Name: Glicoconi coniugato omogeneo prodotto dallincorporazione combinata di aminoacidi innaturali e dalla click-chemistry a scopo vaccinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 53 s
Description: Scopri come produrre un vaccino glicoconiugato omogeneo mediante l'incorporazione di aminoacidi innaturali e la click-chemistry. Questo metodo avanzato consente di sviluppare vaccini a bersaglio specifico per immunoterapie personalizzate.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.C. riconosce con gratitudine il sostegno finanziario di La Région Pays de la Loire (Programma Pari Scientifique "BioSynProt"), in particolare una borsa di dottorato a T.V. Riconosciamo anche il Dott. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Tolosa, Francia) per i suoi preziosi consigli tecnici.

1. Sintesi della UAA: propargil-llysina (PrK)
<ol><li>Sintesi di Nα-Boc-propargil-llysina18<ol>
<li>Sciogliere 500 mg di Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) in una miscela acquosa 1 M NaOH (5 mL) e THF (5 mL) in un pallone e montare il pallone con un setto di silicio.</li>
		<li>Raffreddare il pallone in un bagno di ghiaccio e quindi aggiungere 158 μL di propargil cloroformato (1,62 mmol) dropwise (per un periodo di 2-3 minuti) utilizzando una microsiringa durante l'agitazione.</li>
		<li>Riscaldare la miscela di reazione a temperatura ambiente e continuare a mescolare per 10 ore.</li>
		<li>Raffreddare soluzioni di 50 mL di etere dietile, 50 mL di acido cloridrico acquoso da 1 M e 60 mL di acetato di etile in un bagno di ghiaccio.</li>
		<li>Raffreddare la miscela di reazione grezza in un bagno di ghiaccio e versare la miscela in un imbuto di separazione. Estrarre la miscela con 50 mL di etere dietile. Scartare lo strato organico.</li>
		<li>Aggiungere cautamente acido cloridrico acquoso da 1 M alla fase acquosa nell'imbuto di separazione. Quindi estrarre lo strato acquoso due volte usando 30 mL di acetato di etile. Verificare la presenza di N-Boc-propargil-lisina in fase organica tramite TLC usando CH2Cl2-metanolo (9:1) come eluente.</li>
		<li>Asciugare gli strati organici combinati su MgSO4,filtrare la fase solida e concentrare il filtrato sotto pressione ridotta su un evaporatore rotante.</li>
		<li>Sciogliere un campione del petroliogreggio N α -Boc-propargil-lisina in cloroformio deuterato (CDCl3)e controllarne l'identità di 1H NMR. ATTENZIONE: L'estrazione può comportare un accumulo di pressione. Rilasciare frequentemente qualsiasi accumulo di pressione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sintesi dell'amminoacido innaturale propargil-L-lisina (PrK)<ol>
<li>Introdurre Nα-Boc-propargyl-lysine in un pallone inferiore rotondo dotato di setto.</li>
		<li>Aggiungere 4 ml di diclorometano anidro (CH2Cl2) al pallone sotto argon per sciogliere la Nα-Boc-propargil-lisina.</li>
		<li>Aggiungere 4 ml di acido trifluoroacetico (TFA) dropwise usando una siringa durante l'agitazione.</li>
		<li>Mescolare la miscela di reazione per 1 h a RT. Monitorare la reazione con TLC usando CH2Cl2-metanolo (9:1) come eluente.</li>
		<li>Concentrare la miscela di reazione sotto pressione ridotta.</li>
		<li>Aggiungere l'etere dietile al residuo grezzo e incubarlo a 4 °C per 1 h per far precipitare il PrK. Quando si lavora su scala più elevata, se il PrK non è completamente precipitato, triturato per precipitarlo e prolungare il tempo di incubazione se necessario.</li>
		<li>Filtrare il PrK sotto forma di un solido bianco su un vetro fritte.</li>
		<li>Sciogliere un'aliquota del PrK in D2O. Quindi effettuare analisi NMR per controllarne l'identità e la purezza.</li>
		<li>Per un ulteriore utilizzo, sciogliere l'amminoacido innaturale PrK in acqua distillata ad una concentrazione finale di 100 mM e conservare a -20 °C come aliquote da 1 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Produzione della proteina ricombinante modificata da PrK
<ol><li>Preparazione plasmide<ol>
<li>Costruire un'espressione plasmide (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHHH) che contiene l'adessina superficiale Pneumococcica matura bersaglio A (mPsaA) gene (pET24d-mPsaA-WT) seguita da una sequenza di proteasi del virus dell'incisione sul tabacco (TEV) clonando l'inserto tra i siti di restrizione BamHI e XhoI del plasmide pET24d. Questo introdurrà un tag His6 al C-terminale della proteina. Sostituire il codone della lisina-32 con il codone ambrato (TAG), usando la tecnica convenzionale di mutagenesi site-directed.</li>
		<li>Costruire una seconda espressione plasmide (pEVOL-MmPylRS) contenente due copie del gene codificante per la pirrolisil-tRNA sintetasi da Methanosarcina mazei (MmPylRS) e la codifica genica per il corrispondente tRNAPyr come precedentementedescritto 19. Utilizzare questo vettore plasmide appositamente progettato, pEVOL, per un'efficiente incorporazione di UAA. NOTA: Le informazioni dettagliate sui plasmidi sono descritte nel file supplementare 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Co-trasformazione dei plasmidi nel ceppo di espressione<ol>
<li>Scongelare un'aliquota di 100 μL di Escherichia coli BL21(DE3) chimicamente competente sul ghiaccio per 5 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 1 μL di ogni plasmide (50-100 ng di ciascuno) nelle cellule e incubare per 30 minuti sul ghiaccio.</li>
		<li>Trasferire il microtubo da 1,5 mL con le celle competenti scongelate in un incubatore a 42 °C per 45 s e quindi spostarlo di nuovo sul ghiaccio per 2 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 900 μL di mezzo LB e incubare sotto scuotimento per 1 h a 37 °C per consentire l'espressione antibiotica. Quindi placcare i batteri sull'agar LB con 25 μg/mL di kanamicina e 30 μg/mL di cloramfenicolo. Consentire la crescita dei batteri durante la notte a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Espressione di proteine modificate con PrK<ol>
<li>Inoculare una singola colonia co-trasformata in 5 mL di mezzo LB con antibiotici (25 μg/mL di kanamicina e 30 μg/mL di cloramfenicolo). Incubare durante la notte a 37 °C con agitazione.</li>
		<li>Diluire la coltura primaria (5 mL) in 500 mL di mezzo auto-induzione contenente antibiotici, 0,02% di L-arabinosi e 1 mM dell'amminoacido innaturale PrK e incubarlo a 37 °C per 24 ore con scuotimento. Includere un controllo negativo eseguendo la coltura senza PrK in parallelo e un controllo positivo eseguendo la coltura di un clone contenente la proteina wt.</li>
		<li>Aliquota 5 mL del mezzo di coltura da 500 mL e centrifuga per 10 min a 5.000 x g. Scartare il supernatante e congelare il pellet a -20 °C. Cellule di raccolta dai restanti 495 mL per centrifugazione per 10 min a 5.000 x g. Scartare il supernatante e congelare il pellet a -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Analizzare gli estratti di cellule grezze dai campioni di coltura da 5 mL mediante SDS-PAGE e l'analisi western Blot<ol>
<li>Resuspend 5 mL cell pellets in 250 μL di tampone dilisi (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0,2 mM PMSF) e trasferirlo in un microtubo da 1,5 mL.</li>
		<li>Le cellule lyse congelando i tubi in azoto liquido, scongelandosi in un bagno di 42 °C e vortice ad alta velocità per 30 s. Ripetere questo passaggio 3 volte.</li>
		<li>Centrifugare campioni a 17.000 x g per 10 minuti per eliminare i detriti cellulari.</li>
		<li>Prendere 10 μL del supernatante e aggiungere 5 μL di acqua e 5 μL di tampone di carico (blu bromofenolo, SDS, β-mercaptoetanolo). Riscaldare i campioni per 5 minuti a 100 °C ed effettuare analisi SDS-PAGE e western Blot.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificazione proteica mediante cromatografia di affinità del banco di flusso gravitazionale con perline Nickel-NTA<ol>
<li>Rimescolare il pellet di cellule (dalla coltura di 495 mL) in 20 mL di tampone di lysis (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazolo, 0,2 mM PMSF).</li>
		<li>Aggiungere 5 μL di DNasi I (1 mg/mL) e 500 μL di lisozima (50 mg/mL) nella sospensione e consentire la lisi incubando la sospensione a 37 °C durante 30 min.</li>
		<li>Sonicare le cellule durante 5 min (cicli di 5 s-5 s, ampiezza 50%) quindi rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 20.000 x g per 30 minuti seguita da filtrazione su filtro da 0,45 μm.</li>
		<li>Aggiungere la resina Ni-NTA alla sospensione (500 μL per 500 mL di coltura cellulare) e mescolare delicatamente a 4 °C per 1 h.</li>
		<li>Versare la sospensione in una colonna di polipropilene e raccogliere la frazione non vincolata.</li>
		<li>Lavare la resina con 10 mL di tampone di lavaggio contenente 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazolo. Lavare la resina una seconda volta con 5 mL di tampone di lavaggio (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 20 mM imidazolo). Raccogliere le frazioni di lavaggio.</li>
		<li>Eluire la proteina contrassegnata con 1 mL di tampone di eluizione (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazolo). Ripetere questo passaggio 4 volte e raccogliere tutte le frazioni di eluizione.</li>
		<li>Analizzare il lisato grezzo e le 7 frazioni di purificazione di SDS-PAGE su un gel di acrilammide al 12%.</li>
		<li>Unire le frazioni contenenti pura proteina his-tagged e dializzarla contro 1 L di tampone di proteasi TEV (50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) durante la notte utilizzando una membrana di dialisi (cut-off MW 6000-8000 Da). Misurare la concentrazione della proteina a 280 nm con un coefficiente di estinzione molare di 37 360 cm-1-M-1 e un peso molecolare di 34,14 kDa per mPsaA.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Rimozione dell'etichetta di istidina mediante digestione della proteasi TEV
<ol><li>Raccogliere il campione proteico in un tubo da 50 ml e aggiungere tampone TEV (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) fino a 1 mL ad una concentrazione di 2 mg/mL. NOTA: La concentrazione può variare in base ai risultati precedenti. Le concentrazioni proteiche che abbiamo testato sono in una tipica gamma di 2-3 mg/mL.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di proteasi TEV (aggiungere 1 μL contenente 10 unità di proteasi TEV per 20 μg di proteine da digerire).</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di 0,1 M ditiothiothreitol (DTT).</li>
	<li>Completo di tampone TEV (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) fino a 5 mL.</li>
	<li>Incubare durante la notte a 4 °C con scuotimenti lenti. NOTA: Se la digestione non è completa, aggiungere più proteasi TEV, incubare più a lungo o a temperatura più alta fino a 30 °C.</li>
	<li>Dializzare la proteina digerita per rimuovere l'EDTA a 4 °C durante la notte utilizzando una membrana di dialisi (cut-off 6000-8000 Da) contro tampone fosfato (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM imidazolo).</li>
	<li>Per eliminare la proteasi TEV e la proteina non digerita, incubare il mix con perline Ni-NTA e mescolare delicatamente per 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Versare la sospensione in una colonna di polipropilene. Raccogliere la frazione non vincolata e lavare la colonna con 5 mL di tampone di lavaggio (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazolo) NOTA: La proteina di interesse deve essere recuperata nelle frazioni non vincolate e di lavaggio.</li>
	<li>Elute la proteasi TEV e la proteina non digerita aggiungendo 5 mL di tampone di eluizione (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazolo) sulla colonna. Controllare le frazioni per il contenuto proteico a 280 nm e mediante analisi SDS-PAGE.</li>
	<li>Controllare l'efficienza della digestione caricando campioni digeriti su una PAGINA SDS con la proteina non digerita come controllo.</li>
	<li>Dializzare la proteina digerita contro 1 L di click buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH8) a 4 °C durante la notte con una membrana di dialisi (cut-off 6000-8000 Da) per rimuovere l'imidazolo e scambiare il tampone, e misurare la concentrazione della proteina a 280 nm con coefficiente di estinzione molare e peso molecolare di mPsaA (37 360 cm-1-M-1 e MW 34,14 kDa).</li>
</ol>4. Valutazione dell'accessibilità e della funzionalità innaturale dell'amminoacido propargil-licosina per la chimica dei clic
NOTA: Coniugare la mPsaA con 6-esacloro-fluoresceina-azide utilizzando il protocollo descritto da Presolski etal.
<ol><li>Assumere 432,5 μL di proteine mutate con PrK ad una concentrazione di 57,8 μM in un microtubo da 2 mL. NOTA: È accettabile una concentrazione minima di 2 μM di alchine. Se la concentrazione proteica è inferiore, concentrarla con un concentratore centrifugo o favorire l'equilibrio della reazione aumentando il rapporto molare azide/alchine.</li>
	<li>Aggiungere 10 μL di 5 mM 6-esacloro-fluoresceina-azide e quindi aggiungere una premiscele di 2,5 μL di soluzione di CuSO4 a 20 mM e 7,5 μL di Tris(benziltriazolilmetil)ammina (THPTA) a 50 mM (concentrazioni di soluzioni stock).<ol>
<li>Aggiungere 25 μL di cloridrato acquoso di 100 mM di aminoguanidina.</li>
		<li>Aggiungere 25 μL di 20 mg/mL una soluzione acquosa estemporaneamente preparata di ascorbato di sodio.</li>
		<li>Chiudere il tubo, mescolare invertendo più volte e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.</li>
		<li>Interrompere la reazione aggiungendo 50 μL di 0,5 M EDTA.</li>
		<li>Prendere 15 μL della miscela di reazione e metterla in un microtubo, aggiungere 5 μL di tampone di carico (blu bromofenolo, SDS, β-mercaptoetanolo), riscaldare la miscela a 100 °C per 5 minuti, quindi caricarla in un gel di acrilammide al 12%. Dopo la migrazione, visualizzare il coniugato fluorescente sul gel sotto la luce UV a 312 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Coniugazione di mPsaA con un antigene di carboidrati funzionalizzato all'azido (Pn14TS-N3) mediante la chimica dei clic
<ol><li>Accoppiamento<ol>
<li>Assumere 432,5 μL di proteine mutate con PrK a 57,8 μM in un microtubo da 2 mL.</li>
		<li>Aggiungere 10 μL di 5 mM Pn14TS-N321 in acqua, quindi aggiungere una premiscela di 2,5 μLdi soluzione CuSO 4 a 20 mM e 7,5 μL di THPTA a 50 mM. NOTA: Sintesi di Pn14TS-N3, un tetrasaccaride che imita il polisaccaride capsulare Streptococcus pneumoniae sierotipo 14, è stato descritto nel riferimento 21. Teoricamente, può essere utilizzato qualsiasi antigene di carboidrati contenente una funzione di azide.</li>
		<li>Aggiungere 25 μL di cloridrato di aminoguanidina da 100 mM.</li>
		<li>Aggiungere 25 μL di 20 mg/mL di soluzione acquosa estemporanea di ascorbato di sodio.</li>
		<li>Chiudere il tubo, mescolare invertendo più volte e incubare a RT durante 2 h.</li>
		<li>Interrompere la reazione aggiungendo 50 μL di 0,5 M EDTA.</li>
		<li>Prelevare 15 μL di campioni e analizzare tramite SDS-PAGE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificazione del gel di filtrazione del glicoconi coniugato<ol>
<li>Purificare il glicoconi coniugato applicandolo a una colonna di agarosio ad esclusione sterica (dimensioni del letto 15 x 600, intervallo di frazionamento 3.000-70.000), equilibrata con tampone PBS da 100 mM, pH 7,3 a un flusso di 0,8 mL/min con rilevamento a 280 nm.</li>
		<li>Raccogliere le frazioni contenenti il glicoconi coniugato. NOTA: Per una conservazione prolungata, dializzare il glicoconi coniugato contro 1 L di H2O due volte per 2 ore e poi durante la notte a 4 °C utilizzando la membrana di dialisi (cut-off Mw 6000-8000 Da), quindi congelare e conservare il glicoconi coniugato a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoconjugate+vaccines%3A+Principles+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms.</a> Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).</li>
<li>Verez-Bencomo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+conjugate+polysaccharide+vaccine+against+Haemophilus+influenzae+type+b%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b.</a> Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).</li>
<li>Berti, F., Adamo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+glycoconjugate+vaccines%3A+an+overview+of+classic+and+modern+approaches+for+protein+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification.</a> Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).</li>
<li>Stefanetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-Protein+Connectivity+Impacts+on+the+Immunogenicity+of+Site-Selective+Salmonella+O-Antigen+Glycoconjugate+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).</li>
<li>Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+production+of+recombinant+glycoconjugate+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines.</a> NPJ Vaccines. 4, 16(2019).</li>
<li>Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+adjacent+to+glycosylation+sites+impacts+immunogenicity+of+glycoconjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine.</a> Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).</li>
<li>Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coordinated+synthesis+and+conjugation+strategy+for+the+preparation+of+homogeneous+glycoconjugate+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).</li>
<li>Pillot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Conjugation+for+Fully+Controlled+Glycoconjugate+Vaccine+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation.</a> Frontiers in Chemistry. , (2019).</li>
<li>Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+unnatural+amino+acids+to+study+and+engineer+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).</li>
<li>Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+logical+codon+reassignment+-+Expanding+the+chemistry+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology.</a> Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).</li>
<li>Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Development+of+Genetic+Code+Expansion+for+Posttranslational+Modification+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies.</a> Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).</li>
<li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specifically+Labeled+Immunoconjugates+for+Molecular+Imaging--Part+2%3A+Peptide+Tags+and+Unnatural+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+imaging+and+biology%3A+MIB%3A+the+official+publication+of+the+Academy+of+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids.</a> Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).</li>
<li>Kularatne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CXCR4-targeted+site-specific+antibody-drug+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).</li>
<li>WIPO. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids. , https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS)&maxRec=11858 (2018).</li>
<li>Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+incorporation+of+non-standard+amino+acids+using+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis.</a> FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).</li>
<li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+Genetic+Code+in+Cells+and+Animals%3A+Biological+Considerations+and+Impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).</li>
<li>Brabham, R., Fascione, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysine+Amber+Stop-Codon+Suppression%3A+Development+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%3A+A+European+Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications.</a> Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).</li>
<li>Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Click+Chemistry+for+Bioconjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).</li>
<li>Prasanna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semisynthetic+glycoconjugate+based+on+dual+role+protein%2FPsaA+as+a+pneumococcal+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%3A+Official+Journal+of+the+European+Federation+for+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).</li>
<li>Morrison, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+psaA+in+all+90+serotypes+of+Streptococcus+pneumoniae+by+PCR+and+potential+of+this+assay+for+identification+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).</li>
<li>Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+immunogenicity+of+capsular+polysaccharide-surface+adhesin+A+%28PsaA%29+conjugate+of+Streptococcuspneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae.</a> Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).</li>
<li>Safari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+smallest+structure+capable+of+evoking+opsonophagocytic+antibodies+against+Streptococcus+pneumoniae+type+14%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14.</a> Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).</li>
<li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).</li>
<li>Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+pneumococcal+surface+antigen+PsaA+reveals+a+metal-binding+site+and+a+novel+structure+for+a+putative+ABC-type+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein.</a> Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).</li>
<li>Wright, T. H., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+mutagenesis+for+installation+of+natural+and+unnatural+amino+acid+side+chains+into+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins.</a> Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).</li>
<li>Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+modified+proteins+via+functionalization+of+dehydroalanine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).</li>
<li>Worst, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residue-specific+Incorporation+of+Noncanonical+Amino+Acids+into+Model+Proteins+Using+an+Escherichia+coli+Cell-free+Transcription-translation+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).</li>
<li>Carboni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GBS+type+III+oligosaccharides+containing+a+minimal+protective+epitope+can+be+turned+into+effective+vaccines+by+multivalent+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La mutagenesi site-directed è una strategia semplice per incorporare aminoacidi specifici in una posizione definita di una proteina che rimane a malapena utilizzata con l'obiettivo di preparare vaccini glicoconi coniugati7,8,14. La mutagenesi classica basata sull'approccio dei 20 amminoacidi naturali è altamente efficiente poiché non è richiesta alcuna modifica della macchina di traslazione. Le mutazioni della cisteina sono soli...

I vaccini glicoconi coniugati sono elementi essenziali dell'arsenale vaccinale disponibile per il trattamento profilattico delle malattie infettive. Sono sicuri, ben tollerati ed efficienti in un'ampia fascia d'età, compresi i bambini piccoli. Forniscono la difesa ottimale contro le infezioni causate da batteri capsulati come meningococco, pneumococco o Haemophilus influenzae di tipo b1. I vaccini glicoconi coniugati sono fatti di polisaccaridi batterici purificati che formano le capsule di batteri o oligosaccaridi sintetici che imitano questi polisaccaridi espressi insuperficie 2, che sono covalentemente collegati a una proteina portante. La presenza di una proteina portante è essenziale per promuovere risposte immunitarie umoriche protettive dirette contro il determinante antigenico espresso dagli antigeni dei carboidrati3. Oltre a un'attenta selezione e produzione dell'antigene dei carboidrati, le caratteristiche note per esercitare un'influenza sull'efficacia di un vaccino glicoconi coniugato sono: la natura della proteina portante, la chimica coniugazione (compresa la natura e la lunghezza del linker se usato), o il rapporto saccaride / proteina3. Ovviamente, le posizioni in cui il saccaride è coniugato alla proteina e il numero di punti di connettività sono rilevanti per l'immunogenicità. Ad oggi, questi due parametri sono stati appena studiati perché la preparazione dei glicoconi coniugati rimane in gran parte empirica. La loro sintesi di solito si basa sull'uso di funzioni di ammina o acido carbossilico rispettivamente di lysine o residui della catena laterale dell'acido aspartico / glutammico presenti sulla sequenza proteica portante. Questo porta non a un singolo ma a una miscela eterogenea di glicoconi coniugati.
Giocare sulla reattività, l'accessibilità o la distribuzione dei residui di amminoacidi nella proteina dà origine a glicoconi coniugati più definiti che sono più affidabili per documentare l'effetto della connettività saccharide /proteina 4. Un passo avanti verso questo obiettivo può essere raggiunto applicando la tecnologia di accoppiamento del glico proteico, un processo ricombinante che consente la produzione di vaccini glicoconi coniugati controllati nelle fabbriche dicellule 5,6. Tuttavia, la glicosilazione avviene esclusivamente con un residuo di asparagina all'interno dei sequoni D/EXNYS/T (per cui X è uno dei 20 amminoacidi naturali), non naturalmente presente sulle proteine portanti.
La mutagenesi selettiva del sito e in particolare l'incorporazione delle cisteine per sfruttarne la reattività altamente e selettiva appare comealternativa 7,8. La produzione di proteine portanti che incorporano UAA nella loro sequenza può offrire ancora più flessibilità per la preparazione omogenea del vaccino glicoconi coniugato. Più di 100 UAA sono stati sviluppati e ulteriormente incorporati in varie proteine9,10. Molti di essi contengono funzioni bioorthogonali solitamente utilizzate per effettuare modifiche post trasizionali11 o per innestare sonde biofisiche12 o farmaci13, ma che sono maniglie ideali per un'ulteriore coniugazione con antigeni di carboidrati. Esempi di successo sono stati rivendicati da Biotech14 utilizzando la sintesi proteica priva di cellule15, ma la preparazione di vaccini glicoconi coniugati secondo questa strategia aspetta ancora di diventare popolare.
L'applicazione della strategia in vivo per la produzione di proteine portanti mutate necessita di un macchinario traslazionale modificato che includa un codone specifico, un tRNA che riconosca il codone e un amminoacil-tRNA sintetasi (aaRS) che catalizza specificamente il trasferimento dell'UAA sul tRNA (Figura 1)16. La soppressione del codone di arresto dell'ambra pirrolisina è uno dei metodi più utilizzati per incorporare la UAA, in particolare la propargil-llysina (PrK)17. Quest'ultimo può a sua volta reagire con haptens di carboidrati funzionalizzati all'azido per fornire glicoconi coniugati completamente definiti e omogenei. Nel presente manoscritto descriviamo come sintetizzare la propargyl-L-lisina, una UAA che porta una maniglia di alchine, come incorporarla in una proteina bersaglio durante la sua traduzione in un batterio e infine come eseguire la coniugazione tra la proteina modificata e un hapten che porta una funzione di azide usando la chimica dei clic.

<table><tbody><tr><td>AIM (autoinductif medium)</td><td>Formedium</td><td>AIMLB0210</td><td>Solid powder</td></tr><tr><td>Boc-Lys-OH</td><td>Alfa-Aesar</td><td>H63859</td><td>Solid powder</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>Merck Novagen</td><td>69450</td><td>E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) &lambda; (DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(&lambda; S)Membrana</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>per dialisi</td></tr><tr><td>Filtro DNAseI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 &; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arabinosio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lisozima</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina Ni-NTA</td><td>Machery Nagel</td><td>Protino</td><td>Ni-NTA perle in sospensione in etanolo al 20%</td></tr><tr>Dispositivo <td></td><td></td><td></td><td>centrifugo Pall</td></tr><tr><td>pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH</td><td>questo studio</td><td></td><td>è lo stesso di pET24d-mPsaA-WT ma con una mutazione K32TAG nel Gene mPsaA</td></tr><tr><td>pET24d-mPsaA-WT</td><td>questo studio</td><td></td><td>Plasmide pET24d con il gene Wt mPsaA clonato tra i siti di restrizione BamHI e XhoI con una sequenza di proteasi TEV seguita da un tag His6 all'estremità C-terminale del gene mPsaA e portante il gene di resistenza alla Kanamicina</td></tr><tr><td>pEVOL</td><td>plasmide dono da Edward Lemke EMBL (ref 19)</td><td></td><td>con origine p15A, due copie di MmPylRS (una sotto il promotore GlnS e una sotto il promotore pAra), una copia del tRNACUA sotto il promotore ProK, il gene di resistenza al cloramfenicolo</td></tr><tr><td>Propargyl cloroformiato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>460923</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Sonicator</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB120-220</td><td></td></tr></tbody></table>

glicoconi coniugato omogeneo prodotto dall'incorporazione combinata di aminoacidi innaturali e dalla click-chemistry a scopo vaccinale

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

L'espansione del codice genetico è un potente strumento per introdurre amminoacidi innaturali (UAA) nelle proteine per modificarne le caratteristiche, studiare o creare nuove funzioni proteiche o avere accesso ai coniugati proteici. Fermare la soppressione del codone, in particolare la soppressione del codone ambrato, è emerso come il metodo più popolare per introdurre geneticamente gli UAA in posizioni definite. Questa metodologia è applicata alla preparazione di una proteina portante contenente una UAA che ospita un gruppo funzionale bioorthogonale. Questo manico reattivo può essere successivamente utilizzato per innestare in modo specifico ed efficiente un oligosaccaride sintetico hapten per fornire un vaccino omogeneo glicoconi coniugato. Il protocollo è limitato alla sintesi dei glicoconi coniugati in un rapporto 1:1 di carboidrati hapten/proteina portante ma suscettibile a numerose coppie di gruppi funzionali biorthogonali. L'omogeneità del vaccino glicoconi coniugato è un criterio importante per garantire una caratterizzazione fisico-chimica completa, soddisfacendo così sempre più esigenti le raccomandazioni delle agenzie di regolamentazione dei farmaci, un criterio che non è soddisfatto dalle classiche strategie di coniugazione. Inoltre, questo protocollo consente di ottimizzare finemente la struttura dell'attuale vaccino coniugato, dando origine a strumenti per affrontare le relazioni struttura-immunogenicità.

In questo progetto è stato preparato un vaccino omogeneo glicoconi coniugato utilizzando la strategia di soppressione del codone amber stop per introdurre un UAA in un sito definito (Figura 1). L'adessina superficiale pneumoccocale A è stata selezionata come proteina portante. Questa proteina è altamente conservata ed espressa da tutti i ceppi di Streptococcus pneumoniae22. È altamente immunogenico e precedentemente utilizzato...

L'espansione del codice genetico viene applicata per l'introduzione di un amminoacido innaturale che porta un gruppo funzionale biorthogonale su una proteina portante in un sito definito. La funzione biorthogonale viene ulteriormente utilizzata per l'accoppiamento site-selective di un antigene di carboidrati per fornire un vaccino glicoconi coniugato omogeneo.

Glicoconi coniugato omogeneo prodotto dall'incorporazione combinata di aminoacidi innaturali e dalla click-chemistry a scopo vaccinale

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre un vaccino glicoconi coniugato omogeneo combinando l'incorporazione di amminoacidi non canonici e la click-chemistry. L'espansione del codice genetico è un potente strumento per incorporare amminoacidi innaturali nelle proteine per modificarne le caratteristiche, studiare o creare nuove funzioni proteiche o avere accesso ai coniugati proteici. Un metodo di soppressione del codone è emerso come il metodo più popolare per incorporare amminoacidi innaturali in diverse posizioni.Questa metodologia sarà qui applicata alla produzione di un portatore proteico contenente un amminoacido innaturale che ospita un gruppo funzionale bioorthogonale. Questo manico reattivo può essere successivamente utilizzato per innestare in modo specifico ed efficiente un oligosaccaride sintetico hapten per fornire un vaccino omogeneo glicoconi coniugato. La propargil-llysina, PrK, è sintetizzata in due fasi dalla Boc-llysina commerciale.Nel primo passo, l'amminogruppo non protetto della Boc-lisina viene convertito in propargyl cloroformato. In un secondo passaggio, l'amminogruppo alfa è de-protetto. Per sintetizzare la N(alfa)Boc-propargil-lisina, sciogliere prima 500 milligrammi di Boc-lisina nella miscela di cinque millilitri di acquoso naoh molare e cinque millilitri di THF in un pallone e montare il pallone con un setto di silicio.Raffreddare il pallone in un bagno di ghiaccio e attendere che la polvere venga sciolta. Quindi aggiungere il propargyl cloroformato drop-wise per un periodo di due o tre minuti sotto agitazione. Riscaldare la miscela di reazione a temperatura ambiente e continuare l'agitazione per 10 ore.Raffreddare le soluzioni di etere dietile, acquoso acido cloridrico molare e acetato di etile. Raffreddare la miscela di reazione grezza in un bagno di ghiaccio. Versare il composto in un imbuto di separazione.Estrarre una miscela con cinquanta millilitri di etere dietile. L'estrazione può comportare un accumulo di pressione, assicurarsi di rilasciare frequentemente qualsiasi accumulo di pressione. Raccogliere la fase acquosa e scartare lo strato organico.Aggiungere con cautela, cinquanta millilitri di un acido cloridrico molare alla fase acquosa nell'imbuto di separazione. Quindi, estrarre lo strato acquoso due volte usando trenta millilitri di acetato di etile. Raccogli la fase organica, verifica la presenza del tuo composto da TLC.In questa fase, dovrebbe essere in fase organica. Asciugare gli strati organici combinati sul solfato di magnesio. Filtrare la fase solida.E concentrare il filtrato sotto pressione ridotta su un evaporatore rotante. Sciogliere il campione del petrolio grezzo N(alfa)Boc-propargil-lisina in cloroformio deuterato e controllarne l'identità mediante NMR. Per sintetizzare la propargil-L-lisina, introdurre la N(alfa)Boc-propargil-lisina in un pallone a bottone rotondo dotato di setto.Aggiungere quattro millilitri di diclorometano anidro nel pallone sotto argon. Aggiungere, per quanto riguarda la goccia, quattro millilitri di acido trifluoroacetico sotto agitazione. Sostituire il setto di silicio per un coperchio di vetro per evitare che il TFA danneggi il setto di silicio.Mescolare la miscela di reazione per un'ora a temperatura ambiente. Verificare la deprotezione del Boc-PrK da parte di TLC. Concentrare la miscela di reazione sotto pressione ridotta.Aggiungere l'etere dietile al residuo grezzo. Filtrare la propargil-L-lisina sotto forma di un solido bianco su un bicchiere fritte. Sciogliere un'aliquota della propargil-L-lisina nell'ossido di deuterio, quindi effettuare analisi NMR per controllarne l'identità e la purezza.La propargil-L-lisina viene quindi sciolta in acqua distillata alla concentrazione finale di cento millimolare e conservata a meno 20 gradi in aliquote millilitre. Per co-trasformare i plasmidi nel ceppo di espressione, scongelare un'aliquota di cento microlitri di E.Coli BL21 chimicamente competente sul ghiaccio per cinque minuti. Aggiungere un microlitro di ogni plasmide o da cinquanta a cento nanogrammi di ciascuno nelle cellule e incubarli per 30 minuti sul ghiaccio.Incubare le cellule competenti a 42 gradi, per 45 secondi. Quindi, rimetteteli in ghiaccio per due minuti. Aggiungere novecento microlitri di mezzo LB e incubare sotto scuotimento per un'ora a 37 gradi per consentire l'espressione degli antibiotici.Quindi placcare i batteri trasformati sull'agar LB con antibiotici. Consentire ai batteri di crescere durante la notte a 37 gradi. Per esprimere proteine modificate con PrK, inoculare una singola colonia co-trasformata in cinque millilitri di mezzo LB con antibiotici.Incubare durante la notte a 37 gradi con tremori. Il giorno dopo, diluire con i cinque millilitri della coltura primaria in cinquecento millilitri di mezzo auto-induzione contenente antibiotici, 0,02% di L-arabinosi e un millimolare di PrK e incubare a 37 gradi per 24 ore sotto scuotimento. Includere un controllo negativo eseguendo la coltura senza PrK e il controllo positivo eseguendo la coltura di un clone contenente il gene proteico di tipo selvatico.Raccogliere le cellule dalla coltura notturna per centrifugazione a 5.000 x g per 10 minuti. Scartare il supernatante e congelare il pellet a meno 20 gradi. Per la purificazione della proteina mediante cromatografia di affinità del banco di flusso gravitazionale, rimescolare il pellet cellulare in venti millilitri di tampone di lysis.Aggiungere la DNasi I e il lisozima e consentire la lisi incubando la sospensione a 37 gradi per 30 minuti. Sonicare le cellule nel ghiaccio per cinque minuti, quindi rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 20.000 x g per 30 minuti. Filtrate il lysate con filtro da 0,45 micrometri Aggiungere la resina Ni-NTA alla sospensione.Mescolato delicatamente a quattro gradi per un'ora. Versare la sospensione in una colonna di polipropilene e raccogliere la frazione non vincolata. Lavare la resina con dieci millilitri e poi cinque millilitri di tampone di lavaggio.Raccogliere le frazioni di lavaggio. Elute la proteina His-tagged con un millimetro di tampone di eluizione e ripetere questo passaggio quattro volte e raccogliere tutte le frazioni aggiuntive. Unire le frazioni contenenti proteine pure taggate all'istidina e dializzarle in un litro di tampone di proteasi TEV durante la notte utilizzando la membrana di dialisi.Raccogliere il campione proteico in un tubo da 50 millilitri e aggiungere il tampone TEV per ottenere una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro in un volume finale di un millilitro. Aggiungere cento microlitri di proteasi TEV. Aggiungere 50 microlitri di DTT molare 0,1.Completo di tampone TEV fino a cinque millilitri. Incubare durante la notte a quattro gradi, con scuotimenti lenti. Per rimuovere l'EDTA, dializzare la proteina a quattro gradi durante la notte utilizzando membrana dialisi e tampone fosfato con cinque imidazolo millimolare.Per eliminare la proteasi TEV e le proteine non digerite, incubare il mix con perline Ni-NTA e mescolare delicatamente per un'ora a quattro gradi. Versare la sospensione in una colonna di polipropilene. Raccolta della frazione non vincolata.La proteasi TEV e le proteine non digerite rimangono legate alle perline e la proteina digerita viene eluita. Lavare la colonna con cinque millilitri di tampone di lavaggio e raccogliere anche le frazioni di lavaggio. Dializzare la proteina digerita contro un litro di tampone click a quattro gradi durante la notte con membrana di dialisi per rimuovere l'imidazolo e scambiare il tampone.E misurare la concentrazione della proteina a 280 nanometri. Per coniugare la mPsaA con 6-esacloro-fluoresceina-azide, o un antigene di carboidrati funzionalizzato all'antidoto, mettere la proteina mutata PrK ad una concentrazione di 57,8 micromolare in un microtubo da due millilitri. Aggiungere 10 microlitri di cinque composti millimolare di azide, quindi aggiungere un pre-mix di soluzione di solfato di rame e THPTA.Aggiungere il cloridrato di aminoguanidina. Aggiungere la soluzione acquosa estemporaneamente preparata di ascorbato di sodio. Chiudere il tubo, mescolare invertendo più volte e incubare a temperatura ambiente per due ore.Interrompere la reazione aggiungendo EDTA. Controlla la coniugazione nella pagina SDS. Dopo la migrazione, visualizzare il gel sulla luce UV a 312 nanometri per il coniugato con fluoresceina.Oppure macchiare il gel con Coomassie Blue per visualizzare il coniugato con l'antigene dei carboidrati. Come aggiunta degli hapten dovrebbe indurre un cambiamento di peso molecolare. Purificare il glicoconi coniugato applicandolo a una colonna di filtrazione gel equilibrata con PBS.Raccogliere le frazioni contenenti i glicoconi coniugati. Per una conservazione prolungata, dializzare il glicoconi coniugato contro l'acqua distillata, quindi congelare e conservare il glicoconi coniugato a meno 80 gradi. Il PrK è stato introdotto nella posizione 32 in sostituzione di una lsina vicino al capolinea N del PsaA.L'efficacia della produzione di mPsaA è stata controllata dalla pagina SDS e dall'analisi western blot utilizzando anticorpi anti-istidina tag. La presenza di una proteina a figura intera indica fortemente il successo dell'incorporazione del PrK. L'intensità è tuttavia inferiore a quella osservata per i parlamentari di tipo selvaggio.Il mPsaA(K32PrK) è stato purificato sulle perline Ni-NTA. Con una resa tipica di otto milligrammi e l'incorporazione del residuo prk è stata infine confermata dalla spettrometria di massa. L'etichetta istidina è stata rimossa dopo la scissione proteolitica usando la proteasi TEV.Avendo la mPsaA(K32PrK) la reattività dell'alchine è stata valutata utilizzando una fluoresceina funzionalizzata all'azido e ulteriormente utilizzata per coniugare un antigene oligosaccaride sintetico. Gli esperimenti sono stati fatti rispetto al mPsaA di tipo selvaggio come controllo. Infine, il glicoconi coniugato è stato purificato dalla filtrazione del gel e la sua identità confermata dalla spettrometria di massa.In questo progetto, sono stati preparati vaccini omogenei per il glicoconi coniugato utilizzando la tecnologia di soppressione del codone di arresto ambrato per incorporare un amminoacido innaturale in siti definiti. L'omogeneità del vaccino glicoconi coniugato è un criterio importante per garantire una caratterizzazione fisico-chimica completa. E così, soddisfacendo sempre più esigenti le raccomandazioni dell'agenzia del farmaco.Questo criterio non è soddisfatto utilizzando il classico metodo di coniugazione pura. Inoltre, questo protocollo consente di ottimizzare finemente la struttura del vaccino glicoconi coniugato. Dando origine a uno strumento senza precedenti per studiare la relazione tra l'omogeneità e la struttura di un glicoconi coniugato.

homogeneous-glycoconjugate-produced-combined-unnatural-amino-acid

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

In questo articolo, un metodo ad alta velocità viene presentato per la sintesi di oligosaccaridi e fissaggio alla superficie delle nanoparticelle polianidride per ulteriore uso in mira specifici recettori sulle cellule presentanti l'antigene.

High-throughput sintesi dei carboidrati e funzionalizzazione di nanoparticelle polianidride

Particelle di adenovirus sono progettati per contenere l'innaturale azidohomoalanine analogo dell'acido amino o lo zucchero...

Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare una prova di principio di tipo bivalente adenovirus 5 (Ad5) vettore Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 utilizzando la strategia di Antigen Capside-incorporazione. Questo vettore è stato dimostrato per esporre idoneità qualitativa, la capacità di sfuggire sieri Ad5-positivi in vitro, e l'antigenicità e immunogenicità agli antigeni incorporati.

Utilizzando la strategia di Antigen Capside-Incorporation per lo sviluppo di approcci Adenovirus sierotipo 5 Vectored vaccino

La produzione su scala di laboratorio di proteine eucariotiche con appropriate modifiche post-traduzionali rappresenta un ostacolo significativo. Ecco un protocollo robusto con rapida instaurazione e inversione di tendenza per l'espressione proteica utilizzando un sistema di espressione nei mammiferi. Questo sistema supporta la selettività degli amminoacidi, la marcatura selettiva delle proteine e i modulatori di piccole molecole della composizione dei glicani.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

Un approccio modulare alla sintesi di N- glicani per il collegamento ad un vetro rivestita di ossido di alluminio diapositiva (ACG) come è stato sviluppato un microarray glycan e suo utilizzo per la profilazione di un HIV anticorpo di neutralizzazione ampiamente è stata dimostrata.

Chemio-enzimatico di sintesi della N- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione e la valutazione degli anticorpi monoclonali contro prodotti naturali per l'utilizzo in vari test immunologici. Questa procedura comprende l'immunizzazione, la fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto per clone positivo di screening e preparazione di ibridoma monoclonale. A vostra disposizione anche le specifiche per la caratterizzazione dell'anticorpo usando MALDI-TOF-MS e le analisi di ELISA.

Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

Che incorporano un derivato del ciclopropene di lisina in anticorpi permette il collegamento di site-specific, rapido ed efficiente delle molecole tetrazine-cuscinetto per generare i coniugati di anticorpo-farmaco.

Codifica genetica di un aminoacido Non-canonica per la generazione di anticorpo-farmaco coniugati attraverso una reazione di Bioorthogonal veloce

Un metodo dettagliato è fornito qui che descrive la purificazione, il ripiegamento e la caratterizzazione delle nanoparticelle proteiche auto-assemblanti (SAPN) da utilizzare nello sviluppo del vaccino.

Produzione di Nanoparticelle proteiche auto-assemblanti E. coliper vaccini che richiedono la presentazione dell'epitoscopio trimerico

Descriviamo un protocollo per la coniugazione chimica dell'antigene modello ovalbumina ad un anticorpo specifico del recettore dell'endocitosi per il targeting delle cellule dendritiche in vivo. Il protocollo comprende la purificazione dell'anticorpo, la coniugazione chimica dell'antigene, nonché la purificazione del coniugato e la verifica di una coniugazione efficiente.

Coniugazione chimica di un anticorpo purificato dec-205 diretto con proteina a lunghezza intera per il targeting di cellule dendritiche di topo in vitro e in vivo

Il modello di glicosilazione di un anticorpo determina le sue prestazioni cliniche, quindi gli sforzi industriali e accademici per controllare la glicosilazione persistono. Poiché le tipiche campagne di glicoingegneria richiedono molto tempo e lavoro, la generazione di un protocollo rapido per caratterizzare l'impatto dei geni di glicosilazione utilizzando il silenziamento transitorio si rivelerebbe utile.

Glicoingegneria anticorpale rapida nelle cellule ovariche di criceto cinese

Il presente protocollo descrive la bioingegneria delle vescicole della membrana esterna come una piattaforma vaccinale "Plug-and-Display", compresa la produzione, la purificazione, la bioconiugazione e la caratterizzazione.

Una piattaforma di vaccino a nanoparticelle "plug-and-display" basata su vescicole di membrana esterne che mostrano il dominio di legame del recettore SARS-CoV-2

Scopri come produrre un vaccino glicoconiugato omogeneo mediante l'incorporazione di aminoacidi innaturali e la click-chemistry. Questo metodo avanzato consente di sviluppare vaccini a bersaglio specifico per immunoterapie personalizzate.

Glicoconi coniugato omogeneo prodotto dallincorporazione combinata di aminoacidi innaturali e dalla click-chemistry a scopo vaccinale (Video) | JoVE Journal

Glicoconi coniugato omogeneo prodotto dall'incorporazione combinata di aminoacidi innaturali e dalla click-chemistry a scopo vaccinale

Esplora altri video