Identificazione delle trappole extracellulari neutrophil in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi utilizzando la microscopia immunofluorescenza

Questo protocollo della parafinizzazione seguito dal recupero dell'antigene delle sezioni aortiche incorporate nella paraffina può essere uno strumento utile per studiare il ruolo delle trappole tricellulari neutrofile nella trombosi felina. Il rilevamento di trappole tricellulari neutrofile mediante immunofluorescenza nel tessuto fisso e incorporato nella paraffina, è superiore agli stent istologici convenzionali come l'HNE, in quanto consente il rilevamento simultaneo di DNA più sicuro e proteine extracellulari. Questo protocollo può essere utilizzato in altri tipi di trombi e in altre specie veterinarie.

L'identificazione di trappole extracellulari neutrofile all'interno di trombi arteriosi felini suggerisce che possano svolgere un ruolo nella trombosi nei gatti. I protocolli qui presentati sono linee guida. Incoraggiamo vivamente gli investigatori ad regolare la durata e le condizioni del processo di recupero dell'antigene per fornire un segnale soddisfacente.

Per utilizzare un sistema automatizzato per eseguire la deparaffinizzazione e la reidratazione delle sezioni su vetrini, posizionare gli scivoli di vetro in rack. Immergersi completamente in salina al 100% per tre minuti. Ripetere questo passaggio due volte.

Non risciacquare tra un passo e l'altro. Immergersi completamente in concentrazioni decrescenti di etanolo a temperatura ambiente tre volte per tre minuti ciascuna. Immergersi completamente in acqua deionizzata per due minuti e ripetere ancora una volta.

Dopo il trattamento con TBST, riempire il serbatoio con acqua deionizzata riscaldata a 100 gradi Celsius. Lasciare equilibrare la camera del piroscafo per 20 minuti. Su una piastra termica, riscaldare la soluzione di recupero dell'antigene disponibile in commercio contenente Tris ed EDTA a pH da 9,0 a 95-97 gradi Celsius.

Assicurarsi che non bolle. Suberge gli scivoli completamente nella soluzione di recupero dell'antigene riscaldato e continuare l'applicazione del riscaldamento esterno tramite il piroscafo per 20 minuti. Quindi, lavare le diapositive tre volte con TBST per cinque minuti.

Ora, posizionare le sezioni nel buffer di blocco 1. Incubare per due ore a temperatura ambiente a dondolo delicato tra i 30 e i 50 giri/min. Senza lavaggio, applicare immediatamente 100 microlitri di anticorpo istone H3 citrullinato policlonale di coniglio diluito direttamente sullo scivolo.

Posizionare un foglietto di copertura su ogni sezione per consentire una distribuzione uniforme della miscela di anticorpi. Incubare per 12-16 ore a quattro gradi Celsius con un dolce dondolo. Successivamente, lavare gli scivoli tre volte con TBST per cinque minuti ogni volta.

Per applicare anticorpi, utilizzare una pipetta e distribuire uniformemente 100 microlitri di anticorpi anti-coniglio di capra coniugati ad Alexa Fluor 488. Coprire i vetrini con un foglio di latta e incubare gli scivoli per un'ora a temperatura ambiente sotto un leggero dondolo. Dopo il lavaggio con TBST secondo il manoscritto, incubare le sezioni nel tampone di blocco 2 durante la notte a quattro gradi celsius sotto un dolce dondolo.

Proteggiti dalla luce. Lavare con TBST tre volte per cinque minuti ogni volta. Bloccare le sezioni nel buffer di blocco 3 come fatto in precedenza a temperatura ambiente per due ore sotto un leggero dondolo.

Incubare le sezioni con anticorpo dell'elastasi neutrofila anti-umano del coniglio ploiclonale biotina a quattro gradi Celsius per 12-16 ore come descritto in precedenza. Dopo il lavaggio con TBST incubare gli scivoli con Alexa Fluor 594 Streptavidin Coniugato per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, lavare con TBST una volta per cinque minuti.

Applicare 100 microlitri di miscela di soluzione di tempra autofluorescenza direttamente sulle sezioni per un minuto, come indicato dal produttore. Lavare immediatamente gli scivoli con TBST sei volte per 10 minuti ogni volta. Coprire ogni diapositiva con 100 microlitri di 300 DAPI nanomolare per cinque minuti al buio.

Quindi lavare con TBST cinque volte per tre minuti ogni volta. Applicare una goccia di mezzo di montaggio antifade direttamente sullo scivolo di vetro che circonda la sezione. Posizionare delicatamente un coperchio sulla sezione senza creare bolle.

Lasciare che i campioni si curino durante la notte al buio a quattro gradi Celsius. Per localizzare trombi, scansionare cranicamente per caudally lungo la lunghezza dell'aorta, della biforcazione aortica e di ogni arteria femerale usando la microscopia a contrasto di fase con un obiettivo 10x. Esaminare innanzitutto le sezioni per il DNA privo di cellule utilizzando il canale DAPI con l'eccitazione a 357 e 44 nanometri.

Identificare l'elastasi neutrofila extracellulare e l'istono citrullinato H3 rispettivamente sui canali delle proteine fluorescenti rosse e verdi del Texas. Mantieni un tempo di esposizione costante e guadagni di ogni canale durante l'acquisizione delle immagini per evitare la saturazione dell'intensità dei pixel. Le trappole extracellulari neutrofile sono identificate sulla co-localizzazione basata sull'elastasi neutrofila, sull'istono citrullinato H3 e sul DNA privo di cellule.

Usando la macchia di ematossilina ed eosina e la microscopia a campo luminoso, i trombi arteriosi felini sono costituiti da globuli rossi, leucociti, fibrina e piastrine. I NET apparivano come reti di fili viola intenso di varie lunghezze che circondavano gli erytrociti e i leucociti vicini. Utilizzando questo protocollo, la microscopia ad immunofluorescenza ha rivelato grandi aggregati di NET composti da DNA privo di cellule, istono extracellulare citrullinato H3 ed elastasi neutrofila.

Sotto il contrasto di fase nella microscopia immunitaria, un trombo era caratterizzato come una struttura ben delimitata all'interno dello spazio vascolare. Tuttavia, gli trombi non sono stati rilevati in nessuno dei campioni di controllo. Questa figura dimostra una profonda autofluorescenza di elementi coaguli come gli eriociti quando vengono imageati alla lunghezza d'onda di 488 nanometri.

Una breve tempra ad autofluorescenza dopo l'immunoetichettatura ha aumentato significativamente la sensibilità della co-localizzazione proteica e del rilevamento della RETE anche in aree con abbondanza di erillociti. La durata della fissazione in effetti sull'immunoreattività di alcuni antigeni. Si consiglia la fissazione per non più di 24 ore alla pari della disidratazione e dell'incorporamento della paraffina.

In alternativa, la paraformaldeide priva di metanolo può essere usata per limitare l'artefatto da acido formico e chetoni dall'ossidazione della formaldeide. Per prevenire interferenze quando si utilizzano anticorpi primari provenienti dalla stessa specie, abbiamo incluso un ulteriore passaggio di blocco per saturare tutti i siti di legame rimanenti sugli anticorpi secondari. Gli investigatori devono includere controlli negativi costituiti da anticorpi dell'isotipo, esclusione di anticorpi primari e fase di immunoeli etichettatura e controlli biologici da parte di gatti senza trombosi.

L'autofluorescenza dei limiti tissutali dei trombi può martellare l'identificazione microscopica delle trappole extracellulari neutrofile. Lo sperimentatore può ridurre al minimo la fluorescenza con l'uso di fluorofori rosso lontano. Questa tecnica può essere uno strumento prezioso per lo studio delle trappole extracellulari neutrofile in altre specie veterinarie.

Ciò può fornire una migliore comprensione della fisiopatologia della trombosi.