Sintesi di nanoparticelle magnetiche funzionalizzate, la loro coniugazione con la feroxamina Sideroforo e la sua valutazione per il rilevamento dei batteri

Questo lavoro descrive i protocolli per la preparazione delle nanoparticelle magnetiche, il suo rivestimento con SiO₂, seguito dalla sua funzionalizzazione dell'amine con (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e la sua coniugazione con deferoxamina utilizzando una moiety succinyl come linker. Una descrizione della caratterizzazione strutturale profonda e un assaggio di batteri di cattura utilizzando Y. enterocolitica per tutte le nanoparticelle intermedie e il coniugato finale sono anche descritti in dettaglio.

Le nanoparticelle magnetiche sono strumenti ideali per la scienza analitica e la nano medicina grazie alle loro forti proprietà magnetiche e alla facile funzionalizzazione della loro superficie. Qui riferiamo il primo caso di coniugato tra particelle magnetiche di silice amminofunzionalizzate e feroxamina sideroforo insieme alla valutazione per la cattura di materiale fotogenico. I siderofori sono piccole molecole organiche che svolgono un ruolo chiave nel meccanismo di presa del ferro, e sono riconosciuti da specifici recettori esterni della membrana dei batteri.

Questo video mostra, passo dopo passo, un protocollo efficiente per preparare nanoparticelle magnetiche di ferro. Quindi, sono stati rivestiti con silice per proteggere la dispersione e proteggere il nucleo magnetico. La superficie del reattore risultante è stata funzionalizzata con gruppi amminici.

Sintesi di nanoparticelle magnetiche coniugate con feroxamina. Aggiungere 0,5 grammi di Fe(acac)3 in una fiala di vetro da 20 mL. Quindi, mescolare con un 10 mL di alcol benzile.

Sonicare questa miscela per 2 minuti. Quindi, trasferire in un blocco riscaldante e riscaldare a 180 gradi centigradi per 72 ore. Risciacquare le nanoparticelle con il 96% di etanolo.

E centrifugare per 30 minuti. Separare le nanoparticelle dal supernatante per attrazione magnetica, usando un magnete al neodimio. Scartare il solvente residuo.

Scartare il supernatante, alternato alla sonicazione, fino a quando il solvente non appare chiaro. Preparare una sospensione di 2 grammi di MNP in 80 millilitri di isopropanolo, aggiungere 4 millilitri di 21% di ammoniaca, 7,5 millilitri di acqua distillata e 0,56 millilitri di TEOS. Scaldare la miscela a 40 gradi centigradi per 2 ore, con agitazione continua.

Quindi, sonicare per 1 ora. Separare l'MNP con un magnete, scartare il supernatante, disperderlo in 30 millilitri di isopropanolo, aggiungere ammoniaca, acqua distillata e TEOS, nello stesso ordine descritto in precedenza. Scaldare la miscela a 40 gradi centigradi per due ore con agitazione continua.

Quindi, sonicare per un'ora. Rimuovere e lavare comodamente la barra di agitazione magnetica, per recuperare tutto il materiale. Scartare il supernatante e sciacquare le nanoparticelle con il 96% di etanolo tre volte, alternandosi alla sonicazione.

Asciugare le nanoparticelle sotto vuoto a temperatura ambiente per 12 ore. Risciacquare 500 milligrammi del MNP@SIO2 ottenuto dalla fase precedente con dimetilformamide. Sonicarli e scartarli.

Sospendere di nuovo le particelle in un pallone a fondo tondo, mescolare con una barra magnetica e aggiungere 9 millilitri di APTES. Mescolare la miscela a 60 gradi centigradi per 12 ore. Scartare il supernatante e sciacquare le nanoparticelle con il 96% di etanolo tre volte, alternandosi alla sonicazione.

Sciogliere 100 mg di deferoxamina, sale mesilato e 53,0 milligrammi di acetilacetonato di ferro in 5 millilitri di acqua distillata. Mescolare la miscela durante la notte a temperatura ambiente. Lavare il prodotto risultante tre volte con 20 millilitri di acetato di etile in un imbuto di separazione.

Rimuovere il solvente organico sotto vuoto. Congelare la fase acquosa per permettersi feroxamina e un solido rosso. Aggiungere 350 milligrammi di anidride succinica a una soluzione di 100 mg di feroxamina in 5 millilitri di piridina in un pallone a fondo tondo da 50 millilitri.

Mescolare la miscela risultante, a temperatura ambiente, per 16 ore. Rimuovere l'eccesso di piridina a pressione ridotta. Sciogliere il grezzo di reazione in 3 millilitri di metanolo.

Trasferire la soluzione metanolo in una colonna LH-20 ed eluirsi a 0,5 mL/minuto. Raccogliere la frazione rossa e rimuovere il metanolo sotto vuoto. Risciacquare 30 mg di nanoparticelle funzionalizzate all'ammina secca due volte con DMF e sonicare le nanoparticelle in un pallone Erlenmeyer da 100 millilitri per 30 minuti.

Preparare una soluzione di 200 milligrammi N-succinilferoxamina, 173 milligrammi Benzotriazolo 1-yl-oxy-tris-phosphonium esafluorofosfato BOP, 46 mg 1-idrossibenzotriazolo HOBt e 128,8 milligrammi N, N-diisopropiletilammina DIPEA, in 10 ml di DMF, in un pallone a fondo tondo da 50 millilitri. Sospendere il liquido precedentemente MNP@SiO2@NH2 in un 3 millilitro di DMF, in condizioni di sonicazione in condizioni asciutte e privo di ossigeno. Utilizzare l'atmosfera di argon.

Aggiungere, dropwise, mescolare A per mescolare B.Shake la miscela finale, utilizzando uno shaker orbitale, a temperatura ambiente durante la notte. Separare il coniugato risultante dalla sospensione utilizzando un magnete. Saggio batterico con ceppi di Y.enterocolitica per quantificare l'isolamento e la cattura di batteri patogeni con nanoparticelle.

Preparare una sospensione di tutte le nanoparticelle intermedie e il coniugato finale in PBS a 1 mg/ml in tubi sterili. Preparare una cultura di Y.entorocolitica in 5 mL di Luria Bertani, LB, brodo durante la notte. Preparare un 5 mL di brodo di soia Trypcase carente di ferro, TSB, con l'aggiunta di 50 microlitri di soluzione 10 mM 2, 2-bipiririle.

Inoculare i 5 millilitri di brodo TSB carente di ferro con 50 microlitri della coltura notturna di Y.enterocolitica. Incubare a 37 gradi centigradi con agitazione fino al raggiungere un OD600 da 0,5 a 0,8. Prendi 100 microlitri della coltura notturna e diluilo in un tubo contenente 900 microlitri di PBS per ottenere la prima diluizione 1/10.

Quindi, preparare una diluizione 1/100 dalla prima diluizione utilizzando la stessa procedura per ottenere una concentrazione di cellule batteriche a 10 alla potenza di 6 unità di formazione di colonie per millilitro approssimativamente. Aggiungere 100 microlitri di sospensione delle nanoparticelle e da 1 mg/mL a 1 millilitro della diluizione batterica 1/100. Separare gli aggregati batterici MNP, usando un magnete, scartare, con attenzione, il supernatante.

Risciacquare le nanoparticelle separate due volte con PBS da 1 millimetro usando un vortice. Preparare quattro diluizioni successive 1/10 dalla precedente sospensione, fino a un 10 alla potenza di meno 4 diluizione. Piastra 10 microlitri di ogni diluizione su piastre di agar TS.

Fotografare la lastra con un digitalizzatore in gel in modalità epi bianco. Elaborare l'immagine, utilizzando il comodo software, per amplificare un punto per contare il numero di singole colonie. Per confermare la formazione del legame covalente tra le nanoparticelle e il sideroforo, utilizziamo la spettroscopia FT-IR Raman per monitorare la sintesi, osservando come appaiono nuove bande in accordo con un nuovo gruppo funzionale in ogni fase.

La microscopia TEM e SEM è stata utilizzata per osservare la morfologia e la dimensione delle particelle. Analisi termogravimetrica per misurare la perdita di peso dovuta all'aggiunta di materiale organico. E XPS ci permettono di analizzare i diversi stati di ossidazione degli atomi in superficie e confermare la formazione di legami covalenti.

Infine, abbiamo usato tutti gli intermedi sul coniugato finale per testare la sua capacità di catturare i batteri, al fine di stabilire le loro proprietà come biosensore. Questo protocollo è stato progettato per sfruttare l'elevata biocompatibilità delle nanoparticelle di magnetite. Il rivestimento con silice migliora la dispersione e protegge il nucleo magnetico dalla degradazione in mezzi acquosi.

E dare anche una superficie reattiva per funzionalizzare con gruppi amminici che sono necessari per legare covalentemente un sideroforo modificato acido dalla chimica della carbodiimide. In questo caso, N-succynilferoxamina. La capacità di cattura dei batteri coniugati è stata testata e, di conseguenza, è stato trovato un basso numero di colonie, senza differenze significative con gli intermedi a causa di una specifica interazione su effetti ingombranti presentati nella sospensione batterica PBS.