Due diversi paradigmi di preferenza posto in tempo reale utilizzando l'optogenetica all'interno dell'area tegmentale ventrale del mouse
February 12th, 2020
Qui presentiamo due protocolli passo-passo facili da seguire per i paradigmi delle preferenze dei piazzamenti usando l'optogenetica nei topi. Utilizzando queste due diverse configurazioni, i comportamenti di preferenza ed elusione possono essere valutati saldamente all'interno dello stesso apparato con elevata selettività spaziale e temporale, e in modo semplice.
Qui forniamo un protocollo dettagliato per valutare le proprietà gratificanti o avverse della stimolazione genetica di una specifica regione cerebrale. La tecnica può rispondere rapidamente se la stimolazione di cellule specifiche è gratificante o avversa. Descriviamo l'impostazione per stimolare l'area tegmentale ventrale, ma i nostri protocolli possono essere facilmente adattati per modificare parametri specifici in termini di diverse regioni studiate.
Per iniziare, utilizzare microcontrollori a scheda singola per controllare la sorgente laser. Caricare lo script sulla scheda del microcontroller utilizzando il cavo di connessione appropriato al computer. Lo script include la modulazione esterna proveniente dal software di tracciamento attraverso una scatola TTL e un'uscita al laser per controllare i parametri di stimolazione.
Utilizzare un cavo di rete per collegare la casella TTL alla scheda. Assicurarsi che il laser sia impostato per il controllo tramite modulazione esterna e collegare il laser alla scheda utilizzando un cavo FC/PC. Collegare i perni appropriati alle parti di terra della scheda.
Per collegare la sorgente laser alla fibra ottica, collegare prima la sorgente laser a un giunto rotante. Collegare un cavo patch al giunto rotante. Stabilizzare il giunto rotante sopra l'apparecchio, ma all'esterno dell'area di registrazione.
Assicurarsi che la lunghezza del cavo patch in fibra ottica sia appropriata per consentire al mouse di muoversi senza difficoltà nell'arena. Per calibrare la configurazione dell'arena, usate un righello per misurare una parte specifica dell'apparato fisico. Nel software, tracciare una linea corrispondente alla parte misurata.
Nella scheda Disegna scala da calibrare immettere il valore già noto. Progetta l'arena, disegna l'area in cui verrà registrato il movimento dei topi. Create le zone, disegnate le zone che alla fine verranno assegnate come accoppiate al laser, spaiate al laser e neutre.
Premere il pulsante Convalida installazione per convalidare l'impostazione per verificare che non vi siano parametri in conflitto, ad esempio zone esterne all'arena. Assicurarsi che il controllo hardware sia abilitato e impostare l'ora dell'esperimento su 30 minuti sull'opzione ripeti fino alle impostazioni della casella di riferimento. Assegnare uno scomparto come associato al laser, in cui l'ingresso del mouse attiverà un segnale TTL attraverso il software di tracciamento alla scheda del microcontroller sotto le impostazioni delle condizioni.
Per modificare la configurazione per l'approccio delle preferenze del compartimento neutro, dopo l'impostazione dell'arena e dell'ora, assegnate entrambe le zone A e B come accoppiate al laser aggiungendo quando il punto centrale si trova in una qualsiasi delle zone A e B per la casella delle condizioni relativa alle impostazioni per i compartimenti A e B. Per impostare le impostazioni di rilevamento, utilizzare un manichino simile al mouse. Posizionare il manichino in un compartimento dell'apparecchio e utilizzare la configurazione automatizzata con sottrazione dinamica.
Rimuovere il manichino e posizionarlo nello scomparto opposto. Assicurarsi che il manichino sia completamente rilevato. Posizionare il manichino nel vano accoppiato al laser.
Per verificare se la stimolazione funziona, inizia l'acquisizione utilizzando le impostazioni di controllo di prova configurate in precedenza e vedi se la stimolazione viene attivata come dovrebbe. Quindi posizionare il manichino nello scomparto spaiato o neutro e vedere se la stimolazione è interrotta. Utilizzare la manopola sul laser per impostare la potenza del laser su 10 milliwatt.
Collegare l'impianto in fibra ottica al cavo patch in fibra ottica utilizzando un manicotto in ceramica e posizionare il mouse nel vano neutro dell'apparato a tre scomparti. Attendere che il mouse sia rilevato dal software. Rimuovere le porte scorrevoli verticali che limitano l'ingresso dell'animale nei compartimenti principali.
Consenti all'animale di esplorare liberamente senza disturbi. L'intero esperimento di preferenza del luogo in tempo reale si svolge durante otto sessioni. I topi DAT-Cre iniettati con il virus EYFP della channelrhodopsina AAV nell'area tegmentale ventrale sono stati testati per colpire i neuroni dopaminergici.
I topi hanno trascorso in media circa il 70% del loro tempo nel compartimento accoppiato al laser, a differenza del compartimento spaiato al 20% e del compartimento neutro al 10%È stato osservato un fenotipo comportamentale opposto con topi Vglut2-Cre iniettati con AAV channelrhodopsin EYFP nell'area tegmentale ventrale. I topi hanno evitato il compartimento abbinato alla stimolazione e hanno trascorso più tempo nello spaiato. Durante i giorni di risposte condizionate cinque e otto, i topi non hanno mostrato una chiara elusione del compartimento precedentemente accoppiato.
Per dimostrare ulteriormente il ruolo gratificante o avverso di specifici neuroni, il metodo descritto può essere complimentato con altri metodi come i paradigmi operoni o la sottostimolazione fotogenetica. Prestare attenzione durante la gestione dei virus e quando si utilizzano sorgenti laser.
Panoramica
Questo articolo presenta due protocolli per paradigmi di preferenza del luogo utilizzando l'optogenetica nei topi, consentendo la valutazione dei comportamenti di preferenza ed evitamento con alta selettività spaziale e temporale.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Analisi comportamentale
- Optogenetica
Sfondo
- Comprendere le proprietà gratificanti e avverse della stimolazione cerebrale è cruciale nella neuroscienza.
- L'optogenetica consente un controllo preciso dell'attività neuronale.
- I paradigmi di preferenza del luogo sono comunemente usati per valutare le risposte comportamentali agli stimoli.
- Questo studio si concentra sull'area tegmentale ventrale e il suo ruolo nell'elaborazione della ricompensa.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare protocolli per valutare gli effetti della stimolazione optogenetica sul comportamento del topo.
- Valutare come la stimolazione neuronale specifica influenza la preferenza e l'evitamento.
- Fornire una configurazione flessibile che può essere adattata per diverse regioni cerebrali.
Metodi utilizzati
- Utilizzo di microcontroller a scheda singola per controllare la stimolazione laser.
- Calibrazione dell'arena sperimentale per un tracciamento accurato dei movimenti del topo.
- Implementazione di segnali TTL per sincronizzare la stimolazione con il comportamento del topo.
- Valutazione delle risposte comportamentali in più sessioni con diversi genotipi di topo.
Principali risultati
- I topi DAT-Cre hanno mostrato una preferenza per il compartimento associato al laser, trascorrendo il 70% del loro tempo lì.
- I topi Vglut2-Cre hanno mostrato l'evitamento del compartimento associato al laser.
- Le risposte comportamentali variavano in diversi giorni di test.
- Il metodo può essere integrato con altre tecniche per ulteriori convalide.
Conclusioni
- I protocolli forniscono un metodo affidabile per studiare gli effetti della stimolazione neuronale specifica sul comportamento.
- I risultati indicano fenotipi comportamentali distinti basati sul background genetico.
- Ulteriori ricerche possono espandersi su questi risultati utilizzando metodologie aggiuntive.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Assessing the rewarding or aversive properties of neuronal stimulation is critical for target validation in neuroscience-driven drug discovery. Real-time place preference paradigms enable rapid, causal interrogation of specific neural circuits, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. This approach provides quantitative behavioral readouts that inform go/no-go decisions in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables causal testing of whether stimulation of a defined neuronal population produces reward or aversion phenotypes.
- Operational Value: Provides real-time, quantitative behavioral readouts with high temporal resolution to support hypothesis interrogation.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking neuronal activation to measurable behavioral outputs relevant to neuropsychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized, reproducible behavioral assay for screening neuromodulatory targets using optogenetic stimulation.
- Quantitative Output: Generates time-in-compartment metrics that serve as dependent variables for evaluating stimulation effects across genotypes or conditions.
- Scalability: Protocol can be adapted to different brain regions and stimulation parameters, enabling cross-target screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Ventral tegmental area stimulation models mesolimbic pathway function, relevant to reward-related disorders and addiction therapeutics.
- Translational Continuity: Real-time behavioral readouts bridge acute neuromodulation studies with longer-term conditioned place preference assessments.
- Mechanistic De-risking: Helps distinguish direct neuronal effects from compensatory network responses, reducing ambiguity in target mechanism.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where circuit-level target validation precedes lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining if optogenetic activation of specific neurons drives reward or aversion behaviors.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for evaluating neuromodulatory targets across different genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables (time spent in laser-paired, unpaired, neutral compartments) for statistical comparison of stimulation effects.
- Translational Research: Connects acute neuronal stimulation effects to behavioral phenotypes with relevance to preclinical models of reward processing.
- Enterprise Reuse: Framework can be standardized across labs and adapted to various brain regions, promoting platform-level reuse in neuroscience discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers mechanistic insight into neuronal causality, reducing false positives in target selection.
- Operational Value: Enables high-throughput behavioral assessment with automated tracking and real-time stimulation control.
- Strategic Value: Improves confidence in target modulation strategies, supporting better resource allocation in early discovery.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on behavioral validation of circuit-specific effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, viral vector delivery, and stereotaxic surgery for precise neuronal targeting.
- Depends on integrated hardware including microcontrollers, lasers, rotary joints, fiber optics, and behavioral tracking software.
- Necessitates cross-team standardization between neuroscience, engineering, and data analysis groups for consistent setup and calibration.
- Must account for variability in opsin expression, fiber placement, and laser power delivery across subjects.
- Limited to acute behavioral effects; does not assess chronic adaptation or compensatory mechanisms without complementary longitudinal studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Setting up the Control of the Laser Source
1:44
Setting Up the Experiment for the RT-PP (Real-Time Place Preference) Approach and NCP (Neutral Compartment Preference) Approach
3:13
Performing an Experiment Using Laser Stimulation
4:24
Results: Real-Time Place Preference Experiment
5:18
Conclusion
