Isolamento ed espansione delle neurosfere dalle nicchie neurogeniche del topo postnatali (P1-3)

Il saggio della neurosfera è utile nella tecnica in vitro per studiare le proprietà intrinseche delle cellule staminali neurali /progenitrici tra cui proliferazione, autorinnozione e multipotenza sia in contesto fisiologico che patologico. Grazie alla sua struttura tridimensionale, questa tecnica è un potente strumento per studiare la neurogenesi adulta. È anche utile per coltivare e ottenere rese più elevate di cellule staminali/progenitrici neurali.

Questo saggio della neurosfera può essere applicato allo studio di disturbi cerebrali come l’Alzheimer e le malattie del Parkinson o la sclerosi multipla. Le neurosfere possono anche essere ottenute da altre regioni o sistemi cerebrali, come il tessuto adiposo o l’intestino. A dimostrare la procedura con Filipa Ribeiro sarà Rita Soares, dottoranda del mio gruppo.

Per raccogliere il giorno postnatale da uno a tre cervelli di topo, tenere la parte ventrale del corpo alla base della testa e utilizzare piccole forbici appuntite per fare un’incisione della linea mediana nella pelle su tutta la lunghezza della testa per esporre il cranio. Fai un’incisione longitudinale alla base del cranio e continua a tagliare lungo la sutura sagittale ad un angolo il più basso possibile per evitare di danneggiare le strutture cerebrali. Usa le forcep curve per sbucciare il cranio ai lati per esporre il cervello e far scivolare una piccola spatola sotto il cervello per tagliare i nervi cranici e i vasi sanguigni collegati alla base del cervello.

Mettere il cervello in una piastra di Petri di HBSS freddo integrata con antibiotici e posizionare la piastra sotto un microscopio sezionante a basso ingrandimento. Posizionare il cervello sulla sua superficie dorsale. Tenendo il cervello vicino al cervelletto, utilizzare forcep fini per rimuovere le meningi dal lato ventrale del cervello e dai bulbi olfattivi.

Ruotare il cervello sull’aspetto ventrale e staccare il resto delle meningi. Quindi utilizzare le forcep per rimuovere il cervelletto e utilizzare forcep appuntiti curvi per trasferire il cervello su un pezzo di carta filtrante con un poro di 11 micrometri sopra un elicottero tissutale. Per la microdisezione SVZ e DG, iniziare tagliando il cervello in sezioni coronali da 450 micrometri.

Utilizzare una lamina bagnata per raccogliere il cervello sezionato in una nuova piastra di Petri piena di HBSS integrato con antibiotico freddo al microscopio di sezionazione e utilizzare le forcep per separare le fette coronali in modo anteriore-posteriore fino a raggiungere le fette con i ventricoli laterali. Utilizzare forcep fini per tagliare lo strato sottile dei tessuti che circondano la parete laterale dei ventricoli, escludendo il parenchima striato e il corpo calloso e posizionare una punta delle forcep immediatamente sotto il corpo calloso e l’altra nel tessuto immediatamente adiacente all’area ventrale del ventricolo laterale per isolare l’SVZ. Tagliare una piccola linea di tessuti che circonda il ventricolo laterale e raccogliere il tessuto sezionato in un tubo campione contenente soluzione integrata di HBSS.

Quando tutte le fette sono state microdissacrate con forcep e la formazione ippocampale è stata raggiunta, scartare la prima fetta con ippocampo in cui la DG è ancora irriconoscibile. Per rimuovere la DG, isolare prima l’ippocampo dalle fette e rifocalizzare il microscopio per visualizzare i bordi intorno a DG. Per raccogliere la DG, utilizzare le forcep per ridurre la DG e la regione CA1, seguita da un taglio verticale tra la DG e la regione CA3. Quindi rimuovere la fimbria e qualsiasi tessuto adiacente e posizionare il tessuto raccolto in un tubo separato di soluzione HBSS integrata da antibiotici.

Per dissociare i campioni SVZ e DG, aggiungere trypsin-EDTA 0,05% a una concentrazione finale del 5-10% di Tripsiderina-EDTA 0,05% in HBSS a ciascun tubo per un’incubazione di circa 50 minuti a 37 gradi Celsius. L’intero uso di tripside o tempi di incubazione troppo lunghi può portare a un aumento della morte cellulare, influenzando negativamente la crescita cellulare. Quando il tessuto si è raggruppato, sostituire la soluzione enzimatica per quattro lavaggi consecutivi con un millilitro di HBSS fresco integrato per lavaggio.

Dopo l’ultimo lavaggio, rimostrare i tessuti digeriti in un millilitro di mezzo privo di siero integrato con 10 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita epidermico e cinque nanogrammi per millilitro del fattore di crescita dei fibroblasti di base per tubo. Quindi dissociare meccanicamente i tessuti con pipettazione delicata da sette a 10 volte con una pipetta P1000 fino a ottenere una soluzione cellulare omogenea. Per determinare la densità della cellula DG o SVG dissociata, contare le cellule in ogni sospensione su un ematocitometro.

Per espandere le cellule in neurosfere, diluire le singole popolazioni cellulari a una densità di due volte dieci-quarta per millilitro in mezzo privo di siero integrato con fattori di crescita e seminare cinque millilitri della sospensione cellulare in piastre di Petri non rivestite di 60 millimetri di diametro. Quindi incubare le cellule SVZ per sei-otto giorni e le cellule DG per 10-12 giorni a 37 gradi Celsius per la formazione primaria della neurosfera. Quando la maggior parte delle neurosfere ha un diametro da 150 a 200 micrometri, raccogliere la sospensione cellulare dalle colture e raccogliere le neurosfere per centrifugazione.

Resuspend il pallet della neurosfera con un kit di dissociazione chimica del topo secondo le istruzioni del produttore prima di raccogliere le cellule con un’altra centrifugazione. Sostituire il supernatante con un millilitro di mezzo privo di siero integrato con fattori di crescita e cercare delicatamente di valutare il pellet circa 10 volte. Contare le cellule neurologiche dissociate come dimostrato e reseed le cellule a una densità di due volte 10 alla quarta per millilitro in mezzo privo di siero integrato con fattori di crescita in nuove piastre di Petri da 60 millilitri.

Quindi riportare la cellula nell’incubatore di coltura cellulare per ulteriori sei-otto o da 10 a 12 giorni, a caso, per ottenere neurosfere secondarie. Le neurosfere SVG e DG ottenute utilizzando il saggio della neurosfera sono composte da cellule positive sox2 indifferenziate, positive alla nenina. In particolare, le neurosfere derivate da SVG hanno dimensioni maggiori rispetto alle loro controparti DG.

È importante sottolineare che, in condizioni di differenziazione, le cellule staminali/progenitrici neurali derivate da SVG e DG migrano fuori dalle neurosfere, formando uno pseudomonostrato di cellule. In entrambe le regioni neurogeniche, è possibile osservare la presenza di Sox2 doppie coppie positive, nestina double positive, doublecortin double negative corrispondenti a divisioni simmetriche indicative di auto-rinnovamento. Coppie cellulari in cui una cellula di Sox2 positiva, annidina positiva e doublecortin negativa, e l’altra cella Sox2 negativa, annidina negativa e doublecortin positiva dimostrando divisioni asimmetriche.

E sox2 doppio negativo, annidina doppio negativo, e doppia cortina doppia coppia di cellule positive corrispondenti a divisioni simmetriche indicative di differenziazione. Nel complesso, il passaging cambia il tasso di mortalità cellulare al secondo giorno in vitro. La neuritogenesi può essere valutata nei neuroni ottenuti dalla differenziazione delle cellule staminali/progenitrici neurali SVG e DG all’inizio della differenziazione.

Come osservato, la lunghezza e la ramificazione dei neuriti aumenta con la differenziazione. Un’alta percentuale di cellule proliferativi si osserva in SVG rispetto alla DG. Sebbene la percentuale di progenitori proliferano che si differenziano in neuroni maturi sia simile in entrambe le nicchie neurogeniche. Entrambi i tipi di cellule sono anche in grado di differenziarsi in neuroni immaturi, neutroni maturi, cellule precursori di oligodendrociti, oligodendrociti maturi e astrociti.

Dopo aver ottenuto le neurosfere, diversi metodi tra cui immunocitochimica, imaging del calcio, macchie occidentali e RT-PCR possono essere eseguiti per studiare la staminalità e la multipotenza delle cellule staminali neurali / progenitrici. Il saggio della neurosfera può essere applicato a modelli genetici e di malattia per valutare ulteriormente i processi molecolari e cellulari che coinvolgono sia la proliferazione che la differenziazione delle cellule staminali/progenitrici neurali.