Interrogatorio parallelo del reclutamento di z-Arrestin2 per lo screening dei ligandi su una scala a livello GPCR utilizzando PRESTO-Tango Assay

La piattaforma Presto-Tango è stata ideata per eseguire l'interrogatorio parallelo e simultaneo di tutti i GPCR non olfattivi nel genoma umano, compresi gli obiettivi orfani per profilare il reclutamento beta-arrestin 2 indotto dal ligando. La piattaforma Presto-Tango è l'unica risorsa open source per profilare l'intero genoma GPCR in un approccio parallelo, utilizzando un test di reclutamento beta-arrestin indipendente dalla proteina G. A dimostrare che il processore sarebbe Genevieve Laroche, un'associazione di ricerca nel mio laboratorio, e Manel Zighal, un dottorando nel mio laboratorio.

Prima di iniziare la procedura aggiungere 20 microlitri di una soluzione di poli-L-lisina da 25 microgrammi per millilitro ad ogni pozzo del numero sperimentale appropriato di 384 piastre inferiori ottiche e incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti o due ore. Alla fine dell'incubazione, scorrere le piastre sul lavandino per rimuovere l'eccesso di poli-L-lisina e aggiungere 40 microlitri di soluzione antimicotica antibiotica ad ogni pozzo. Quindi incubare le piastre necessarie per la semina cellulare a 37 gradi Celsius e posizionare il resto delle piastre a quattro gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.

Per seminare cellule HTLA per lo screening primario, sciacquare delicatamente colture cellulari confluenti da 150 millimetri con 10 millilitri di PBS prima di trattare le colture con sei millilitri dello 0,05% di tripside EDTA per piatto. Quando le celle hanno staccato il pool le sospensioni cellulari in un tubo conico da 50 millilitri contenente un volume uguale di DMEM. E raccogliere le cellule per centrifugazione.

Sospendere di nuovo il pellet a un 2,2 per 10 alla quinta colonna per millilitro di concentrazione DMEM e scorrere le piastre sul lavandino per rimuovere la soluzione antimicotica antibiotica. Toccare le piastre per asciugare e seminare 45 microlitri di cellule in ogni pozzo. Quindi posizionare le piastre a 37 gradi Celsius e 45% di anidride carbonica durante la notte.

Per preparare la piastra sorgente di DNA a 384 pozzetti per la trasfezione distribuire 50 nanogrammi per millilitro di ogni DNA plasmide gratuito che codifica per il costrutto GPRC Tango di interesse in 0,1X Tris-EDTA per pozzo in ogni pozzo di una piastra di pozzo 96. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire manualmente 10 microlitri di soluzione di DNA da ogni pozzo della piastra del pozzo 96 a singoli pozzi di una piastra di sorgente di DNA da 384 porri in quadruplicazione per ogni condizione come illustrato. Successivamente, trasferire 40 microlitri di una soluzione di cloruro di calcio molare 0,313 in ogni pozzo della piastra di origine del DNA e mescolare delicatamente il contenuto di ogni pozzo.

Aggiungere 50 microlitri di tampone HEPES 2x ad ogni pozzo della piastra sorgente di DNA del pozzo 384 con miscelazione delicata. Dopo un minuto trasferire 10 microlitri della miscela di trasfezione del DNA dalla piastra sorgente di DNA del pozzo 384 a ciascun pozzo di cellule HTLA sementi e incubare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare durante la notte. Il giorno dopo decantare il mezzo cellulare trasfetto e aggiungere lentamente 40 microlitri di mezzo affamato ad ogni pozzo facendo attenzione a non toccare direttamente le cellule.

Quindi aggiungere 20 microlitri del tampone del veicolo per le file alternate senza composto in 20 microlitri del composto di interesse a una concentrazione tre volte superiore nelle file alternate, prima di restituire la piastra all'incubatore di coltura cellulare. Da 16 a 24 ore dopo la stimolazione decantare il mezzo cellulare trasfetto e aggiungere 20 microlitri di reagente luminoso appena preparato ad ogni pozzo per un'incubazione da cinque a 20 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce. Quindi leggere le piastre su un contatore di luminescenza a microschede con un tempo di integrazione di un secondo per pozzo.

Per uno screening secondario, sottocultura delle cellule HTLA in piatti da 100 millimetri a una densità totale cellulare di cinque volte 10 per le sei cellule in 11 millimetri di mezzo completo per piatto per 24 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, miscelato 10 microgrammi di DNA gratuito GPCR con 500 microlitri di soluzione di cloruro di calcio Tris-EDTA con vortice seguito dall'aggiunta di 500 microlitri di tampone HEPES. Dopo uno scuotimento vigoroso, incubare la soluzione per un minuto a temperatura ambiente e aggiungere immediatamente un millilitro della soluzione cadere saggio sulle cellule.

Dondolare delicatamente per distribuire uniformemente il precipitato e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno dopo, controlla l'efficienza di trasfezione sotto un imager a celle fluorescenti. Le transazioni superiori al 50% di copertura sono ideali.

Risciacquare delicatamente le cellule trasfette con soluzione di versene prima di staccare le cellule con tre millilitri dello 0,05% di tripside EDTA. Raccogliere le cellule dissociate per centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet a una concentrazione media quattro volte 10 alla quinta per millilitro di concentrazione media affamata. Quindi seminare 45 microlitri di cellule in ogni pozzo di una piastra di pozzo poli-L-lisina codificata 384 e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per almeno quattro ore.

Per preparare una piastra di risposta dose-curva a mezzo log aggiungere 270 microlitri di HBSS integrati con HEPES e antimicotico antibiotico a tutti tranne l'ultima riga di una piastra di 96 pozzo e aggiungere 30 microlitri di ogni soluzione di farmaco alto e basso ai pozzi della riga H.Trasferire la soluzione da ogni pozzo di fila H nel pozzo corrispondente della riga G con miscelazione e continuare a diluire serialmente i composti del farmaco fino all'ultima riga della piastra è raggiungibile. Utilizzando lo schema come riferimento, mescolare 20 microlitri delle diluizioni a colonna bassa dalle file da A a G della piastra del pozzo 96 e 20 microlitri delle diluizioni a colonna alta ai pozzi da B a H della piastra del pozzo 96 alla piastra del pozzo 384 precedentemente seduta. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un minimo di 16 ore.

Da 16 a 24 ore dopo la stimolazione decantare il mezzo cellulare trasfetto e aggiungere 20 microlitri di reagente luminoso ad ogni pozzo per un'incubazione da cinque a 20 minuti prima di leggere le piastre su un contatore di luminescenza a micro piastra con un tempo di integrazione di un secondo per pozzo. In questo esperimento rappresentativo, dei 168 GPRS che sono stati interrogati nello screening primario, solo il recettore della dopamina D3 e l'opsin 5 erano contendenti come potenziali obiettivi attivi. Il recettore della dopamina D3 ha prodotto un significativo cambiamento di piega log2 di 4,7 mentre l'opsina 5 ha prodotto una risposta leggermente inferiore di 2,39.

In confronto, il recettore della dopamina D2, il controllo positivo per lo schermo primario ha prodotto un cambio di piega log2 di 4,58. Queste curve di risposta dallo screening secondario hanno dimostrato che l'estratto di granulo di cromatina produce finestre di segnale simili in valori di concentrazione effettivi mezzo massimi al quinpirolo confermando la sua validità come un colpo attivo al recettore della dopamina D3. Per l'opsin 5 è stata prodotta una curva di dose piatta simile al controllo negativo, escludendo tuttavia questo recettore come possibile bersaglio per l'estratto di granulo di cromatina. Presto-Tango richiede cure speciali in quanto le variabilità nella distribuzione cellulare, nell'efficienza di trasfezione e nelle diluizioni seriali dei farmaci possono causare errori composti, che possono influire sull'accuratezza dei dati.

Metodi ortogonali come approcci radioligand-binding, Bioluminescenza Resonance Energy Transfer e Cyclic AMP calcio e internalizzazione test funzionali possono essere utilizzati per confermare ulteriormente e caratterizzare le interazioni del recettore ligando.