Pannello LC-MS/MS convalidato per quantificare 11 farmaci TB resistenti ai farmaci in piccoli campioni di capelli

L'aderenza del paziente è molto impegnativa e il metabolismo dei farmaci può variare da persona a persona, quindi la misurazione oggettiva dei livelli di farmaco può rivelarsi importante per prevenire l'emergere di resistenza durante il trattamento con TBC. Se l'aderenza potesse essere quantificata in modo più accurato e semplice, gli operatori sanitari potrebbero sviluppare un piano di trattamento che limiterebbe lo sviluppo della resistenza ai farmaci. Abbiamo sviluppato il primo pannello di spettrometria di massa a base di aliti multipli per più farmaci tb all'interno di piccoli campioni di capelli in un unico test.

Il nostro pannello multi-farmaco richiede solo un campione di due milligrammi per paziente e non utilizza né l'estrazione in fase solida né la fase di filtraggio per prevenire qualsiasi perdita di volume del campione. Misure oggettive di esposizione ai farmaci misurate all'inizio del corso di trattamento potrebbero potenzialmente avvisare i medici di problemi con i singoli farmaci nel regime di trattamento. I campioni di capelli devono essere polverizzati il giorno dell'analisi per una misurazione accurata del livello di concentrazione del farmaco.

Per acquisire campioni di capelli, dopo aver ottenuto il consenso informato scritto, prepara i materiali tra cui un'etichetta sottile, due etichette dei partecipanti, un paio di forbici, un pezzo di foglio di alluminio aperto, una salvietta alcolica e un sacchetto di plastica. Pulire le lame delle forbici con una salvietta alcolica. Vai nella parte posteriore della testa e solleva la parte superiore dei capelli usando una clip per capelli, se lo desideri.

Raccogli 30 ciocche di capelli dalla parte posteriore della testa e isola la paglia con la mano. Prendi le forbici fino al cuoio capelluto e taglia la paglia di capelli. Posizionare con cura la paglia di capelli sul foglio di alluminio.

Mettere l'etichetta sottile sull'estremità distale della paglia di capelli, toccandolo saldamente sul foglio di alluminio. L'estremità distale è il lato più lontano dal cuoio capelluto. Piegare sopra il pezzo di foglio di alluminio sopra la paglia dei capelli e mettere un'etichetta partecipante sopra il foglio di alluminio.

Posizionare il pezzo piegato di foglio di alluminio nel sacchetto di plastica e mettere un'altra etichetta partecipante sopra il sacchetto di plastica. Per l'estrazione del farmaco dai campioni di capelli, pesare due milligrammi di ogni campione di capelli in tubi di perline etichettati individualmente e due milligrammi del campione di capelli vuoti in ciascuno dei 16 tubi di perline aggiuntivi. Dopo la pesatura, posizionare tutti i tubi di perline in un omogeneizzatore di mulino perline e omogeneizzare i campioni ad una velocità di 6,95 metri al secondo per due cicli di 30 secondi con un periodo di riposo di 15 secondi tra ogni ciclo.

Dopo la seconda omogeneizzazione, aggiungere 500 microlitri dell'apposita miscela standard interna a ciascun campione e aggiungere 500 microlitri di metanolo al tubo bianco della matrice. Aumentare i tubi della curva di taratura con il volume appropriato della miscela standard di riferimento in base al tavolo e posizionare tutti i tubi in un bagno d'acqua di 37 gradi con tremori delicati per due ore. Al termine dell'incubazione, trasferire il supernatante da ciascun tubo di perline in nuovi tubi di microcentrifugo etichettati e aggiungere 500 microlitri di metanolo ai tubi di perline.

Vortice i tubi di perline e trasferire il lavaggio del metanolo ai corrispondenti tubi di microcentrifugo. Centrifugare i campioni e trasferire accuratamente i soprintenti in nuovi tubi senza disturbare i pellet di capelli. Evaporare il liquido nei tubi a secco a 32 gradi Celsius e ricostituire i campioni con 200 microlitri di acqua di grado cromatografico liquido ad alta pressione con acido formico dell'1%.

Dopo il vortice, trasferire i campioni di liquido su flaconcini ambrati con inserti da 250 microliter. Per la spettrometria di massa tandem della cromatografia liquida, installare prima una colonna da due a 100 millimetri con una dimensione delle particelle di 2,5 micrometri e una dimensione del poro di 100 angstrom con perline fenolo eterocolte polari-endcapped completamente fatte di silice porosa nel compartimento delle colonne. Verificare che nella colonna sia installata anche una cartuccia di protezione consigliata dal produttore.

Copiare e incollare le informazioni composte incluse nelle transizioni del metodo LCMS MDR-TB. csv nella casella nella finestra delle specifiche di massa. In un foglio di calcolo creare una sequenza batch della curva di calibrazione, dei controlli di qualità, dei campioni dei pazienti, della curva di calibrazione, dei controlli di qualità, dei campioni dei pazienti, della curva di calibrazione e dei controlli di qualità.

Aggiungere iniezioni vuote di solvente all'inizio e alla fine della corsa, nonché prima e dopo la curva di calibrazione, i controlli di qualità e i campioni del paziente. Quindi posizionare almeno otto iniezioni di liquido grezzo solvente nelle iniezioni nella curva di taratura e nel flaconcino di controllo di alta qualità per ridurre il riporto dell'anale. Al termine dei lotti, aprire il software di quantificazione.

Scorrere le transizioni per assicurarsi che il tempo di conservazione selezionato automaticamente sia accurato e verificare che la smussatura gaussiana sia impostata su 1,5. Quindi, fare clic su visualizza la curva di calibrazione e la regressione e impostare il tipo in attesa su uno su x. Fare clic su OK e convalidare la curva di calibrazione e i campioni di controllo qualità per assicurarsi che il batch sia stato eseguito correttamente.

Per ogni alita di riferimento del quantificatore, almeno due terzi dei punti di calibrazione devono avere una precisione entro l'80-120%Verificare che il valore R visualizzato sopra la curva di calibrazione sia maggiore di 0,975. Se tutte le condizioni di cui sopra sono soddisfatte, il lotto è passato e i campioni possono essere quantificati. Fare clic su Modifica sulla barra degli strumenti e quindi su Copia intera tabella.

Quindi incollare la tabella in un foglio di calcolo e utilizzare la media della concentrazione calcolata delle due iniezioni di campione per determinare la concentrazione riportata di ciascun campione. Qui viene mostrata un'illustrazione di un cromatogramma con livelli confermati di tutti gli 11 farmaci tb resistenti ai farmaci testati. In queste cifre, si possono osservare i cromatogrammi di ioni estratti per un particolare farmaco in uno dei calibratori.

Le transizioni quantificatore e qualificatore vengono utilizzate per confermare qualitativamente la presenza del farmaco poiché il rapporto tra l'area del quantificatore e l'area del qualificatore rimane la costante tra i campioni. Lo standard interno è anche monitorato per garantire che ogni iniezione di campione sia normalizzata. In questa analisi, un comodo campione di 15 campioni di capelli su una popolazione di studio totale di 96 pazienti che assumono farmaci resistenti alla TBC resistenti ai farmaci in condizioni terapeutiche osservate direttamente da Western Cape, in Sudafrica, è stato valutato per determinare i livelli rappresentativi di farmaci per la TBC resistenti ai farmaci attraverso i livelli più bassi e più alti per ogni analeta.

In assenza di una fase solida di estrazione o filtraggio, fare attenzione quando si trasferisce il supernatante nei tubi di evaporazione. Tutto ciò che viene trasferito nei tubi può finire iniettato nella colonna. Poiché il rotore del raptor perline può volare via se non strettamente avvitato o bloccato, assicurarsi di ricontrollare il rotore prima di funzionare.

A differenza degli antiretrovirali nel campo dell'HIV, la relazione tra farmacocinetica da TB, aderenza ed esiti clinici rimane in gran parte non studiata. Abbiamo ipotizzato che alcuni farmaci per la tubercolosi non si accumulino bene nei capelli. Prendere di mira i metaboliti di questi farmaci può fornire una migliore comprensione dell'aderenza del paziente.