescenza di ciascun pozzetto, impostando l'eccitazione a 540 nanometri e l'emissione a 590 nanometri. Per eseguire la procedura di recupero, incubare le cellule con le soluzioni di prova o i controlli come descritto in precedenza.

Quindi aggiungere 0,5 millilitri di terreno DMEM/F12 a ciascun pozzetto. Incubare le cellule per 18 ore. Quindi rimuovere il terreno e testare l'attività metabolica.

Per eseguire la procedura di controllo, rimuovere i terreni di coltura dalle cellule nella piastra a 48 pozzetti e trattarli immediatamente con la formulazione di prova o la soluzione di controllo dei terreni. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere le soluzioni di prova dalle cellule e metterle in una camera a 37 gradi Celsius e 45% di umidità per cinque minuti per essiccare.

Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione colorante metabolica al 10% e incubare le cellule per quattro ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, trasferire 100 microlitri di soluzione di colorante metabolico da ciascun pozzetto a una piastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza. Per eseguire la procedura di recupero, ripetere il protocollo precedentemente descritto e includere un'incubazione di 18 ore con terreno DMEM/F12 dopo la fase di essiccazione.

Quindi eseguire analisi statistiche sui dati come descritto nel manoscritto del testo. Tre formulazioni per l'occhio secco sono state confrontate per il loro effetto sulla vitalità delle cellule epiteliali corneali umane. Le soluzioni uno e due hanno avuto un effetto significativo sull'attività metabolica delle cellule prima dell'essiccazione.

Le cellule esposte alla soluzione uno hanno mostrato un ulteriore calo dell'attività metabolica cellulare dopo un recupero di 18 ore, il che significa che inizialmente erano ferite e la lesione non è stata riparata. In confronto, la soluzione tre ha avuto solo un lieve effetto sull'attività metabolica delle cellule epiteliali. Confrontando la capacità di queste formulazioni contenenti lipidi per l'occhio secco di proteggere le cellule, è stato riscontrato che le soluzioni uno e due non proteggevano le cellule dallo stress da essiccazione.

La terza soluzione, tuttavia, offriva una certa protezione. Quando si seminano le cellule in piastre rivestite di collagene, assicurarsi che la sospensione cellulare contenga cellule miscelate uniformemente in modo che ogni pozzetto venga seminato con un numero uguale di cellule. La terza soluzione ha dimostrato un miglioramento statisticamente significativo della vitalità cellulare e della protezione dallo stress da essiccazione rispetto agli altri due prodotti contenenti lipidi.

È possibile che l'olio minerale con fosfolipidi, insieme all'HP-guar e al glicole propilenico, permettano alla soluzione tre di fornire protezione idratante alle cellule corneali e di ridurre l'evaporazione sotto essiccazione.