Stimolazione di nicchie di cellule staminali e rigenerazione tissutale nella pelle di topo mediante fotogenerazione commutabile protoporfirina IX-dipendente di specie reattive dell'ossigeno in situ

La nostra metodologia è la prima a fornire uno strumento sperimentale affidabile per indurre un'attivazione transitoria di una specie reattiva endogena dell'ossigeno o la produzione di ROS in un tessuto in vivo. La nostra metodologia fornisce una procedura robusta, facile da usare e non invasiva che produce una produzione costante di livelli fisiologici stimolanti di ROS nella pelle utilizzando fondamentalmente una fonte di luce rossa. Poiché l'induzione fisiologica dei ROS nella pelle soddisfa le esigenze staminali dei tessuti, abbiamo ulteriormente applicato la nostra metodologia per la terapia di rigenerazione della pelle, compresa una buona guarigione e la crescita dei capelli.

La biologia e la segnalazione dei ROS sono attualmente oggetto di ricerca intensiva. Uno dei principali limiti per studiare la funzione dei ROS in vivo è la mancanza di strumenti adeguati per indurre una produzione endogena controllata di ROS. La NOSTRA metodologia è facile e facile da usare, ma tutti i dispositivi, lampade, flebo, IS, eccetera, devono essere adeguatamente calibrati.

I precursori chimici critici devono essere freschi e tutti i passaggi o il protocollo devono essere seguiti rigorosamente. Per indurre la crescita dei peli sulla pelle dorsale dei topi nella seconda fase telogen, dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale in circa 50 giorni di cucciolata postnatale C57 black six mouse, utilizzare un rasoio e una crema depilatoria per rimuovere due regioni di pelle affiancate indipendenti dalla parte posteriore di ciascun topo. Dopo qualche minuto, rimuovere la crema con PBS e registrare la crescita del follicolo pilifero attraverso l'acquisizione quotidiana di immagini ad alta risoluzione delle aree cutanee dorsali di controllo e trattate di ogni animale.

Per indurre la generazione di ustioni di secondo grado sulla pelle dorsale dei topi nella seconda fase telogen, rimuovere i peli dalla parte posteriore del topo. Preriscaldare una barra di ottone di un centimetro a 95 gradi Celsius in acqua bollente e applicare la barra sulla regione centrale della pelle del topo per cinque secondi. Immediatamente dopo la generazione dell'ustione, iniettare intraperitonealmente agli animali un millilitro di soluzione fisiologica per prevenire la disidratazione e consentire ai topi di riprendersi per 24 ore prima di procedere al trattamento.

Per la generazione di cellule di ritenzione marcate con BrdU o LRC, iniettare compagni di cucciolata di 10 o 14 giorni per via intraperitoneale una volta al giorno per quattro giorni consecutivi con 50 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo di BrdU in PBS. Dopo la fase di marcatura, lasciare che i topi si sviluppino per 50-60 giorni prima di applicare il trattamento. Per indurre la produzione transitoria di specie reattive dell'ossigeno non letali o livelli di ROS nella pelle del topo per un'analisi della crescita dei capelli, dopo aver acquisito un'immagine di crescita dei peli di base, applicare localmente circa 25 milligrammi di crema mALA sulla regione destra della pelle rasata e porre l'animale al buio per 2,5 ore.

Al termine del periodo di trattamento con fotosensibilizzante, rimuovere accuratamente l'eccesso di crema con PBS e confermare la produzione di PP9 in situ mediante espressione di fluorescenza rossa sotto eccitazione con luce blu, quindi irradiare l'intera pelle posteriore con un'adeguata fonte di luce rossa per una dose totale da 2,5 a 4 joule per centimetro quadrato. Quindi lasciare che i topi si riprendano su una coperta elettrica con monitoraggio fino alla completa decubito prima di riportare gli animali nelle loro gabbie. Per attivare la produzione transitoria di ROS per la guarigione delle ustioni di secondo grado, applicare circa 25 milligrammi di crema mALA lungo la superficie destra dell'ustione e circa quattro millimetri di tessuto adiacente e porre gli animali al buio per 2,5 ore come dimostrato.

Dopo aver rimosso la crema, irradiare tutta la pelle della schiena e lasciare che i topi si riprendano con il monitoraggio come dimostrato. Per indurre la produzione transitoria di ROS nella pelle della coda, applicare circa 25 milligrammi di crema mALA lungo tutta l'area del tessuto dorsale dei topi trattati con BrdU e irradiare la pelle dorsale della coda come dimostrato. Dopo l'eutanasia dei topi, raccogli la pelle della coda per il rilevamento di BrdU.

Usa un bisturi per raccogliere la coda da ogni animale, quindi fai incisioni longitudinali diritte e sbuccia l'intera pelle come un unico pezzo dalla spina dorsale. Incubare i pezzi di pelle sbucciati in cinque millimolari EDTA e PBS e provette da cinque millilitri per quattro ore a 37 gradi Celsius per consentire l'attenta separazione dei fogli intatti di epidermide dal derma con una pinza. Fissare i tessuti separati in formaldeide al 4% e PBS per almeno 72 ore a temperatura ambiente.

Quindi etichettare i tessuti fissati con gli anticorpi coniugati a fluorescenza di interesse prima di visualizzare i tessuti mediante microscopia confocale a fluorescenza secondo protocolli standard per identificare e quantificare le LRC in ciascuna condizione sperimentale. Per la valutazione ex vivo della produzione di ROS, dopo aver raccolto pezzi di pelle di coda di topo come dimostrato, incubare i tessuti di controllo non trattati e cinque millimolari EDTA e PBS da soli e i campioni di trattamento fotodinamico in EDTA integrati con due mALA millimolari. Successivamente, aggiungere l'idroetidina a una concentrazione finale di 3,2 micromolari in ciascun set di tessuti e incubare tutti i campioni per un'ora a temperatura ambiente al buio.

Al termine dell'incubazione, utilizzare la punta delle dita per stendere i campioni di pelle della coda su una superficie di vetro e irradiare i tessuti trattati con 636 nanometri di luce rossa a una fluenza di 10 joule per centimetro quadrato. Al termine del trattamento, separare immediatamente l'epidermide dal derma e fissare i fogli epidermici in formaldeide al 4% e PBS per almeno 72 ore a temperatura ambiente. Al termine della fissazione, valutare l'emissione di 2-idrossietidio rosso mediante microscopia a fluorescenza utilizzando la luce verde eccitante per consentire l'acquisizione di immagini di alta qualità.

Per il rilevamento in vivo della produzione di ROS nella pelle dorsale, subito dopo l'irradiazione con luce rossa, applicare 100 microlitri di un milligrammo per millilitro di DH-FDA e il 50% di etanolo su tutte le aree cutanee di controllo e trattate. La somministrazione topica del precursore mALA sul dorso e sulla pelle della coda del topo provoca un significativo accumulo di protoporfirina IX nell'intero tessuto e notevolmente nel follicolo pilifero, come dimostrato dalla fluorescenza rosa rossastra di questo composto sotto eccitazione con luce blu. La successiva irradiazione del tessuto trattato con luce rossa favorisce la produzione transitoria di ROS all'interno del tessuto, in particolare nella regione di rigonfiamento del follicolo pilifero.

L'attivazione della produzione di ROS non letali nella pelle di topo in vivo promuove un aumento significativo del numero di LRC nella regione di rigonfiamento del follicolo pilifero due giorni dopo il trattamento fotodinamico. In particolare, l'aumento del numero di LRC è transitorio, ripristinando i livelli normali sei giorni dopo il trattamento. La produzione transitoria di ROS accelera la guarigione della pelle dopo un'ustione di secondo grado.

La quantificazione della graduale riduzione della cute danneggiata dimostra la robustezza e la significatività statistica del tessuto del processo di accelerazione della guarigione delle ferite. Allo stesso modo, i livelli di ROS non letali promuovono fortemente la crescita dei peli dopo la rasatura durante il secondo telogen coordinato, una fase durante la quale il follicolo pilifero è refrattario a rispondere agli stimoli di crescita. Inoltre, la produzione di ROS dopo i fototrattamenti è significativamente ridotta dall'applicazione di composti antiossidanti.

La produzione di PP IX in situ mediante espressione fluorescente rossa sotto eccitazione di luce blu deve essere accuratamente confermata. Per indurre la produzione di ROS, l'irraggiamento della sorgente di luce rossa deve essere stabilito correttamente. rispetto ai tessuti e alla dose totale di luce.

Dopo l'induzione dei ROS, le attuali tecniche biochimiche e di biologia cellulare e molecolare possono essere utilizzate per analizzare i campioni raccolti e valutare la risposta fisiologica dinamica del tessuto. La nostra metodologia fornisce un potente strumento per studiare l'effetto fisiologico di una produzione transitoria di ROS endogeni in un tessuto in vivo. Si tratta di un nuovo approccio sperimentale che può essere molto utile per i ricercatori nel campo della segnalazione dei ROS.