Name: Isolamento ed espansione delle neurosfere dalle nicchie neurogeniche del topo postnatali (P1-3) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Impara l'isolamento e l'espansione delle neurosfere dalle nicchie neurogeniche del topo postnatale. Questo metodo consente di studiare le proprietà delle cellule staminali neurali e la loro differenziazione in neuroni, oligodendrociti e astrociti.

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Questo lavoro è stato supportato da IF/01227/2015 e UID/BIM/50005/2019, projeto financiado pelao para a Ciància e a (FCT)/ Ministério da Ciància, e Ensino Superior (MCTES) atés de Fundos do orà di Estado. R.S. (SFRH/BD/128280/2017, F.F.R. (IMM/CT/35-2018), D.M.L. (PD/BD/141784/2018) e R.S.R. (SFRH/BD/129710/2017) hanno ricevuto una borsa di studio FCT. Gli autori desiderano ringraziare i membri della struttura di bioimaging dell'Instituto de Medicina Molecular Joào Lobo Antunes per l'assistenza alla microscopia.

<ol><li>Reynolds, B., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2393(2010).</li>
<li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+%28neuronal%29+and+bipotent+%28neuronal%2Fastroglial%29+EGF-generated+CNS+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).</li>
<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cell+Isolation+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cell Isolation and Characterization.</a> Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).</li>
<li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+Mouse%2C+Two+Cultures%3A+Isolation+and+Culture+of+Adult+Neural+Stem+Cells+from+the+Two+Neurogenic+Zones+of+Individual+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e51225(2014).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+Limitations+of+the+Neurosphere+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System.</a> Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-162 (2006).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Type+1+Cannabinoid+Receptor+%28CB1R%29+Promotes+Neurogenesis+in+Murine+Subventricular+Zone+Cell+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Activation of Type 1 Cannabinoid Receptor (CB1R) Promotes Neurogenesis in Murine Subventricular Zone Cell Cultures.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63529(2013).</li>
<li>Riccardi, C., Nicoletti, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+apoptosis+by+propidium+iodide+staining+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1458-1461 (2006).</li>
<li>Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., Miller, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+immunohistochemical+determination+of+the+lengths+of+the+cell+cycle+and+the+DNA-synthetic+phase+for+an+anatomically+defined+population%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the DNA-synthetic phase for an anatomically defined population.</a> Journal of Neurocytology. 18 (3), 311-318 (1989).</li>
<li>Weinberg, D., Adams, C. F., Chari, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deploying+clinical+grade+magnetic+nanoparticles+with+magnetic+fields+to+magnetolabel+neural+stem+cells+in+adherent+versus+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Deploying clinical grade magnetic nanoparticles with magnetic fields to magnetolabel neural stem cells in adherent versus suspension cultures.</a> RSC Advances. 5 (54), 43353-43360 (2015).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2457(2011).</li>
<li>Azari, H., Louis, S. A., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural-Colony+Forming+Cell+Assay%3A+An+Assay+To+Discriminate+Bona+Fide+Neural+Stem+Cells+from+Neural+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2639(2011).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres-re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres-re-evaluating the relationship.</a> Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).</li>
<li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li>
<li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+systems%3A+physiological+players+or+in+vitro+entities%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li>
<li>Ghate, P. S., Sidhar, H., Carlson, G. A., Giri, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+cellular+model+of+Alzheimer%27s+disease+utilizing+neurosphere+cultures+derived+from+B6C3-Tg%28APPswe%2CPSEN1dE9%2985Dbo%2FJ+embryonic+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Development of a novel cellular model of Alzheimer's disease utilizing neurosphere cultures derived from B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J embryonic mouse brain.</a> SpringerPlus. 3 (1), 161(2014).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li>
<li>Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+differentiation+of+Sandhoff+disease+model+mouse-derived+multipotent+stem+cells+toward+a+neural+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage.</a> PLoS ONE. 12 (6), e0178978(2017).</li>
<li>Khacho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dynamics+Impacts+Stem+Cell+Identity+and+Fate+Decisions+by+Regulating+a+Nuclear+Transcriptional+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).</li>
<li>Soares, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauroursodeoxycholic+Acid+Enhances+Mitochondrial+Biogenesis%2C+Neural+Stem+Cell+Pool%2C+and+Early+Neurogenesis+in+Adult+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats.</a> Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).</li>
<li>Rodrigues, R. S., Ribeiro, F. F., Ferreira, F., Vaz, S. H., Sebastião, A. M., Xapelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Cannabinoid+Type+1+and+Type+2+Receptors+in+the+Modulation+of+Subventricular+Zone+and+Dentate+Gyrus+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Interaction between Cannabinoid Type 1 and Type 2 Receptors in the Modulation of Subventricular Zone and Dentate Gyrus Neurogenesis.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 516(2017).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis%3A+a+role+for+hemopressin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin?</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59(2014).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-related+protein+1+controls+the+migration+and+neuronal+differentiation+of+subventricular+zone-derived+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamin-related protein 1 controls the migration and neuronal differentiation of subventricular zone-derived neural progenitor cells.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15962(2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I sistemi in vitro degli NSPC consentono una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari, che possono essere ulteriormente convalidati in vivo. La NSA è un metodo molto potente per imitare le condizioni fisiologiche a causa della loro struttura tridimensionale. Inoltre, questo sistema di coltura è anche tecnicamente più facile da coltura10, rispetto ad altri sistemi in vitro come il sistema di coltura monostrato. Infatti, con la NSA, è facile controllare i segnali estrinseci esposti durante lo sviluppo cellulare, sia durante lo sviluppo della cellula, sia durante l'espansione che la fase di differenziazione, aggiungendo quantità precise e variabili di fattori di interesse ai media e coltivando le neurosfere con altri tipi di cellule6. Inoltre, rispetto alle colture monostratori, nella NSA, è possibile ottenere una maggiore densità cellulare da una piccola quantità di tessuto o con un piccolo numero di cellule, consentendo di eseguire studi paralleli, riducendo così il numero di animali1.
L'NSA è il metodo più comune per isolare ed espandere le NSC11,12,13, può essere utilizzato per stimare il numero di cellule precursori presenti in un dato campione di tessuto5 e la frequenza cellulare precursore tra diverse condizioni. Tuttavia, sia le neurosfere che le culture monostrato non tengono conto delle nNC di quiescenza14. Inoltre, la NSA ha alcune limitazioni11,12,13 e la frequenza della neurosfera risultante dipende da molti fattori tra cui i componenti medi, la procedura di dissezione, il processo di dissociazione11,12,13e l'aggregazione della neurosfera5. Infatti, in una coltura ad alta densità, le neurosfere tendono ad aggregarsi. Di conseguenza, è necessario prestare attenzione quando si stima il numero di cellule precursori in un campione. Per superare i limiti di cui sopra, i NSPC isolati possono anche essere espansi e passaggiin un monostrato5,,15. È importante sottolineare che l'utilizzo di NSA per confrontare la frequenza delle cellule precursori tra condizioni diverse è molto utile e accurato perché tutte queste limitazioni sono implicite e simili tra tutte le condizioni eseguite nello stesso esperimento.
Ci sono passi critici nella cultura della neurosfera che richiedono attenzione. Nella fase di raccolta del cervello, la rimozione completa delle meningi e un buon isolamento delle nicchie neurogeniche sono essenziali per massimizzare la purezza e la resa degli NSPC. Durante la dissociazione dei tessuti, a causa dell'attività proteolitica della trippsina, l'uso eccessivo di trippsina o tempi di incubazione più lunghi possono portare alla lisi cellulare. Inoltre, il giorno del passaggio è fondamentale per ottenere una popolazione sana di neurosfere. Superare le neurosfere con un diametro superiore a 200 m influisce notevolmente sulla vitalità, sulla capacità proliferazione e differenziante6degli NSPC. Inoltre, il rivestimento con PDL e PLD/laminin, rispettivamente, per le cellule SV e DG, è essenziale per garantire una buona migrazione cellulare dalle neurosfere senza compromettere il processo di differenziazione. In termini di analisi dell'immunocitochimica, tempi di incubazione più lunghi con PFA possono compromettere la colorazione mascherando gli antigeni e aumentando lo sfondo.
La NSA è un potente strumento per fornire una fonte coerente e illimitata di NSPC per studi in vitro di sviluppo neurale e differenziazione, nonché per scopi terapeutici16,17. Infatti, questo test può essere applicato a modelli genetici e comportamentali per comprendere ulteriormente i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nella proliferazione e differenziazione della NSPC18,19. Questo test è utile anche per testare diversi farmaci e composti20,21,22 così come per eseguire manipolazioni genetiche19,23 per modulare le proprietà NSC. Oltre all'immunocitochimica, la reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa e l'analisi delle macchie occidentali possono essere eseguite per accedere all'espressione dell'RNA e delle proteine, mentre gli studi elettrofisiologici e l'imaging del calcio possono essere utilizzati per valutare la funzione dei neuroni appena nati21.

Il test della neurosfera (NSA) è stato descritto per la prima volta nel 19921,2 e rimane ancora uno strumento unico e potente nella ricerca sulle cellule staminali neurali (NSC). L'isolamento delle NSC dalle principali regioni neurogeniche presenta problemi impegnativi perché i requisiti per mantenere queste cellule in condizioni fisiologiche rimangono poco compresi. Nella NSA, le cellule sono coltivate in un mezzo senza siero definito chimicamente con la presenza di fattori di crescita tra cui il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita fibroblasto di base (bFGF)1,2,3.3 Le cellule precursori neurali (gambo e progenitori) vengono selezionate utilizzando questi mitogeni poiché queste cellule sono EGF e FGF-responsive entrando in un periodo di proliferazione attiva, mentre altre cellule, vale a dire le cellule differenziate, muoiono4. Le cellule precursori neurali crescono come neurosfere, che possono poi essere passaggiate per espandere ulteriormente il pool di queste cellule5. È importante sottolineare che, poiché queste cellule progenitrici di stilo neurale (NPG) sono multipotenti sono in grado di differenziarsi nei tre principali tipi di cellule del sistema nervoso centrale (SNC): neuroni, oligodendrociti e astrociti5.
La NSA fornisce una fonte rinnovabile di precursori del SNC indifferenziati, che possono essere utilizzati per studiare diversi processi tra cui la proliferazione e l'auto-rinnovamento di NSC, e la differenziazione neuronale e gliale, sia nel contesto fisiologico che in quello della malattia. Inoltre, gli studi in vitro possono essere utilizzati per valutare il grado di specifica intrinseca presente nei precursori neurali durante lo sviluppo, nonché per studiare il pieno potenziale delle cellule, rimuovendo i segnali estrinseci associati al loro ambiente normale6. Il modello della neurosfera è prezioso per valutare i regolatori putativi poiché mantenendo le cellule in un mezzo privo di siero, i segnali ambientali sono forniti solo dalle cellule circostanti6. Inoltre, nella NSA, gli NSPC sono facilmente ampliati nella coltura, la densità delle cellule per area è alta e la composizione eterogenea delle neurosfere ha una certa somiglianza con le nicchie in vivo6. Questi vantaggi consolidati sono il motivo per cui questa metodologia è stata ampiamente utilizzata da molti ricercatori.
Il seguente protocollo descrive in dettaglio tutti i processi dall'isolamento della popolazione di NSPC postnatale dalle due principali regioni neurogeniche, la zona subventricolare (SV) e il giro dentato ippocampale (DG), all'espansione di tali cellule come neurosfere, nonché alla differenziazione in neuroni, astrociti e oligodendrociti. Infine, vengono descritti anche diversi saggi per accedere alle proprietà di stelo e multipotenza delle NSPC derivate da SV e DG.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>0,4% Soluzione di Tripano Blu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>12mm Vetrini coprioggetti</td><td>VWR</td><td>631-1577</td><td></td></tr><tr><td>15mL Centrifuga</td><td>Tubo Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-2'-deossiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285-1G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Provetta da centrifuga</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td>Manuel Vieira & C&ordf; (Irm&atilde; o) Sucrs, Lda</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di adesione, Menzel Gl&auml; ser, SuperFrost Plus</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-pollo IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 asino anti-ratto IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 asino anti-topo IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 asino anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 capra anti-topo IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-5-Bromo-2-Deossiuridina</td><td>Dako</td><td>M0744</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD140a (PDGFR&alpha;) (ratto)</td><td>BD Biosciences</td><td>558774</td><td>Diluire in rapporto 1:500.</td></tr><tr><td>Anti-Condroitina Solfato Proteoglicano NG2 (coniglio)</td><td>Merck Milipore</td><td>AB5320</td><td>Diluire in rapporto 1:200.</td></tr><tr><td>Anti-Doublecortina (coniglio)</td><td>Abcam</td><td>ab18723</td><td>Diluire in rapporto 1:200.</td></tr><tr>Sistemi <td>Sinaptici</td> <td>Anti-Doublecortin (pollo)</td> <td>326006</td><td>Diluire in rapporto 1:500.</td></tr><tr><td>Proteina acida fibrillare anti-gliale (coniglio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9269-.2ML</td><td>Diluire in un rapporto 1:1000.</td></tr><tr>Tecnologia <td>di segnalazione cellulare</td><td>78896S</td> <td>anti-mielina (coniglio)</td> <td>in rapporto 1:200.</td></tr><tr><td>Anti-Nestina (topo)</td><td>Merck Milipore</td><td>MAB353</td><td>Diluire in rapporto 1:200.</td></tr><tr><td>Nuclei anti-neuronali (topo)</td><td>Merck Milipore</td><td>MAB377</td><td>Utilizzare il 6% di BSA in PBS 1X. Diluire in rapporto 1:400.</td></tr><tr><td>Anti-SOX2 (coniglio)</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td><td>Diluire in rapporto 1:500.</td></tr><tr><td>Anti-Tubulina e beta; 3 (coniglio)</td><td>BioLegend</td><td>802001</td><td>Diluire in rapporto 1:200.</td></tr><tr><td>Microscopio a campo largo Axiovert 200</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), senza siero</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-500g</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>NZYTech</td><td>MB04602</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio cellulare, Neubauer</td><td>Hirschmann</td><td>8100104</td><td></td></tr><tr><td>Coltura cellulare CO incubatore 2</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Piastra a 24 pozzetti multipli trattata</td><td>con TC Corning</td><td>CLS3524-100EA</td><td></td></tr><tr><td>di-Sodio idrogeno fosfato diidrato</td><td>Merck Milipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td><td>ThermoFisher</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Fine Forceps</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5S Pinza</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinza</td><td>FST</td><td>11272-30</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico</td><td>ThermoFisher</td><td>53003018</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti</td><td>ThermoFisher</td><td>13256029</td><td></td></tr><tr><td>Carte da filtro Whatman</td><td></td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini - Sharp</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Gillete Platinum 5 lame</td><td>Gillette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS, senza calcio, senza magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>1399</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Merck Milipore</td><td>1.09057.1000 (1L)</td><td></td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica di classe II per labculture</td><td>ESCO</td><td>2012-65727</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>McILWAIN Tritatessuti</td><td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td><td>MTC/2</td><td>impostato su 450 &mu; m</td></tr><tr><td>Micro Spatola - 12 cm</td><td>FST</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Microprovetta 0,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>72.699</td><td></td></tr><tr><td>Microprovetta 1,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Microprovetta 2,0 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissociazione chimica NeuroCult (Topo)</td><td>Cellule staminali</td><td>5707</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Olympus SZ51</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide, polvere</td><td>VWR</td><td>28794.295</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>piastre di Petri 60 mm</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Soluzioni standard di fosfato, PO43 - in acqua</td><td>BDH ARISTAR</td><td>452232C</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina 100mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-250g</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>VWR</td><td>27800.360.5K</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Merck Milipore</td><td>535C549998</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BDH</td><td>14630</td><td></td></tr><tr><td>VWR INCU-Line IL10</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento ed espansione delle neurosfere dalle nicchie neurogeniche del topo postnatali (p1-3)

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

L'analisi della neurosfera è una tecnica in vitro estremamente utile per studiare le proprietà intrinseche delle cellule staminali/progenitrici neurali (NPG) tra cui la proliferazione, l'auto-rinnovamento e la multipotenza. Nel cervello postnatale e adulto, gli NSPC sono presenti principalmente in due nicchie neurogeniche: la zona subventricolare (SV) che riveste i ventricoli laterali e la zona subgranulare del giro dentato ippocampale (DG). L'isolamento delle nicchie neurogeniche dal cervello postnatale permette di ottenere una maggiore quantità di NSPC in coltura con un conseguente vantaggio di rese più elevate. Lo stretto contatto tra le cellule all'interno di ogni neurosfera crea un microambiente che può assomigliare a nicchie neurogeniche. Qui, descriviamo, in dettaglio, come generare colture della neurosfera derivate da topi di 1-3 giorni (P1-3), oltre a passare, per l'espansione della neurosfera. Questo è un approccio vantaggioso poiché l'espressione della neurosfera consente una generazione veloce di cloni NSPC (6-12 giorni) e contribuisce a una significativa riduzione del numero di animali. Placcando le neurosfere in condizioni differenzianti, possiamo ottenere uno pseudomonostrato di cellule composte da NSPC e cellule differenziate di diversi lignaggi neurali (neuroni, astrociti e oligodendrociti) permettendo lo studio delle azioni di fattori intrinseci o estrinseci sulla proliferazione della NSPC, la differenziazione, la sopravvivenza delle cellule e la neuritogenesi.

Le neurosfere SV z e DG, ottenute utilizzando la NSA, sono composte da cellule indifferenziate, positive per Sox2, un fattore di trascrizione coinvolto nella capacità di auto-rinnovamento e positivo per la nestina, una proteina di filamento intermedio espressa negli NSPC (Figura 1A). Inoltre, le neurosfere derivate da SV hanno dimensioni maggiori rispetto alle loro controparti della DG (Figura 1A). È importante sottolineare che, in condizioni differenzianti, gli NSPC derivati dalla SV e dalla DG migrano dalle neurosfere formando uno pseudomonostrato di cellule (Figura 1B).
Per accedere alla capacità di auto-rinnovamento, il saggio della coppia di cellule viene eseguito in base all'espressione di Sox2 e nestin che tende a scomparire nelle cellule di divisione che iniziano il processo di differenziazione con una combinazione di un marcatore del lignaggio neuronale vale a dire, DCX. In entrambe le regioni neurogeniche, è possibile osservare la presenza di Sox2 s//nestin/DCX-// divisioni simmetriche (auto-rinnovamento) (Figura 2A1,B1), Sox2-//nestin-/Divisioniasimmetriche DCX(Figura 2A1,B2) e Sox2-/-/nestin-/-/DCX /DCX//z divisioni simmetriche (differenziazione) ( Figura2A2,B1).+/+
Passare le neurosfere aumenta la resa degli NSPC; tuttavia, la morte cellulare a DIV2 cambia con il passaggio. Infatti, la percentuale di cellule PI-positive è aumentata con il passaggio cellulare in SV s (P0: 15,6% - 1,2% vs P1: 19,2% - 2,7% vs P2: 32,35% - 0,14% vs P3: 39,6% - 4,0%) e in DG (P0: 16,31% - 0,95% vs P1: 32,1% - 1,7% vs P2: 27,42% vs P3: 32,2% - 3,1%) (Figura 3).
La neuritogenesi può essere valutata nei neuroni ottenuti dalla differenziazione di SV e DG NSPC all'inizio della differenziazione: DIV1 (Figura 4A,D), DIV2 (Figura 4B,E) e DIV3 (Figura 4C,F). Infatti, come osservato nella Figura 4, la lunghezza e la ramificazione dei neuriti aumenta con la differenziazione.
La proliferazione cellulare può essere valutata nelle neurosfere derivate da SV e DG. Confrontando le neurosfere differenziate primarie a DIV1 da SV (Figura 5A1) e DG (Figura 5A2), la percentuale di celle BrdU-positive è superiore in SV , rispetto alla DG (SV: 6.15% : 0.64% vs DG: 3.27% : 0.13%; p &lt; 0.05; Figura 5A3). Inoltre, la differenziazione cellulare è accessibile anche combinando la colorazione BrdU con un produttore maturo come i nuclei neuronali (NeuN) che identifica i neuroni maturi (Figura 5B1,B2). La figura 5B3 mostra che la percentuale di progenitori che proliferano che si differenziano in neuroni maturi è simile in SV e DG (SV: 12,04% - 1,58% vs DG: 13,56% - 0,48%; p &gt; 0,05; n - 4).
È possibile accedere alla stesità e alla multipotenza degli NSPC derivati da SV e DG utilizzando l'NSA valutando l'espressione di diversi marcatori in diversi giorni di differenziazione (DIV2 e DIV7). Infatti, le NSC (geneina- e lealfia fibrillaria delle cellule [GFAP]-cellule doppio-positive) sono presenti in entrambe le regioni neurogeniche (Figura 6A,G). Queste cellule sono in grado di differenziarsi in neuroni immaturi (cellule dcX-positive) (Figura 6B,H), neuroni maturi (cellule neutre positive) (Figura 6F,L), cellule precursori oligodendrociti (antigene neurone-gliale 2 [NG2] e recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (NG2] e recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine [cellule positive della PDGF) ((Figura 6C,I), oligodendrociti maturi (proteina di base della mielina [cellule mbP]-positive) (Figura 6E,K) e astrociti (cellule GFAP-positive) (Figura 6D,J).
Diversi substrati possono essere utilizzati per rivestirei per formare lo pseudomonostrato di cellule in condizioni differenzianti. Come mostrato nella Figura supplementare 1, le celle DG migrano di più quando i coperchi sono extra-rivestimenti con laminina combinato con PLO o PDL che con PDL da solo (Figura supplementare 1B -H). Infatti, quando PDL e laminina vengono utilizzati insieme come substrati (Figura supplementare 1C,G), le cellule DG formano uno pseudomonostrato più confluente rispetto alle cellule SV , per le quali il PDL viene utilizzato da solo (Figura supplementare 1A,E).
È importante sottolineare che questi risultati dimostrano il potenziale della NSA per valutare le proprietà di stelo e multipotenza delle NSC derivate dalle due principali nicchie neurogeniche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg"> Figura 1: zona subventricolare e giro dentato derivato NSPC coltivato come neurosfere o come pseudomonostrati. (A) Immagini rappresentative del campo luminoso (A1,A3) e della fluorescenza(A2,A4)delle neurosfere derivate dalla SV e dalla DG, dove i nuclei sono stati macchiati con Hoechst 33342 (blu) e NSC per Sox2 (verde) e nestin (rosso). (B) Immagini rappresentative del campo luminoso di pseudomonostrati generati dalle neurosfere derivate da SV e DG in condizioni differenzianti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg"> Figura 2: Il saggio della coppia di celle. Immagini di fluorescenza rappresentative di coppie di cellule derivate da una divisione cellulare progenitrice. I nuclei della SV e della DG sono stati macchiati con Hoechst 33342 (blu), cellule staminali per Sox2 (rosso) e ninestina (bianco) e neuroni immaturi con DCX (verde). Le punte delle frecce nei pannelli A1 e B1+/+indicano Le divisioni di auto-rinnovamentosimmetriche Sox2le frecce nei pannelli A1 e B2 indicano Sox2-/-/nestin//DCX-/z, le frecce tratteggiate nei pannelli A2 e+/+ B1 mostrano Le divisioni di differenziazione simmetrica Sox2-/-/nestin-/-/DCX/ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg"> Figura 3: Analisi della sopravvivenza delle cellule con passaggio cellulare. Analisi quantitativa delle cellule PI-positive a DIV2 nella coltura della neurosfera differenziata SV e DG, dopo 0, 1, 2 e 3 passaggi (P0-P3). I dati sono espressi come media : SEM, n . PI - iodio propidio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg"> Figura 4: Analisi della neuritogenesi al DIV 1, 2 e 3. Rappresentativo delle immagini confocali a fluorescenza dei neuriti, identificate dal segnale di tubulina di ZIIII, nei neuroni SV e DG a (A,D) DIV1, (B,E) DIV2 e(C,F)DIV3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg"> Figura 5: Saggio di proliferazione cellulare. Rappresentativo immagini confocali di cellule BrdU-positive a DIV1 in (A1) SV e (A2) DG. (A3) Analisi quantitativa delle cellule brdU-positive a DIV1 nella coltura della neurosfera differenziata derivata dalla DG e dalla SV. I dati sono espressi come media : SEM, n e 4. &lt; 0,05 per t-test. Immagini rappresentative di fluorescenza di cellule BRDU e NeuN-positive a DIV7 in (B1) SV e (B2) DG. Le punte a freccia indicano le cellule BrdU-/NeuN-positive. (B3) Analisi quantitativa delle cellule BrdU-/NeuN-positive a DIV7 in entrambe le nicchie. I dati sono espressi come media : SEM, n e 4. BrdU: 5-bromo-2'-deoxyuridina, analogico sintetico di timinane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg"> Figura 6: Tipi di cellule neurali presenti nella coltura della neurosfera differenziata sV e DG. Immagini di fluorescenza rappresentativa dei tipi di cellule derivate da SV e DG dopo 2 e 7 giorni di differenziazione della neurosfera (DIV2 e DIV7), dove i nuclei cellulari sono stati macchiati con Hoechst 33342 (blu) e: (A,G) NSC per GFAP (verde) e nestin (rosso), (Neurone B,H) immaturo per gli astrociti DCX (verde), (C,I) oligodendrociti per gli astrociti PDGFR ( verde) e NG2 (rosso), (D,J) per GFAP (verde), (E,K) oligodendrociti maturano per MBP (verde) e (F,L) i neuroni maturi per NeuN (rosso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg"> Figura supplementare Figura 1: Test di diversi substrati per l'aderenza alla neurosfera e la migrazione per formare uno pseudomonostrato. Immagini a fluorescenza rappresentativa di pseudomonolayer derivato da(A,E)con poli-D-lysina come substrato, (B,F) pseudomonolayer derivato dalla DG utilizzando la polid-lysina come substrato, (C,G) pseudomonostrato derivato dalla DG utilizzando la polid-lysina con lamina come substrato e ( Pseudomonostrato derivato daD,H)utilizzando la poli-D-lisina con poli-L-ornichea come substrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

In questo articolo, descriviamo, in dettaglio, un protocollo per la generazione di colture della neurosfera da cellule staminali neurali del topo postnatali derivate dalle principali nicchie neurogeniche del topo. Le neurosfere sono utilizzate per identificare le cellule staminali neurali dal tessuto cerebrale permettendo la stima dei numeri di cellule precursori. Inoltre, queste strutture 3D possono essere placcate in condizioni differenzianti, dando origine a neuroni, oligodendrociti e astrociti, permettendo lo studio del destino cellulare.

Isolamento ed espansione delle neurosfere dalle nicchie neurogeniche del topo postnatali (P1-3)

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Il saggio della neurosfera è utile nella tecnica in vitro per studiare le proprietà intrinseche delle cellule staminali neurali /progenitrici tra cui proliferazione, autorinnozione e multipotenza sia in contesto fisiologico che patologico. Grazie alla sua struttura tridimensionale, questa tecnica è un potente strumento per studiare la neurogenesi adulta. È anche utile per coltivare e ottenere rese più elevate di cellule staminali/progenitrici neurali.Questo saggio della neurosfera può essere applicato allo studio di disturbi cerebrali come l'Alzheimer e le malattie del Parkinson o la sclerosi multipla. Le neurosfere possono anche essere ottenute da altre regioni o sistemi cerebrali, come il tessuto adiposo o l'intestino. A dimostrare la procedura con Filipa Ribeiro sarà Rita Soares, dottoranda del mio gruppo.Per raccogliere il giorno postnatale da uno a tre cervelli di topo, tenere la parte ventrale del corpo alla base della testa e utilizzare piccole forbici appuntite per fare un'incisione della linea mediana nella pelle su tutta la lunghezza della testa per esporre il cranio. Fai un'incisione longitudinale alla base del cranio e continua a tagliare lungo la sutura sagittale ad un angolo il più basso possibile per evitare di danneggiare le strutture cerebrali. Usa le forcep curve per sbucciare il cranio ai lati per esporre il cervello e far scivolare una piccola spatola sotto il cervello per tagliare i nervi cranici e i vasi sanguigni collegati alla base del cervello.Mettere il cervello in una piastra di Petri di HBSS freddo integrata con antibiotici e posizionare la piastra sotto un microscopio sezionante a basso ingrandimento. Posizionare il cervello sulla sua superficie dorsale. Tenendo il cervello vicino al cervelletto, utilizzare forcep fini per rimuovere le meningi dal lato ventrale del cervello e dai bulbi olfattivi.Ruotare il cervello sull'aspetto ventrale e staccare il resto delle meningi. Quindi utilizzare le forcep per rimuovere il cervelletto e utilizzare forcep appuntiti curvi per trasferire il cervello su un pezzo di carta filtrante con un poro di 11 micrometri sopra un elicottero tissutale. Per la microdisezione SVZ e DG, iniziare tagliando il cervello in sezioni coronali da 450 micrometri.Utilizzare una lamina bagnata per raccogliere il cervello sezionato in una nuova piastra di Petri piena di HBSS integrato con antibiotico freddo al microscopio di sezionazione e utilizzare le forcep per separare le fette coronali in modo anteriore-posteriore fino a raggiungere le fette con i ventricoli laterali. Utilizzare forcep fini per tagliare lo strato sottile dei tessuti che circondano la parete laterale dei ventricoli, escludendo il parenchima striato e il corpo calloso e posizionare una punta delle forcep immediatamente sotto il corpo calloso e l'altra nel tessuto immediatamente adiacente all'area ventrale del ventricolo laterale per isolare l'SVZ. Tagliare una piccola linea di tessuti che circonda il ventricolo laterale e raccogliere il tessuto sezionato in un tubo campione contenente soluzione integrata di HBSS.Quando tutte le fette sono state microdissacrate con forcep e la formazione ippocampale è stata raggiunta, scartare la prima fetta con ippocampo in cui la DG è ancora irriconoscibile. Per rimuovere la DG, isolare prima l'ippocampo dalle fette e rifocalizzare il microscopio per visualizzare i bordi intorno a DG. Per raccogliere la DG, utilizzare le forcep per ridurre la DG e la regione CA1, seguita da un taglio verticale tra la DG e la regione CA3. Quindi rimuovere la fimbria e qualsiasi tessuto adiacente e posizionare il tessuto raccolto in un tubo separato di soluzione HBSS integrata da antibiotici.Per dissociare i campioni SVZ e DG, aggiungere trypsin-EDTA 0,05% a una concentrazione finale del 5-10% di Tripsiderina-EDTA 0,05% in HBSS a ciascun tubo per un'incubazione di circa 50 minuti a 37 gradi Celsius. L'intero uso di tripside o tempi di incubazione troppo lunghi può portare a un aumento della morte cellulare, influenzando negativamente la crescita cellulare. Quando il tessuto si è raggruppato, sostituire la soluzione enzimatica per quattro lavaggi consecutivi con un millilitro di HBSS fresco integrato per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, rimostrare i tessuti digeriti in un millilitro di mezzo privo di siero integrato con 10 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita epidermico e cinque nanogrammi per millilitro del fattore di crescita dei fibroblasti di base per tubo. Quindi dissociare meccanicamente i tessuti con pipettazione delicata da sette a 10 volte con una pipetta P1000 fino a ottenere una soluzione cellulare omogenea. Per determinare la densità della cellula DG o SVG dissociata, contare le cellule in ogni sospensione su un ematocitometro.Per espandere le cellule in neurosfere, diluire le singole popolazioni cellulari a una densità di due volte dieci-quarta per millilitro in mezzo privo di siero integrato con fattori di crescita e seminare cinque millilitri della sospensione cellulare in piastre di Petri non rivestite di 60 millimetri di diametro. Quindi incubare le cellule SVZ per sei-otto giorni e le cellule DG per 10-12 giorni a 37 gradi Celsius per la formazione primaria della neurosfera. Quando la maggior parte delle neurosfere ha un diametro da 150 a 200 micrometri, raccogliere la sospensione cellulare dalle colture e raccogliere le neurosfere per centrifugazione.Resuspend il pallet della neurosfera con un kit di dissociazione chimica del topo secondo le istruzioni del produttore prima di raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione. Sostituire il supernatante con un millilitro di mezzo privo di siero integrato con fattori di crescita e cercare delicatamente di valutare il pellet circa 10 volte. Contare le cellule neurologiche dissociate come dimostrato e reseed le cellule a una densità di due volte 10 alla quarta per millilitro in mezzo privo di siero integrato con fattori di crescita in nuove piastre di Petri da 60 millilitri.Quindi riportare la cellula nell'incubatore di coltura cellulare per ulteriori sei-otto o da 10 a 12 giorni, a caso, per ottenere neurosfere secondarie. Le neurosfere SVG e DG ottenute utilizzando il saggio della neurosfera sono composte da cellule positive sox2 indifferenziate, positive alla nenina. In particolare, le neurosfere derivate da SVG hanno dimensioni maggiori rispetto alle loro controparti DG.È importante sottolineare che, in condizioni di differenziazione, le cellule staminali/progenitrici neurali derivate da SVG e DG migrano fuori dalle neurosfere, formando uno pseudomonostrato di cellule. In entrambe le regioni neurogeniche, è possibile osservare la presenza di Sox2 doppie coppie positive, nestina double positive, doublecortin double negative corrispondenti a divisioni simmetriche indicative di auto-rinnovamento. Coppie cellulari in cui una cellula di Sox2 positiva, annidina positiva e doublecortin negativa, e l'altra cella Sox2 negativa, annidina negativa e doublecortin positiva dimostrando divisioni asimmetriche.E sox2 doppio negativo, annidina doppio negativo, e doppia cortina doppia coppia di cellule positive corrispondenti a divisioni simmetriche indicative di differenziazione. Nel complesso, il passaging cambia il tasso di mortalità cellulare al secondo giorno in vitro. La neuritogenesi può essere valutata nei neuroni ottenuti dalla differenziazione delle cellule staminali/progenitrici neurali SVG e DG all'inizio della differenziazione.Come osservato, la lunghezza e la ramificazione dei neuriti aumenta con la differenziazione. Un'alta percentuale di cellule proliferativi si osserva in SVG rispetto alla DG. Sebbene la percentuale di progenitori proliferano che si differenziano in neuroni maturi sia simile in entrambe le nicchie neurogeniche. Entrambi i tipi di cellule sono anche in grado di differenziarsi in neuroni immaturi, neutroni maturi, cellule precursori di oligodendrociti, oligodendrociti maturi e astrociti.Dopo aver ottenuto le neurosfere, diversi metodi tra cui immunocitochimica, imaging del calcio, macchie occidentali e RT-PCR possono essere eseguiti per studiare la staminalità e la multipotenza delle cellule staminali neurali / progenitrici. Il saggio della neurosfera può essere applicato a modelli genetici e di malattia per valutare ulteriormente i processi molecolari e cellulari che coinvolgono sia la proliferazione che la differenziazione delle cellule staminali/progenitrici neurali.

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