Name: Stimolazione di nicchie di cellule staminali e rigenerazione tissutale nella pelle di topo mediante fotogenerazione commutabile protoporfirina IX-dipendente di specie reattive dellossigeno in situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Scopri come indurre la produzione transitoria di specie reattive dell'ossigeno nella pelle di topo mediante luce rossa per stimolare la rigenerazione tissutale. Questo metodo non invasivo promuove la crescita dei capelli e la guarigione delle ferite.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 to JE) e dell'Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 to JE) della Spagna. EC è stata sostenuta dalla sovvenzione Atracción de Talento Investigador 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid e UAM).

Tutte le procedure di allevamento e sperimentazione dei topi devono essere condotte in conformità con la legislazione locale, nazionale, internazionale e le linee guida sulla sperimentazione animale.
1. Induzione della crescita dei peli, induzione delle ustioni e identificazione di LRC BrdU a lungo termine nell'epitelio della pelle della coda wholemounts
NOTA: Utilizzare topi C57BL/6 di 10 giorni o 7 settimane, preferibilmente cucciolate, per i disegni sperimentali descritti di seguito. In tutte le procedure sperimentali, gli animali saranno anestetizzati mediante inalazione di isoflurano al 3% o eutanasia mediante dislocazione cervicale come indicato.
<ol><li>Induzione della crescita dei peli nella pelle posteriore dei topi nella seconda fase telogen (a riposo) (circa giorno 50 post-natale)<ol><li>Anestetizzare i topi con inalazione di isoflurano al 3%. Confermare l'anestesia profonda completa per mancanza di un riflesso del pedale (pizzico fermo della punta). Rasare due regioni indipendenti affiancate della pelle posteriore in ogni singolo topo usando tagliacapelli e crema depilatoria (Table of Materials). Utilizzare il lato sinistro per il controllo e il lato destro per il trattamento. NOTA: Controllare che, dopo la rasatura, la pelle posteriore sottostante sia rosata e non grigia/nera, indicatore di melanogenesi e ingresso nella fase anagen (crescita) in questo ceppo murino.</li>
		<li>Lavare accuratamente con PBS per rimuovere tutti i residui di crema e procedere all'induzione della produzione transitoria in situ di livelli di ROS non letali come descritto nel paragrafo 2.1.</li>
		<li>Registra la crescita del follicolo pilifero attraverso l'acquisizione giornaliera di immagini ad alta risoluzione delle aree della pelle posteriore di controllo e trattate in ciascun animale (ad esempio, utilizzando una videocamera HD accoppiata a un obiettivo binoculare 5-20x).</li>
	</ol></li>
	<li>Induzione di lesioni da ustione di 2° grado nella pelle posteriore dei topi nella seconda fase telogen (a riposo) (circa giorno 50 post-natale)<ol><li>Anestetizzare i topi. Rasare l'intera regione della pelle posteriore in ogni singolo topo usando tagliacapelli e crema depilatoria e lavare accuratamente con PBS per rimuovere tutti i resti di crema. NOTA: Somministrare in situ iniezioni sottocutanee di lidocaina allo 0,5% (2 mg/ml) in soluzione salina sterile, non superiore a 7 mg/ml, poco prima della procedura di combustione.</li>
		<li>Preriscaldare una barra di ottone (1 cm di sezione trasversale) a 95 °C immergendola in acqua bollente e quindi applicare sulla regione centrale della superficie dorsale della pelle dorsale di ciascun topo per 5 s.</li>
		<li>Subito dopo la generazione di ustioni, iniettare per via intraperitoneale gli animali con 1 ml di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) su una coperta elettrica per prevenire la disidratazione. Lasciare che gli animali si riprendano per 24 ore e procedere all'induzione della produzione transitoria in situ di livelli di ROS non letali, come descritto nel paragrafo 2.3.</li>
		<li>Registrare la progressione della ferita da ustione attraverso l'acquisizione giornaliera di immagini ad alta risoluzione delle aree della pelle posteriore di controllo e trattate in ciascun animale (ad esempio, utilizzando una telecamera HD accoppiata a un obiettivo binoculare 5-20x).</li>
	</ol></li>
	<li>Generazione e identificazione di LRC BrdU a lungo termine nell'epitelio della pelle della coda<ol><li>Iniettare compagni di cucciolata di 10/14 giorni per via intraperitoneale (senza anestesia) una volta al giorno per 4 giorni consecutivi con 50 mg/kg di peso corporeo di BrdU sciolto in PBS. Dopo la fase di etichettatura, lasciare crescere i topi per 50-60 giorni prima di qualsiasi trattamento. NOTA: Usi un ago nuovo per ogni iniezione.</li>
		<li>Procedere come descritto nel paragrafo 2.3 per l'induzione della produzione transitoria di ROS non letale in situ nella pelle della coda in momenti diversi prima della preparazione del tessuto intero.</li>
		<li>Per preparare interi monti di epidermide della coda, eutanasia topi per lussazione cervicale e tagliare le code con forbici chirurgiche.<ol><li>Usa un bisturi per fare un'incisione longitudinale dritta lungo tutta la coda e sbuccia l'intera pelle come un unico pezzo dalla spina dorsale. Incubare la pelle pelata in 5 mM EDTA in PBS in tubi da 5 mL per 4 ore a 37 °C e separare accuratamente i fogli intatti di epidermide dal derma usando una pinza.</li>
			<li>Fissare il tessuto in formaldeide al 4% in PBS per almeno 72 ore a temperatura ambiente (RT) e procedere per il rilevamento di BrdU utilizzando anticorpi appropriati.</li>
			<li>Utilizzare la microscopia a fluorescenza/confocale per identificare e quantificare le LRC in ogni condizione sperimentale, compresi i controlli della luce e i trattamenti fotodinamici in momenti diversi prima della preparazione del tessuto intero, come precedentemente descritto in dettaglio19,20. NOTA: I fogli epidermici fissi possono essere conservati in PBS contenenti azoturo di sodio allo 0,02% a 4 °C per un massimo di tre mesi. I fogli epidermici fissi possono essere utilizzati per l'immunolocalizzazione delle proteine richieste seguendo le procedure standard delle sezioni istologiche.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Induzione della produzione transitoria di livelli di ROS non letali nella pelle del topo
NOTA: Per indurre la produzione transitoria di livelli di ROS non letali nella pelle del topo, verrà utilizzato un trattamento fotodinamico utilizzando un precursore del fotosensibilizzatore endogeno PpIX, in questo caso, metil-amminolevulinato (mALA) e luce rossa.
<ol><li>Per attivare la produzione transitoria di ROS per l'induzione della crescita dei peli nella pelle posteriore, preparare gli animali come indicato nel paragrafo 1.1.<ol><li>Applicare ~ 25 mg di mALA sotto forma di crema topica (Table of Materials) sulla regione destra, mantenendo il lato sinistro come controllo interno evitando differenze interindividuali. Incubare per 2,5 ore al buio, lavare accuratamente la crema in eccesso con PBS. Per confermare la profondità dell'anestesia, monitorare gli animali ogni 10 minuti fino a completo recupero. NOTA: La produzione di PpIX nella pelle posteriore deve essere testata in situ mediante la sua fluorescenza rossa sotto eccitazione di luce blu (407 nm).</li>
		<li>Anestetizzare gli animali.</li>
		<li>Irradiare tutta la pelle della schiena con un'adeguata fonte di luce rossa (Table of Materials) per una dose totale di 2,5−4 J/cm2. Tenere i topi su una coperta elettrica fino al loro completo recupero e procedere come descritto al punto 1.1.3. NOTA: L'irraggiamento deve essere regolato manipolando la distanza tra la sorgente luminosa e il tessuto e misurato utilizzando un misuratore di energia (Tabella dei materiali). L'esperimento è considerato finito quando si osserva una crescita completa dei peli in una qualsiasi delle regioni rasate indipendenti di ciascun animale. L'intera procedura prevede un solo trattamento fotografico.</li>
	</ol></li>
	<li>Per attivare la produzione transitoria di ROS per il miglioramento della guarigione delle lesioni da ustione di 2° grado, preparare gli animali come indicato nella sezione 1.2.<ol><li>Applicare ~ 25 mg di mALA sotto forma di crema topica lungo tutta la superficie bruciata, comprendendo circa 4 mm di tessuto adiacente. Incubare per 2,5 ore al buio, lavare accuratamente la crema in eccesso con PBS. Per confermare la profondità dell'anestesia, monitorare gli animali ogni 10 minuti fino a completo recupero.</li>
		<li>Anestetizzare gli animali.</li>
		<li>Irradiare l'intera pelle della schiena con un'adeguata fonte di luce rossa per una dose totale di 2,5−4 J/cm2. Tenere i topi su una coperta elettrica fino al loro completo recupero e procedere come descritto al punto 1.2.4. NOTA: La procedura sperimentale per ciascun animale è considerata conclusa quando si osserva la completa guarigione delle ustioni. L'intera procedura prevede un solo trattamento fotografico.</li>
	</ol></li>
	<li>Per attivare la produzione transitoria di ROS nella pelle della coda, preparare i topi come indicato nel paragrafo 1.3, applicare ~25 mg di mALA sotto forma di crema topica lungo tutta l'area del tessuto dorsale e procedere come descritto nel paragrafo 2.1 per la pelle della schiena. Eseguire trattamenti fotografici e corrispondenti controlli della luce 24 ore, 48 ore o 72 ore prima dell'eutanasia animale e dell'ulteriore estrazione della pelle della coda intere montature. NOTA: In tutti i progetti sperimentali, analizzare la ROS-dipendenza del processo utilizzando scavenger antiossidanti ROS (ad esempio, inoculazione giornaliera di 100 mg/kg di peso corporeo N-acetil-cisteina mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione da 20 mg/ml in PBS, pH 7,2, iniziando 5 giorni prima dei trattamenti con mALA o, in alternativa, due dosi di 100 mg/ml di acido ascorbico in etanolo al 50%, distanziato di 30 minuti, applicato localmente sulla pelle nell'intervallo di tempo tra i trattamenti mALA e l'irradiazione a luce rossa).</li>
</ol>3. Rilevamento ROS nella pelle
<ol><li>Valutazione ex vivo della produzione di ROS nella pelle della coda dopo trattamento fotodinamico con idroetidina NOTA: L'idroetidina è una molecola non fluorescente che reagisce specificamente con i ROS per produrre colorante fluorescente 2-idrossietidio (hET).<ol><li>Incubare pelli intere della coda, ottenute come descritto al punto 1.3.3, per 3 ore a 37 °C in 5 mM di EDTA in soluzione PBS (campioni di controllo) o contenenti inoltre 2 mM di mALA (campioni di trattamento fotodinamico).</li>
		<li>In tutti i casi, aggiungere idroetidina a una concentrazione finale di 3,2 μM da uno stock di 25 mg/ml in dimetilsolfossido (DMSO) e incubare per 1 ora al buio a RT.</li>
		<li>Allungare i campioni di pelle della coda su una superficie di vetro usando la punta delle dita e irradiare con luce rossa a 636 nm con una fluenza di 10 J/cm2 .</li>
		<li>Procedere immediatamente a separare l'epidermide dal derma e a fissare i fogli epidermici come descritto al paragrafo 1.3.3.</li>
		<li>Valutare l'emissione rossa hET al microscopio a fluorescenza/confocale utilizzando la luce verde eccitante, acquisire immagini di alta qualità e procedere con ulteriori analisi. NOTA: Utilizzare la colorazione hET dei campioni di tessuto in assenza di trattamento fotodinamico come controllo negativo per l'autossidazione hET.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevamento in vivo della produzione di ROS nella pelle posteriore dopo induzione della crescita dei peli e guarigione delle ustioni seguita da trattamento fotodinamico NOTA: Questo passaggio viene eseguito utilizzando 2′,7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato (DHF-DA), un composto non fluorescente permeato da cellule che, dopo la scissione da parte degli enzimi esterasi intracellulari, reagisce specificamente con i ROS dando il colorante fluorescente 2′,7′-diclorofluoresceina (DCF).<ol><li>Utilizzare animali preparati per l'induzione della crescita dei peli (paragrafo 1.1) o la guarigione delle ustioni (paragrafo 1.2). Appena prima dei trattamenti topici con mALA crema (vedere paragrafi 2.1 e 2.2), erogare localmente 100 μL di 1 mg/ml in etanolo al 50% di DHF-DA su tutte le aree cutanee di controllo target/trattate, lasciare che la pelle assorba completamente il materiale e procedere con l'applicazione topica della crema mALA.</li>
		<li>Incubare gli animali trattati per 4 ore al buio, lavare accuratamente la crema topica mALA dalla pelle con PBS e dispensare una seconda dose di 100 μL di soluzione di DHF-DA sulla pelle. Per confermare la profondità dell'anestesia, monitorare gli animali ogni 10 minuti fino a completo recupero.</li>
		<li>Incubare gli animali trattati per 50 minuti al buio, anestetizzare e irradiare tutta la pelle della schiena con una fluenza che va da 2,5 a 4 J/cm2 di luce rossa a 636 nm utilizzando una lampada a LED.</li>
		<li>Immediatamente dopo l'irradiazione, valutare i livelli di ROS generati nella pelle utilizzando un sistema di imaging in vivo (Table of Materials). Impostare la scatola del filtro per l'eccitazione a 445-490 nm e l'emissione di 515-575 nm, acquisire immagini di alta qualità e procedere con ulteriori analisi. NOTA: Utilizzare la colorazione DHF-DA dei campioni di tessuto in assenza di trattamento fotodinamico come controllo negativo per l'autossidazione DHF-DA.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Blázquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+1O2+optical+excitation%3A+A+tool+for+redox+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology.</a> Redox Biology. 13, 39-59 (2017).</li>
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<li>Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+Regulation+of+Reactive+Oxygen+Species+Generation+by+Nox+Family+NADPH+Oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).</li>
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<li>Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+stress+and+signaling+during+vertebrate+embryonic+development%3A+Regulation+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).</li>
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<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li>
<li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+Neural+Stem+Cells+Have+High+Endogenous+ROS+Levels+that+Regulate+Self-Renewal+and+Neurogenesis+in+a+PI3K%2FAkt-Dependant+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li>
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<li>Carrasco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+of+ROS+Production+in+situ+Transiently+Activates+Cell+Proliferation+in+Mouse+Skin+and+in+the+hair+Follicle+Stem+Cell+Niche+Promoting+Hair+Growth+and+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).</li>
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</ol>

Tutte le applicazioni commerciali delle procedure descritte in questo lavoro sono protette da un brevetto CSIC-UAM (EP2932967A1) redatto da EC, MIC e JE e concesso in licenza a Derma Innovate SL per lo sfruttamento commerciale. JE e JJM hanno una posizione di consulenza in Derma Innovate SL.

Qui presentiamo una metodologia che consente un'attivazione transitoria della produzione endogena di ROS in vivo nella pelle di topo con effetti fisiologici. La metodologia si basa su una procedura fotodinamica per indurre una stimolazione controllata e locale del fotosensibilizzatore endogeno PpIX (Figura 1B). Questo approccio sperimentale è uno strumento interessante per studiare la biologia dei ROS in sistemi sperimentali in vivo che costituiscono un progresso significativo rispetto alle ...

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono il risultato della riduzione chimica dell'ossigeno molecolare per formare acqua e includono ossigeno singoletto, anione superossido, perossido di idrogeno e il radicale ossidrile 1,2,3. I ROS hanno una durata molto breve a causa della loro natura estremamente reattiva chimica. Negli organismi aerobici, i ROS si formano incidentalmente all'interno delle cellule come un importante sottoprodotto della respirazione aerobica (catena di trasporto degli elettroni) nei mitocondri. L'accumulo transitorio di alti livelli di ROS nella cellula provoca una condizione di stress ossidativo che può provocare l'inattivazione irreversibile di proteine, lipidi e zuccheri e l'introduzione di mutazioni nella molecola di DNA 2,3,4,5. Il graduale accumulo di danno ossidativo nelle cellule, nei tessuti e negli organismi interi aumenta costantemente con il tempo ed è stato associato all'induzione di programmi di morte cellulare, diverse patologie e il processo di invecchiamento 2,3,4,6.
Gli organismi aerobici hanno costantemente sviluppato meccanismi molecolari efficienti per affrontare l'accumulo di ROS in eccesso nelle cellule e nei tessuti. Questi meccanismi includono membri della famiglia delle proteine superossido dismutasi (SOD), che catalizzano la dismutazione radicalica del superossido in ossigeno molecolare e perossido di idrogeno, nonché diverse catalasi e perossidasi che utilizzano il pool antiossidante (glutatione, NADPH, perossiredossina, tioredossina 7,8) per catalizzare la successiva conversione del perossido di idrogeno in acqua e ossigeno molecolare.
Tuttavia, diversi rapporti supportano il ruolo dei ROS come componenti chiave dei circuiti molecolari che regolano le funzioni cellulari critiche, tra cui proliferazione, differenziazione e mobilità 2,3,4. Questo concetto è ulteriormente supportato dall'identificazione iniziale e dalla caratterizzazione di meccanismi dedicati che producono ROS in organismi aerobici, tra cui le lipossigenasi cicloossigenasi e le NADPH ossidasi 9,10. In questo senso, i ROS mostrano un ruolo attivo durante lo sviluppo embrionale dei vertebrati 11,12,13 e ruoli chiave per queste molecole nella regolazione di specifiche funzioni fisiologiche in vivo sono stati riportati in diversi sistemi sperimentali, tra cui il programma di differenziazione dei progenitori ematopoietici in Drosophila14, l'induzione di guarigione nel pesce zebra o la rigenerazione della coda nei girini di Xenopus 15. Nei mammiferi, i ROS sono stati coinvolti nel potenziale di auto-rinnovamento/differenziazione delle cellule staminali neurali in un modello di neurosfera16 e nella deregolazione della funzione delle cellule staminali intestinali durante l'inizio del cancro del colon-retto17. Nella pelle, la segnalazione dei ROS è stata associata alla differenziazione epidermica e alla regolazione della nicchia delle cellule staminali cutanee e del ciclo di crescita del follicolo pilifero18,19.
In questa prospettiva, una delle principali limitazioni sperimentali per determinare i ruoli fisiologici dei ROS nei sistemi biologici, sia in condizioni normali che patologiche, è la mancanza di adeguati strumenti sperimentali per indurre una produzione controllata di queste molecole in cellule e tessuti, assomigliando accuratamente alla loro produzione fisiologica come messaggeri di seconda segnalazione. Allo stato attuale, la maggior parte degli approcci sperimentali prevede la somministrazione di ROS esogeni, principalmente sotto forma di perossido di idrogeno. Abbiamo recentemente implementato un approccio sperimentale per attivare una produzione transitoria e non letale in vivo di ROS endogeni nella pelle del topo, basato sulla somministrazione di precursori del fotosensibilizzatore endogeno protoporfirina IX (PpIX; ad esempio, acido aminolaevulinico o il suo derivato metilamminolevulinato) e ulteriore irradiazione del campione con luce rossa per indurre la formazione in situ di ROS dall'ossigeno molecolare intracellulare (Figura 1). Questa procedura fotodinamica può essere efficacemente utilizzata per stimolare nicchie di cellule staminali residenti, attivando così i programmi rigenerativi del tessuto19,20 e aprendo la strada a nuove modalità terapeutiche nella medicina rigenerativa cutanea. Qui, presentiamo una descrizione dettagliata del protocollo, mostrando esempi rappresentativi di stimolazione di nicchie di cellule staminali, misurata come un aumento del numero di cellule di mantenimento dell'etichetta (LRC) a lungo termine di 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) nella regione del rigonfiamento del follicolo pilifero19,21 e successiva attivazione di programmi di rigenerazione (accelerazione della crescita dei capelli e processi di guarigione delle ustioni) indotti da transitori, produzione non letale di ROS nella cute del ceppo di topo C57Bl6.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-diclorofluorescina diacetato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>5'-bromo-2'-deossiuridina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5002-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bromodeossiuridina-Fluoresceina</td><td>Roche</td><td>11202693001</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria (ad es. Veet)</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diidroetidio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging in vivo, ad es. IVIS Lumina 2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mALA sotto forma di crema topica, ad es. METVIX Crema 160 mg/g</td><td>Galderma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power misuratore di energia (ad es. ThorLabs modello PM100D)</td>Sorgente di luce rossa <td>ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, ad es. lampada LED Aktilite da 636 nm</td><td>Photocure ASA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stimolazione di nicchie di cellule staminali e rigenerazione tissutale nella pelle di topo mediante fotogenerazione commutabile protoporfirina ix-dipendente di specie reattive dell'ossigeno in situ

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Qui, descriviamo un protocollo per indurre la fotogenerazione commutabile in vivo di specie reattive dell'ossigeno endogene (ROS) nella pelle del topo. Questa produzione transitoria di ROS in situ attiva in modo efficiente la proliferazione cellulare nelle nicchie delle cellule staminali e stimola la rigenerazione dei tessuti come fortemente manifestato attraverso l'accelerazione della guarigione delle ustioni e dei processi di crescita del follicolo pilifero. Il protocollo si basa su un trattamento fotodinamico regolabile che tratta il tessuto con precursori del fotosensibilizzatore endogeno protoporfirina IX e irradia ulteriormente il tessuto con luce rossa sotto parametri fisico-chimici strettamente controllati. Nel complesso, questo protocollo costituisce un interessante strumento sperimentale per analizzare la biologia dei ROS.

La somministrazione topica del precursore mALA nella pelle della schiena e della coda del topo provoca un accumulo significativo di PpIX nell'intero tessuto e, notevolmente, nel follicolo pilifero, come dimostrato dalla fluorescenza rosa-rossastra di questo composto sotto eccitazione di luce blu (407 nm) (Figura 2A,C). La successiva irradiazione del tessuto trattato con luce rossa (636 nm) ad una fluenza di 2,5−4 J/cm 2 promuove la produzione transitoria di ROS ne...

Lo scopo di questo protocollo è quello di indurre la produzione transitoria in vivo di livelli non letali di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella pelle del topo, promuovendo ulteriormente le risposte fisiologiche nel tessuto.

Stimolazione di nicchie di cellule staminali e rigenerazione tissutale nella pelle di topo mediante fotogenerazione commutabile protoporfirina IX-dipendente di specie reattive dell'ossigeno in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

La nostra metodologia è la prima a fornire uno strumento sperimentale affidabile per indurre un'attivazione transitoria di una specie reattiva endogena dell'ossigeno o la produzione di ROS in un tessuto in vivo. La nostra metodologia fornisce una procedura robusta, facile da usare e non invasiva che produce una produzione costante di livelli fisiologici stimolanti di ROS nella pelle utilizzando fondamentalmente una fonte di luce rossa. Poiché l'induzione fisiologica dei ROS nella pelle soddisfa le esigenze staminali dei tessuti, abbiamo ulteriormente applicato la nostra metodologia per la terapia di rigenerazione della pelle, compresa una buona guarigione e la crescita dei capelli.La biologia e la segnalazione dei ROS sono attualmente oggetto di ricerca intensiva. Uno dei principali limiti per studiare la funzione dei ROS in vivo è la mancanza di strumenti adeguati per indurre una produzione endogena controllata di ROS. La NOSTRA metodologia è facile e facile da usare, ma tutti i dispositivi, lampade, flebo, IS, eccetera, devono essere adeguatamente calibrati.I precursori chimici critici devono essere freschi e tutti i passaggi o il protocollo devono essere seguiti rigorosamente. Per indurre la crescita dei peli sulla pelle dorsale dei topi nella seconda fase telogen, dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale in circa 50 giorni di cucciolata postnatale C57 black six mouse, utilizzare un rasoio e una crema depilatoria per rimuovere due regioni di pelle affiancate indipendenti dalla parte posteriore di ciascun topo. Dopo qualche minuto, rimuovere la crema con PBS e registrare la crescita del follicolo pilifero attraverso l'acquisizione quotidiana di immagini ad alta risoluzione delle aree cutanee dorsali di controllo e trattate di ogni animale.Per indurre la generazione di ustioni di secondo grado sulla pelle dorsale dei topi nella seconda fase telogen, rimuovere i peli dalla parte posteriore del topo. Preriscaldare una barra di ottone di un centimetro a 95 gradi Celsius in acqua bollente e applicare la barra sulla regione centrale della pelle del topo per cinque secondi. Immediatamente dopo la generazione dell'ustione, iniettare intraperitonealmente agli animali un millilitro di soluzione fisiologica per prevenire la disidratazione e consentire ai topi di riprendersi per 24 ore prima di procedere al trattamento.Per la generazione di cellule di ritenzione marcate con BrdU o LRC, iniettare compagni di cucciolata di 10 o 14 giorni per via intraperitoneale una volta al giorno per quattro giorni consecutivi con 50 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo di BrdU in PBS. Dopo la fase di marcatura, lasciare che i topi si sviluppino per 50-60 giorni prima di applicare il trattamento. Per indurre la produzione transitoria di specie reattive dell'ossigeno non letali o livelli di ROS nella pelle del topo per un'analisi della crescita dei capelli, dopo aver acquisito un'immagine di crescita dei peli di base, applicare localmente circa 25 milligrammi di crema mALA sulla regione destra della pelle rasata e porre l'animale al buio per 2,5 ore.Al termine del periodo di trattamento con fotosensibilizzante, rimuovere accuratamente l'eccesso di crema con PBS e confermare la produzione di PP9 in situ mediante espressione di fluorescenza rossa sotto eccitazione con luce blu, quindi irradiare l'intera pelle posteriore con un'adeguata fonte di luce rossa per una dose totale da 2,5 a 4 joule per centimetro quadrato. Quindi lasciare che i topi si riprendano su una coperta elettrica con monitoraggio fino alla completa decubito prima di riportare gli animali nelle loro gabbie. Per attivare la produzione transitoria di ROS per la guarigione delle ustioni di secondo grado, applicare circa 25 milligrammi di crema mALA lungo la superficie destra dell'ustione e circa quattro millimetri di tessuto adiacente e porre gli animali al buio per 2,5 ore come dimostrato.Dopo aver rimosso la crema, irradiare tutta la pelle della schiena e lasciare che i topi si riprendano con il monitoraggio come dimostrato. Per indurre la produzione transitoria di ROS nella pelle della coda, applicare circa 25 milligrammi di crema mALA lungo tutta l'area del tessuto dorsale dei topi trattati con BrdU e irradiare la pelle dorsale della coda come dimostrato. Dopo l'eutanasia dei topi, raccogli la pelle della coda per il rilevamento di BrdU.Usa un bisturi per raccogliere la coda da ogni animale, quindi fai incisioni longitudinali diritte e sbuccia l'intera pelle come un unico pezzo dalla spina dorsale. Incubare i pezzi di pelle sbucciati in cinque millimolari EDTA e PBS e provette da cinque millilitri per quattro ore a 37 gradi Celsius per consentire l'attenta separazione dei fogli intatti di epidermide dal derma con una pinza. Fissare i tessuti separati in formaldeide al 4% e PBS per almeno 72 ore a temperatura ambiente.Quindi etichettare i tessuti fissati con gli anticorpi coniugati a fluorescenza di interesse prima di visualizzare i tessuti mediante microscopia confocale a fluorescenza secondo protocolli standard per identificare e quantificare le LRC in ciascuna condizione sperimentale. Per la valutazione ex vivo della produzione di ROS, dopo aver raccolto pezzi di pelle di coda di topo come dimostrato, incubare i tessuti di controllo non trattati e cinque millimolari EDTA e PBS da soli e i campioni di trattamento fotodinamico in EDTA integrati con due mALA millimolari. Successivamente, aggiungere l'idroetidina a una concentrazione finale di 3,2 micromolari in ciascun set di tessuti e incubare tutti i campioni per un'ora a temperatura ambiente al buio.Al termine dell'incubazione, utilizzare la punta delle dita per stendere i campioni di pelle della coda su una superficie di vetro e irradiare i tessuti trattati con 636 nanometri di luce rossa a una fluenza di 10 joule per centimetro quadrato. Al termine del trattamento, separare immediatamente l'epidermide dal derma e fissare i fogli epidermici in formaldeide al 4% e PBS per almeno 72 ore a temperatura ambiente. Al termine della fissazione, valutare l'emissione di 2-idrossietidio rosso mediante microscopia a fluorescenza utilizzando la luce verde eccitante per consentire l'acquisizione di immagini di alta qualità.Per il rilevamento in vivo della produzione di ROS nella pelle dorsale, subito dopo l'irradiazione con luce rossa, applicare 100 microlitri di un milligrammo per millilitro di DH-FDA e il 50% di etanolo su tutte le aree cutanee di controllo e trattate. La somministrazione topica del precursore mALA sul dorso e sulla pelle della coda del topo provoca un significativo accumulo di protoporfirina IX nell'intero tessuto e notevolmente nel follicolo pilifero, come dimostrato dalla fluorescenza rosa rossastra di questo composto sotto eccitazione con luce blu. La successiva irradiazione del tessuto trattato con luce rossa favorisce la produzione transitoria di ROS all'interno del tessuto, in particolare nella regione di rigonfiamento del follicolo pilifero.L'attivazione della produzione di ROS non letali nella pelle di topo in vivo promuove un aumento significativo del numero di LRC nella regione di rigonfiamento del follicolo pilifero due giorni dopo il trattamento fotodinamico. In particolare, l'aumento del numero di LRC è transitorio, ripristinando i livelli normali sei giorni dopo il trattamento. La produzione transitoria di ROS accelera la guarigione della pelle dopo un'ustione di secondo grado.La quantificazione della graduale riduzione della cute danneggiata dimostra la robustezza e la significatività statistica del tessuto del processo di accelerazione della guarigione delle ferite. Allo stesso modo, i livelli di ROS non letali promuovono fortemente la crescita dei peli dopo la rasatura durante il secondo telogen coordinato, una fase durante la quale il follicolo pilifero è refrattario a rispondere agli stimoli di crescita. Inoltre, la produzione di ROS dopo i fototrattamenti è significativamente ridotta dall'applicazione di composti antiossidanti.La produzione di PP IX in situ mediante espressione fluorescente rossa sotto eccitazione di luce blu deve essere accuratamente confermata. Per indurre la produzione di ROS, l'irraggiamento della sorgente di luce rossa deve essere stabilito correttamente. rispetto ai tessuti e alla dose totale di luce.Dopo l'induzione dei ROS, le attuali tecniche biochimiche e di biologia cellulare e molecolare possono essere utilizzate per analizzare i campioni raccolti e valutare la risposta fisiologica dinamica del tessuto. La nostra metodologia fornisce un potente strumento per studiare l'effetto fisiologico di una produzione transitoria di ROS endogeni in un tessuto in vivo. Si tratta di un nuovo approccio sperimentale che può essere molto utile per i ricercatori nel campo della segnalazione dei ROS.

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Stimolazione di nicchie di cellule staminali e rigenerazione tissutale nella pelle di topo mediante fotogenerazione commutabile protoporfirina IX-dipendente di specie reattive dellossigeno in situ (Video) | JoVE Journal

Stimolazione di nicchie di cellule staminali e rigenerazione tissutale nella pelle di topo mediante fotogenerazione commutabile protoporfirina IX-dipendente di specie reattive dell'ossigeno in situ

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