Name: Induzione della morte cerebrale nei topi utilizzando il monitoraggio della pressione sanguigna intra-arteriosa e la ventilazione tramite tracheostomia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Impara a indurre la morte cerebrale nei topi con catetere arterioso e tracheostomia per studiare la risposta infiammatoria sistemica e valutare la viabilità degli organi per il trapianto.

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Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con i Principi di Laboratorio Animali Formulati dalla National Society for Medical Research e dalla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio preparati dalla National Academy of Science e pubblicati dai National Institutes of Health (La pubblicazione n. 86-23, rivista 1985). Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Ministero austriaco dell'Istruzione, della Scienza e della Cultura (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1. Cateterizzazione arteriosa
<ol><li>Anestesizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di ketamina e xilosina10 e un analgesico secondo la pratica locale (ad esempio buprenorphine).  Pizzicare gli arti posteriori con pinze per confermare la corretta profondità di anestesia. NOTA: Per questo studio, sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6N all'età di 8-12 settimane (peso 20-25 g). Gli autori hanno testato il maschio BALB/c della stessa età senza successo, ma non hanno provato altri ceppi (vedi Discussione).</li>
	<li>Rimuovere i capelli nelle regioni di interesse (testa, collo) utilizzando un rasoio elettrico. Assicurarsi che non rimangano capelli sciolti per prevenire la contaminazione della ferita. Successivamente disinfettare il campo chirurgico con il 70% di etanolo/clorexidina/ betadine e posizionare la supina del topo con la testa rivolta verso il chirurgo.</li>
	<li>Fare un'incisione cervicale media con forbici dissecistrici di sedzio.</li>
	<li>Dissezionare le ghiandole submandibolare e il tessuto muscolare del collo e separarli al fine di esporre l'arteria carotide comune. Utilizzare per lo più dissezione smussata tramite pinze.</li>
	<li>Mettere tre 8-0 legature di seta sotto l'arteria carotide comune destra.</li>
	<li>Posizionare un morsetto sulla legatura prossimale e portare tensione nell'arteria in modo che il flusso sia sospeso.</li>
	<li>Chiudere la legatura più dissina.</li>
	<li>Inserire il catetere arterioso attraverso un piccolo foro cutaneo preformato sull'aspetto cranico dell'incisione. Spremere e deformare il lume del catetere se appare troppo grande per ridurre il sangue. Fissare con tutte e tre le legature.</li>
	<li>Fissare il catetere sulla pelle per evitare la lussazione. Fare questo utilizzando una sutura (ad esempio, monofilamento 5-0, non assorbibile) che collega il catetere alla pelle nell'area del foro cutaneo preformato.</li>
</ol>2. Tracheostomia
<ol><li>Dissezionare la muscolatura pre-tracheale senza mezzi termini usando pinze.</li>
	<li>Posizionare due 8-0 legature di seta sotto la trachea.</li>
	<li>Tracheotomizza utilizzando micro forbici il più possibile proximalmente per evitare la ventilazione unilaterale. Utilizzare una linea di taglio orizzontale tra due cartilagini tracheali.</li>
	<li>Inserire il tubo di ventilazione e fissarlo con entrambe le legature preparate. NOTA: l'estremità prossimale della trachea non deve essere ligata.</li>
	<li>Chiudere la pelle con una sutura in funzione (ad esempio, monofilamento 6-0, non assorbibile).</li>
	<li>Ventilate il mouse con una frequenza di 150/min e un volume di marea di 200 l.</li>
</ol>3. Induzione della morte cerebrale
<ol><li>Disporre il mouse nella posizione prona.</li>
	<li>Rimuovere la pelle dal cranio utilizzando forbici chirurgiche e pinze per tenere la pelle.</li>
	<li>Forare un foro di trivellazione calibro 1 mm paradisiaca sopra la corteccia parietale sinistra. Interrompere la perforazione prima di rompere l'osso compatto interno e la dura mater.</li>
	<li>Penetrare il ponte intessuto finale del cranio con pinze smussate, rimuovendo i bordi taglienti.</li>
	<li>Inserire il catetere a palloncino, in modo che sia interamente all'interno della cavità cranica. Assicurarsi che il palloncino sia precompilato con salina e che tutta l'aria sia evacuata.</li>
	<li>Iniziate l'inflazione a 0,1 mL/min per un periodo di 10,15 min (volume totale di 0,8,1,2 mL) con l'aiuto di una pompa di siringa. NOTA: Il topo esporrà mioclonus, midriasi, ulteriore attività di sequestro e rantoli agonali.</li>
	<li>Pronunciare il cervello topo morto una volta che la coda del topo è andato rigido ed eretto. NOTA: Il BD è confermato da un caratteristico picco iniziale di pressione sanguigna (riflesso di Cushing), l'assenza di riflessi del tronco cerebrale e respirazione spontanea. I test regolari dell'apnea dovrebbero essere evitati durante gli esperimenti, poiché i topi possono diventare instabili circolatori a causa della mancanza di ossigeno.</li>
	<li>Fermare l'inflazione del catetere del palloncino.</li>
	<li>Mettere una coperta di riscaldamento sul mouse per evitare l'ipotermia.</li>
</ol>4. Durante il periodo BD
<ol><li>Monitorare e documentare regolarmente la pressione sanguigna. Escludere i topi con una fase ipotensiva prolungata (pressione arteriosa media [MAP] < 50 mmHg per >30 min).</li>
	<li>Infondere 0,1 mL di salina ogni 30 min per stabilizzare la pressione sanguigna del topo. NOTA: In totale è stato somministrato 0,8 mL di salina a ciascun topo in questo studio.</li>
	<li>Dopo 4 h di durata BD, raccogliere organi/tessuti per topi. Escludere il mouse dall'esperimento se il cuore del mouse non batte alla fine dell'esperimento.</li>
</ol>5. Procedura Sham
<ol><li>Eseguire i passaggi 1.1/3.3. NOTA: Non aprire l'osso compatto interno. Non inserire o gonfiare un catetere a palloncino.</li>
	<li>Stare vicino al mouse e osservare continuamente l'animale. Pizzicare ripetutamente gli arti posteriori con pinze per confermare la corretta profondità di anestesia. Applicare l'anestesia aggiuntiva sottocutaneamente (circa 1/2 della dose iniziale) se il topo mostra segni di risveglio, che, per nostra esperienza, avviene approssimativamente dopo 2/3 h dopo l'anestesia.</li>
	<li>Applicare la stessa quantità di salina per via endovenosa dei topi BD. NOTA: Il topo farsi riacquisterà la respirazione spontanea dopo la cessazione della ventilazione. Il mouse BD non lo farà. Il test dell'apnea dovrebbe essere fatto mentre si stabilisce il modello, ma durante gli esperimenti dovrebbe essere evitato a causa di inutili stress fisiologico.</li>
</ol>

<ol><li>Hart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OPTN%2FSRTR+2017+Annual+Data+Report%3A+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney.</a> American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19(2019).</li>
<li>The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+parameters+for+determining+brain+death+in+adults+%28summary+statement%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement).</a> Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).</li>
<li>Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+survival+rates+of+kidney+transplants+from+spousal+and+living+unrelated+donors%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+Medicine%22%5BJournal%5D)">High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors.</a> New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).</li>
<li>Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+be+learned+from+brain-death+models%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">What can be learned from brain-death models?</a> Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).</li>
<li>Wilhelm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+heart+by+donor+brain+death+accelerates+acute+rejection+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation.</a> Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).</li>
<li>Pomper, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+a+mouse+model+of+brain+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Introducing a mouse model of brain death.</a> Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).</li>
<li>Ritschl, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+brain+death+leads+to+differential+immune+activation+in+solid+organs+but+does+not+accelerate+ischaemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury.</a> Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).</li>
<li>Atkinson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+brain+death+exacerbates+complement-dependent+ischemia%2Freperfusion+injury+in+transplanted+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts.</a> Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).</li>
<li>Oberhuber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+tetrahydrobiopterin+overcomes+brain+death-associated+injury+in+a+murine+model+of+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).</li>
<li>Floerchinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+immune+responses+in+a+reproducible+mouse+brain+death+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model.</a> Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).</li>
<li>Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+barbiturate+protection+in+a+dog+model+of+complete+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia.</a> Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).</li>
<li>Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiological+effects+of+brain+death+on+potential+donor+organs%2C+with+particular+reference+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Royal+College+of+Surgeons+of+England%22%5BJournal%5D)">The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart.</a> Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).</li>
<li>Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+organ+perfusion+after+brain+death+in+the+rat+and+its+relation+to+circulating+catecholamines%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines.</a> Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il BD, un fattore di rischio per la qualità dell'allotrapianto nei donatori multiorgano, comporta una pletora di cambiamenti patofisiologici, che possono essere valutati solo in modo sufficiente utilizzando modelli in vivo. I cambiamenti emodinamici, la tempesta di citochine, i cambiamenti ormonali e il loro impatto finale sulla qualità e sulla sopravvivenza dell'innesto degli organi non possono essere analizzati in vitro4. La maggior parte dei trapianti di base e della ricerca immunologica dipend...

Il trapianto è attualmente l'unico trattamento curativo per l'insufficienza degli organi allo stadio finale. Fino ad ora, i pazienti con morte cerebrale (BD) sono stati la principale fonte di donazioni di organi, anche se la donazione e la donazione viventi dopo la morte circolatoria sono alternative preziose1. BD è definito da un coma irreversibile (con una causa nota), l'assenza di riflessi del tronco cerebrale e apnea2. Sfortunatamente, gli organi BD dimostrano risultati inferiori nella sopravvivenza del trapianto a lungo termine indipendente mente dall'antigene leucocito umano (HLA) -mismatch e freddo ischemico tempo3. Nel frattempo, è stata eseguita un'intensa ricerca su questo fattore di rischio indipendente dall'antigene, portando a tre aspetti principali dei cambiamenti patofisiologici mediati come conseguenza di BD: emodinamica, ormonale e infiammatoria4.
Fino ad oggi, i modelli BD sperimentali nei roditori sono stati per lo più eseguiti utilizzando ratti. Al fine di ottenere una maggiore comprensione delle conseguenze immunologiche sugli organi solidi dopo la BD, abbiamo cercato di stabilire un modello murino di BD, poiché attualmente solo i modelli murini consentono indagini complete sui fattori genetici o immunologici. In questo contesto, il sistema del mouse fornisce una maggiore varietà di strumenti analitici.
Il principio di induzione di BD come descritto qui si basa su un aumento della pressione intracranica indotta dall'inflazione di un catetere di palloncino inserito sotto il cranio. L'aumento della pressione intracranica imita il meccanismo fisiologico della BD bloccando la perfusione del cervello, del cervelletto e del tronco cerebrale5,6. Per garantire una perfusione sufficiente di organi periferici, la misurazione della pressione sanguigna è obbligatoria durante la procedura. Il catetere utilizzato per questo scopo allo stesso tempo serve per la somministrazione salina al fine di stabilizzare la pressione sanguigna con la sostituzione del fluido. Poiché la BD è accompagnata da cessazione della respirazione spontanea, deve essere garantita una ventilazione sufficiente. Una coperta elettrica mantiene la temperatura corporea fisiologica del nucleo.
In sintesi, questo modello consentirà studi approfonditi sull'influenza delle lesioni indotte da BD, sulla migrazione del leucocito7,sull'attivazione delcomplimento 8, sulla lesione da reperfusione ischemica9e su altri fattori.

<table><tbody><tr><td>Catetere arterioso (BD Neoflon 26G)</td><td></td><td></td>Trasduttori di pressione sanguigna BD 391349 <td></td></tr><tr><td>(APT300)</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>Catetere per embolectomia arteriosa di Fogarty N&deg; 3</td><td>Edwards Lifesciences Corporation</td><td>120403F</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>FST</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi di coperte omeotermiche con sonda flessibile</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>55-7020</td><td></td></tr><tr><td>Ketansol</td><td>Graeub</td><td>6680110</td><td></td></tr><tr><td>Micro forbice</td><td>FST</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi</td><td>FST</td><td>12060-02</td><td></td></tr><tr><td>Prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>8698H</td><td></td></tr><tr><td>Pompa 11 Elite Infusion Solo singolo</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Forbice</td><td>FST</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereotassico</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Nastro trasporoso</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>Sottocuscinetti</td><td>Molinea.A</td><td>274301</td><td></td></tr><tr><td>Ventilatore per topi (MiniVent Modello 845)</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>Xilasolo</td><td>Graeub</td><td>7630109</td><td></td></tr></tbody></table>

induzione della morte cerebrale nei topi utilizzando il monitoraggio della pressione sanguigna intra-arteriosa e la ventilazione tramite tracheostomia

Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy

Mentre sia la donazione vivente che la donazione dopo la morte circolatoria offrono opportunità alternative per il trapianto di organi, la donazione dopo la morte cerebrale del donatore (BD) rappresenta ancora la principale fonte di trapianti solidi. Sfortunatamente, la perdita irreversibile della funzione cerebrale è nota per indurre più cambiamenti patofisiologici, tra cui modifiche emodinamiche e ormonali, portando infine a una risposta infiammatoria sistemica. I modelli che consentono un'indagine sistematica di questi effetti in vivo sono scarsi. Vi presentiamo un modello murino di induzione BD, che potrebbe aiutare le indagini sugli effetti devastanti di BD sulla qualità allotrapianto. Dopo aver implementato la misurazione della pressione sanguigna intra-arteria attraverso l'arteria carotide comune e una ventilazione affidabile tramite una tracheostomia, BD è indotta da un costante aumento della pressione intracranica utilizzando un catetere a palloncino. Quattro ore dopo l'induzione di BD, gli organi possono essere raccolti per l'analisi o per ulteriori procedure di trapianto. La nostra strategia consente un'analisi completa del donatore BD in un modello murino, consentendo quindi una comprensione approfondita degli effetti correlati al BD nel trapianto di organi solidi e potenzialmente apaggendo la strada a un precondizionamento ottimizzato degli organi.

Il modello murine BD è stato eseguito con successo più di 100 volte con un tasso di successo di oltre il 90%. Inoltre, il trapianto di organi post intervento di cuore e rene è stato eseguito in modo sicuro7.
BD induce una varietà di cambiamenti patofisiologici che possono essere ulteriormente studiati utilizzando questo modello. Come mostrato nella Figura 1,la pressione sangu...

Presentiamo un modello murino di induzione della morte cerebrale al fine di valutare l'influenza dei suoi effetti patofisiologici sugli organi e su innesti consecutivi nel contesto del trapianto di organi solidi.

Induzione della morte cerebrale nei topi utilizzando il monitoraggio della pressione sanguigna intra-arteriosa e la ventilazione tramite tracheostomia

While both living donation and donation after circulatory death provide alternative opportunities for organ transplantation, donation after donor brain ...

Sebbene la donazione dopo la morte cerebrale del donatore sia la fonte principale per il trapianto di organi solidi, la perdita irreversibile della funzione cerebrale induce cambiamenti fisiopatologici che portano a una risposta infiammatoria sistemica. Questo modello murino di induzione cervello-morte consente l'uso di una grande varietà di strumenti analitici e modelli knockout per studiare i percorsi della regolazione della morte cerebrale. Per la cateterizzazione arteriosa dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale e aver rimosso i capelli addominali superiori, disinfettare la pelle esposta con il 70% di etanolo e utilizzare forbici sezionanti per fare un'incisione della linea mediana nella pelle.Usando le forcelle, sezionare contundente le ghiandole sottomandibolari e il tessuto muscolare del collo e separare i tessuti per esporre la comune arteria carotide. Posizionare tre 8-0 legature di seta sotto la giusta arteria carotide comune e posizionare un morsetto sulla legatura prossimale. Portare tensione nell'arteria in modo che il flusso sia sospeso e chiudere la legatura più distatale.Inserire un catetere arterioso calibro 26 attraverso un piccolo foro cutaneo preformato sull'aspetto cranica dell'incisione. Spremere il catetere con le forcep se il lume è troppo grande per ridurre il riflusso e fissare il catetere con tutte e tre le suture, quindi utilizzare un singolo monofilamento 5-0 non assorbibile per fissare il catetere alla pelle vicino al foro della pelle preformato. Per eseguire una tracheostomia, utilizzare le forcep per smussare la muscolatura pretracheale e posizionare due 8-0 legature di seta sotto la trachea.Inserire il tubo di ventilazione tra due cartilagine tracheali per evitare la ventilazione unilaterale e fissare il tubo con entrambe le legature preparate, quindi chiudere la pelle con una sutura di corsa non assorbibile a monofilamento 6-0 e ventilare il mouse con una frequenza di 150 al minuto e un volume mareale di 200 microlitri. Per indurre la morte cerebrale nell'animale sperimentale, disporre il topo nella posizione prona e, tenendo la pelle con le forcep, utilizzare forbici chirurgiche per rimuovere la pelle dal cranio. Perforare un foro di trivellazione della pinza di un millimetro perimedialmente sopra la corteccia parietale sinistra e utilizzare pinze smussate per penetrare nel ponte di tessuto finale del cranio.Dopo aver rimosso eventuali spigoli vivi, inserire un catetere a palloncino precompilato con soluzione salina con tutta l'aria evacuata. Quando il catetere è interamente all'interno della cavità cranica, utilizzare una pompa per siringhe per iniziare a gonfiare il catetere a circa 0,1 millimetri al minuto per un periodo di 10-15 minuti. Quando si verifica la morte cerebrale, interrompere l'inflazione del catetere a palloncino e posizionare una coperta riscaldante sul topo per evitare l'ipotermia.Dopo che la morte cerebrale è stata confermata, monitorare e documentare regolarmente la pressione sanguigna, infondendo 100 microlitri di soluzione salina ogni 30 minuti per stabilizzare la pressione sanguigna dell'animale. Dopo quattro ore di morte cerebrale, escludere tutti gli animali senza battere i cuori e raccogliere gli organi del topo e i tessuti di interesse secondo protocolli standard. Dopo l'induzione cerebrale-morte, la pressione sanguigna mostra un picco ipertesivo iniziale seguito da una fase ipotensiva prolungata.Un'altra osservazione ben consolidata è che l'induzione cervello-morte porta all'attivazione del sistema immunitario. Infatti, dopo quattro ore di morte cerebrale in questo modello, si osserva un'upregolazione specifica dell'organo dei marcatori immunitari a livello di mRNA. Dopo un periodo predefinito di morte cerebrale, gli organi possono essere raccolti per la loro analisi diretta o per il successivo trapianto di organi.Questo modello consentirà studi approfonditi sull'influenza delle lesioni indotte dalla morte cerebrale e ha già rivelato nuove intuizioni sull'attivazione del complemento e sulla migrazione dei leucociti.

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Induzione della morte cerebrale nei topi utilizzando il monitoraggio della pressione sanguigna intra-arteriosa e la ventilazione tramite tracheostomia (Video) | JoVE Journal

Induzione della morte cerebrale nei topi utilizzando il monitoraggio della pressione sanguigna intra-arteriosa e la ventilazione tramite tracheostomia

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