Name: Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Impara l'assay di opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo di vaccini contro Bacillus anthracis. Questo metodo sicuro permette di analizzare l'efficacia degli anticorpi senza infettare animali.

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J. Chua, D. Chabot e A. Friedlander disegnano le procedure descritte nel manoscritto. J. Chua e T. Putmon-Taylor eseguirono gli esperimenti. D. Chabot ha eseguito l'analisi dei dati. J. Chua scrisse il manoscritto.
Gli autori ringraziano Kyle J. Fitts per l'eccellente assistenza tecnica.
Il lavoro è stato supportato dalla concessione della Defense Threat Reduction Agency CBM. VAXBT.03.10.RD.015, piano numero 921175.
Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvate dall'esercito degli Stati Uniti. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Difesa, né la menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.

In conformità con la legge sul benessere degli animali, la politica del servizio sanitario pubblico e altri statuti e regolamenti federali relativi agli animali e agli esperimenti che coinvolgono animali, la ricerca qui descritta è stata condotta nell'ambito di un protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. La struttura in cui è stata condotta questa ricerca è accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali di laboratorio, internazionale e aderisce ai principi indicati nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, Consiglio Nazionale delle Ricerche, 201124.
1. Coltura e manutenzione della linea cellulare, RAW 264.7
NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite con tecniche asettiche.
<ol><li>Scaldare il siero bovino fetale (FBS) in un bagno d'acqua a 56 °C per 30 minuti per inattivare il complemento. NOTA: Il tempo di inattivazione di 30 minuti inizia quando FBS raggiunge i 56 °C. Per monitorare la temperatura, riscaldare un volume simile di acqua in un becher nello stesso bagno d'acqua. Una volta che l'acqua raggiunge i 56 °C, inizia il conto alla rovescia di 30 minuti per FBS. In alternativa, FBS che è stato inattivato dal calore è anche disponibile in commercio.</li>
	<li>Preparare il mezzo per raw 264.7 cellule combinando il 90% di DMEM con glucosio alto e FBS inattivato al calore al 10% (v/v). Aggiungere L-glutammina ad una concentrazione finale di 6 mM. NOTA: DMEM con alto glucosio è formulato con 4 mM L-glutammina. L'integrazione della L-glutammina a 6 mM favorisce una crescita cellulare costante. 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina possono essere aggiunti per prevenire la contaminazione. Un'altra linea cellulare murina comune, J774A.1, può anche essere utilizzata ed è coltivata in condizioni simili.</li>
	<li>Scongelare una fiala congelata di cellule in un bagno d'acqua a 37 °C e rimuovere dal bagno non appena si scioglie. Aggiungere il contenuto aseticamente a un mezzo completo da 5 ml in un tubo conico. Invertire due volte il tubo conico e ruotare a 300 x g per 5 min per le celle a pellet.</li>
	<li>Aspirare il mezzo utilizzando un pipetto Pasteur sterile attaccato a un vuoto per rimuovere l'agente congelante. Resuspend cell pellet in 5 mL di mezzo fresco.</li>
	<li>Trasferire la sospensione in un pallone o piatto trattato con coltura tissutale. Aggiungere abbastanza mezzo per coprire completamente il fondo del pallone e ruotare per distribuire uniformemente le cellule. Indicare il numero di passaggio a partire da "1".</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 °C in presenza del 5% di CO2 e dell'umidità fino a raggiungere la confluenza dal 95% al 100%. Controllare le cellule ogni giorno al microscopio a partire dal secondo giorno di incubazione. Non permettere alle celle di raggiungere la confluenza >100% in quanto ciò causerà il decollo e la morte delle cellule. NOTA: Il tempo necessario per raggiungere la confluenza dipende dal numero di cellule vive placcate e dall'area di crescita del pallone. Pertanto, è prudente controllare le cellule ogni giorno.</li>
	<li>Cellule di sottocoltura raschiando e diluendo il patrimonio cellulare in mezzo fresco consentendo almeno due giorni di crescita tra i raschiamenti. Aumentare il numero di passaggio di 1 con ogni sottocultura. NOTA: Il passaggio e la raschiatura immediata il giorno successivo si tradurranno in una perdita più rapida dell'aderenza generale delle cellule nel tempo. Raw 264.7 cellule devono essere utilizzate solo fino a circa il passaggio 15.</li>
	<li>Per placcare RAW 264.7 celle per il saggio OAA, sostituire con mezzo fresco e utilizzare un raschietto cellulare per raschiare delicatamente le cellule dal pallone. Pipetta su e giù per rompere i grumi cellulari per un più facile conteggio delle celle. NOTA: Il metodo tradizionale per la subcultura di RAW 264.7 è la raschiatura. Nella nostra esperienza, l'uso della tripside fa sì che le cellule RAW 264.7 perdano aderenza nel tempo più velocemente rispetto alla raschiatura.</li>
	<li>Per contare le celle, diluire volumi uguali di celle e cercare una soluzione blu. Caricare 10 μL su un emocitometro. Osservare e contare il numero di cellule vive che escludono il colorante utilizzando un microscopio composto invertito con una lente obiettivo 10x.</li>
	<li>Piastra 1,4 x 104 celle vitali per pozzo in una piastra inferiore piatta di vetro spessa 96 ben 0,15 μm (piastra #1). Consentire alle cellule di crescere per 3 giorni. Sostituire il mezzo trascorso un giorno prima di eseguire OAA. NOTA: Dopo 3 giorni di incubazione, il numero di cellule dovrebbe essere di circa 5 x 104/ bene.</li>
</ol>2. Coltura e preparati batterici
NOTA: La specie batterica utilizzata in questo protocollo è un ceppo virulento incapsulato, B. anthracis Ames. Tutte le manipolazioni con questa specie richiedono adeguate autorizzazioni di biosicurezza e sicurezza e devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di classe II o classe III situato in un laboratorio BSL-3. Seguire le procedure operative istituzionali per il lavoro BSL-3 e per l'uso di dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione dei batteri.
<ol><li>Preparare il brodo di infusione di cuore cerebrale (BHI) sciogliendo 37 g di polvere BHI in acqua da 1 L e autoclave a 121 °C per 15 minuti. Conservare il brodo a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la soluzione di bicarbonato di sodio all'8% in acqua e sterilizzare utilizzando una siringa filtrante da 0,20 μm. Conservare la soluzione a 4 °C e utilizzarla entro 1 giorno.</li>
	<li>Mescolare 8 g di brodo nutriente, 3 g di estratto di lievito e 15 g di agar in 1 L di acqua per preparare piatti di agar NBY. Autoclave a 121 °C per 15 min. Versare nelle piastre di Petri e lasciare solidificare. Conservare le lastre a 4 °C. NOTA: Le piastre di agar NBY possono essere fatte con o senza bicarbonato di sodio. L'aggiunta di bicarbonato di sodio alle placche di brodo e agar induce la crescita di colonie di mucoidi costituite da bacilli incapsulati. La concentrazione finale di bicarbonato di sodio sia in mezzi liquidi che solidi è dello 0,8%.</li>
	<li>Preparare il brodo di coltura per B. anthracis mescolando il 50% di brodo BHI autoclavato, il 40% di FBS e la soluzione di bicarbonato di sodio al 10% (v/v). NOTA: Questo brodo è formulato per produrre brevi catene di bacilli incapsulati.</li>
	<li>Preparare un piatto principale di B. anthracis strizzandolo per l'isolamento su una piastra di agar NBY da uno stock di spore un giorno prima di coltivare in brodo. Incubare a 37 °C.</li>
	<li>Inoculare 30 ml di brodo di coltura in un pallone ventilato da 250 ml con diverse colonie di B. anthracis. NOTA: È necessario uno specifico rapporto volume/superficie del brodo, come specificato qui, per produrre bacilli incapsulati al massimo.</li>
	<li>Agitare la coltura del brodo a 125 giri/min, 37 °C con 20% di CO2 e umidità per 18-24 ore. NOTA: La coltivazione di B. anthracis a temperature superiori a 37 °C può inibire la produzione di capsule.</li>
	<li>Utilizzare la colorazione negativa con inchiostro indiano per garantire un incapsulamento sufficiente e che i bacilli siano in catene corte (1-5 bacilli/catena) prima della fissazione (vedere la sezione 3).</li>
	<li>Per determinare le unità di formazione delle colonie (CFU), diluire serialmente 100 μL di coltura 1:10 nella soluzione di soluzione di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e diluizioni di coltura delle placche sulle piastre di agar del sangue di pecora. Incubare per 12-18 h a 37 °C. Contare i CFC e determinare il numero di batteri per mL di coltura. NOTA: Il conteggio può anche essere eseguito utilizzando un emocitometro al microscopio una volta che i batteri sono stati riparato. Tuttavia, questo non è raccomandato perché i bacilli sono difficili da vedere sotto basso ingrandimento.</li>
	<li>Aggiungere il 16% di paraformaldeide (PF) all'intero volume della coltura batterica ad una concentrazione finale del 4% di PF per fissare i bacilli. Agitare lentamente su uno shaker a temperatura ambiente per 7 giorni. NOTA: Sette giorni di incubazione nel 4% di PF si basano sulla procedura operativa standard istituzionale USAMRIID per la fissazione dei bacilli vegetativi.</li>
	<li>Per rimuovere il fissativo e testare la sterilità, lavare tre volte 4 ml (10% di volume) di sospensione batterica fissa in un tubo conico da 50 ml per centrifugazione a ≥3000 x g per 45 min e utilizzando un 30 mL/lavaggio con PBS. Conservare il campione rimanente in PF al 4% a 4 °C. NOTA: Dopo la pellettizzazione, il pellet batterico è soffice a causa della presenza di capsula. Fare attenzione a non disturbare il pellet durante il lavaggio. È necessario rimuovere tutto il fissatore in modo che non interferisca con il test di fattibilità. Se necessario, aumentare il numero di lavaggi.</li>
	<li>Per le prove di vitalità, inoculare 40 mL di un mezzo di crescita batterico (ad esempio brodo BHI) con 4 mL di sospensione lavata (≤ 10% del volume di brodo) e incubare a 37 °C per 7 giorni. Controllare la densità ottica a 600 nm prima e dopo 7 giorni per misurare la torbidità.</li>
	<li>Dopo 7 giorni di incubazione nella coltura del brodo, ≥100 μL di brodo su una piastra di agar e incubare per altri 7 giorni. Se non si vede alcun aumento della torbidità e nessuna crescita sulle piastre, la coltura originale è considerata sterile e può essere trasferita in un laboratorio BSL-2. NOTA: Il Federal Select Agent Program22 impone che l'inattivazione di B. anthracis possa essere trasferita solo dai laboratori BSL-3 dopo aver dimostrato la completa sterilità del campione. Il test di vitalità per l'inattivazione B. anthracis consiste nel coltivare il 10% del campione in brodo per 7 giorni seguito da una coltura su terreno solido per altri 7giorni 22,23. Segui le linee guida istituzionali per ricevere l'approvazione del trasferimento una volta stabilita la sterilità.</li>
</ol>3. Colorazione negativa e microscopia leggera per osservare catene di incapsulamento e bacilli
<ol><li>Mescolare sospensioni batteriche da 5 μL con 2 μL di inchiostro indiano su uno scivolo al microscopio. Posizionare un vetro di copertura spesso 1 o 1,5 μm sopra la sospensione senza creare bolle. NOTA: Lo smalto per unghie può essere utilizzato per sigillare il vetro di copertura sullo scivolo.</li>
	<li>Osservare le sospensioni batteriche utilizzando una lente obiettivo olio da 40x a 100x su un microscopio leggero. Assicurarsi che i bacilli siano incapsulati osservando una zona di gioco (la capsula esclude l'inchiostro indiano) che circonda ogni batterio e che le catene di bacilli siano corte.</li>
</ol>4. Etichettatura FITC dei batteri
<ol><li>Sciogliere l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) nel solfossido di dimetile ad una concentrazione di 2 mg/mL.</li>
	<li>Misurare il volume di stock batterico inattivato.</li>
	<li>Lavare il materiale 3 volte in PBS per rimuovere il fissatore.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione FITC ad una concentrazione finale di 75 μg/mL. Agitare lentamente la miscela per 18-24 ore a 4 °C.</li>
	<li>Lavare tre volte i batteri pellettizzazione a ≥3000 x g, 45 min e utilizzando 30 mL PBS/lavaggio per rimuovere il FITC in eccesso. Assicurarsi che il pellet soffice non sia disturbato durante il lavaggio. Riutilizza i bacilli in PBS nello stesso volume iniziale.</li>
	<li>Aliquota e conservare i bacilli in microtubi a -20 °C fino all'uso. Non congelare/scongelare i bacilli più volte in quanto i bacilli potrebbero perdere capsula.</li>
</ol>5. Opsonizzazione batterica
<ol><li>Il calore inattiva un piccolo volume di sieri di prova (da SMP) a 56 °C per 30 minuti in un blocco termico.</li>
	<li>Scongelare e lavare i batteri marcati FITC con PBS 2x mediante pellettizzazione a 15000 x g per 3-5 minuti. Resuspend in PBS nello stesso volume iniziale.</li>
	<li>In una piastra inferiore ben rotonda 96 (piastra #2), diluire serialmente i sieri di prova in mezzo cellulare. In un'altra piastra inferiore ben rotonda (piastra #3), aggiungere 10 μL di sieri di prova diluiti in ogni pozzo. NOTA: In ogni piatto, PBS e normali sieri di scimmie sono stati inclusi al posto dei sieri di prova diluiti come controlli negativi. Abbiamo anche scelto un siero di prova come controllo positivo per generare una curva standard per normalizzare tutti i test eseguiti in giorni diversi. Il siero del test di controllo positivo è stato scelto arbitrariamente perché abbondante.</li>
	<li>Per placcare #3, aggiungere 10 μL di complemento di coniglio appena ricostituito. NOTA: Una volta ricostituito, scartare il complemento di coniglio rimanente; non ricongelare e scongelare.</li>
	<li>Per placcare #3, aggiungere il volume appropriato di bacilli etichettati FITC per una molteplicità di infezione di 1:20. Ad esempio, aggiungere il volume che contiene 5 x 104 x 20 bacilli per 5 x 104 celle. Completa ogni pozzo in lamiera #3 con il volume appropriato di cellulare medio-totale 105 μL. NOTA: La #1, che contiene cellule, riceve 100 μL di batteri opsonizzati con i restanti 5 μL come volume vuoto. Abbiamo testato ogni diluizione dei sieri di prova in duplice copia.</li>
	<li>Incubare la #3 a 37 °C per 30 min in presenza del 5% di CO2 con umidità per opsonizzare i bacilli.</li>
</ol>6. Saggio di aderenza ed etichettatura fluorescente delle cellule di mammifero
<ol><li>Mantenere tutti i reagenti a 37 °C prima dell'uso.</li>
	<li>Posizionare la #1, che contiene cellule aderenti, su un blocco termico a 37 °C.</li>
	<li>Utilizzare un pipettor multicanale per rimuovere il mezzo trascorso dai pozzi e sostituire rapidamente con 100 μL di batteri opsonizzati dalla piastra #3. Assicurarsi che non siano state generate bolle nei pozzi durante la pipettazione. Incubare la piastra #1 a 37 °C con 5% di CO2 e umidità per 30 minuti per aderenza.</li>
	<li>Lavare ogni pozzo 5x con PBS da 150 μL sopra un blocco termico a 37 °C per rimuovere i bacilli non attaccati. NOTA: Fare attenzione a garantire che le cellule non vengano disperse accidentalmente durante il lavaggio.</li>
	<li>Diluire il 16% di PF con PBS 1:4 per fare il 4% di PF. Fissare le celle con 4% di PF per 1 h aggiungendo 150 μL ad ogni pozzo. Lavare le celle 2 volte con PBS.</li>
	<li>Mescolare 2 μL HCS (screening ad alto contenuto) Orange Cell Stain in 10 mL PBS. Aggiungere 150 μL di questa soluzione di colorazione a cellule fisse e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare i pozzi 2 volte con PBS.</li>
	<li>Conservare a 4 °C fino alla microscopia.</li>
</ol>7. Microscopia
NOTA: In generale, un microscopio a fluorescenza automatizzata ad alta produttività faciliterà l'imaging per l'OAA. Se non è disponibile un sistema automatizzato, le immagini fluorescenti dei bacilli aderenti possono essere prese manualmente21. In questo studio20,bacilli aderenti e monostrati cellulari sono stati coniati utilizzando il sistema di microscopia a scansione laser Zeiss 700 con apparecchiature specializzate; il nostro sistema era composto dal microscopio invertito Zeiss Axio Observer Z1 dotato di uno stadio automatizzato, dal modulo Definite Focus, dall'obiettivo 40 x NA 0.6, dalla telecamera Axio Cam HRc e dal software Zen 2012 (Blue Edition). Le immagini acquisite sono immagini widefield, non immagini confocali. Il seguente protocollo è inteso come una configurazione al microscopio di base applicabile a una varietà di sistemi di microscopia automatizzati.
<ol><li>Incubare la #1 a temperatura ambiente per 30 minuti. Accendere il microscopio e le relative apparecchiature. NOTA: L'acclimatazione a temperatura ambiente impedisce la formazione di condensa sulla piastra di vetro durante l'imaging. Inoltre, impedisce la sfocatizzazione a causa dello spostamento della temperatura.</li>
	<li>Posizionare la piastra sul palco e concentrarsi sulle celle utilizzando il campo luminoso o il contrasto di fase.</li>
	<li>Selezionare il formato 96 e l'impostazione della piastra. Selezionare le impostazioni del canale. NOTA: L'eccitazione di picco e la lunghezza d'onda di emissione di FITC sono di 495/519 nm; la macchia di cellule arancioni HCS è di 556 e 572 nm. Altri fluorofori possono essere utilizzati a seconda dei filtri disponibili al microscopio.</li>
	<li>Selezionare l'impostazione per la modalità riquadro. Indicare il numero di immagini da acquisire. NOTA: la funzione di piastrellatura consente l'acquisizione di più posizioni in un pozzo campione e può essere impostata per acquisire immagini in un accodamento o in un formato casuale. Abbiamo immaginato 10 aree casuali per pozzo.</li>
	<li>Cambia la modalità di acquisizione in "bianco e nero" o "monocromatico" e binning ≥ 2x2. NOTA: L'impostazione del binning da 1x1 a 2x2 o 4x4 aumenterebbe la velocità della microscopia, ma comporterebbe anche una risoluzione inferiore dell'immagine. Per l'OAA, è sufficiente utilizzare queste impostazioni poiché il saggio enumera sia i macrofagi che i batteri aderenti.</li>
	<li>Attivare il modulo di messa a fuoco automatica o di messa a fuoco. Indicare la frequenza con cui deve essere eseguita la funzione di messa a fuoco automatica. Attivare la funzione Z stack, se disponibile. Indicare il numero di pile Z che cattureranno lo spessore del monostrato di cellule e dei bacilli aderenti. NOTA: il numero di pile Z scelte aumenterà il tempo di microscopia, ma assicurerà che un'immagine con lo stato attivo corretto sia scattata in ogni pila Z.</li>
	<li>Designare una cartella di file in cui salvare le immagini. Eseguire il programma di imaging automatizzato.</li>
</ol>8. Raccolta e analisi dei dati
<ol><li>Contare il numero di bacilli aderenti e cellule di mammiferi per immagine. Contare ogni catena di bacilli come un batterio.</li>
	<li>Tracciare i bacilli/cellule del siero e del titolo del test di controllo positivo (ad esempio, la diluizione 1:10 è di 10 unità di titolo) per generare una curva standard in un programma statistico appropriato.</li>
	<li>Analizzare il siero di prova del controllo positivo utilizzando il raccordo della curva di regressione non lineare. Quindi analizzare i campioni rimanenti utilizzando la curva standard del siero di prova di controllo positivo per determinare i titer corrispondenti. NOTA: Di solito è più accurato scegliere le diluizioni del campione vicino al centro della curva standard quando si determinano i titolori.</li>
	<li>Calcola la media geometrica dei campioni di ogni gruppo di vaccini. Calcolare i valori P- dei formicolii trasformati di log in base all'analisi ANOVA della differenza meno significativa.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno un'associazione commerciale o di altro tipo che potrebbe rappresentare un conflitto di interessi.

I vaccini a base di capsule hanno dimostrato di essere efficaci contro numerosi agenti patogeni batterici e molti sono autorizzati perl'uso nell'uomo 25,26,27. Questi vaccini funzionano generando anticorpi mirati alla capsula e molti di questi studi utilizzano l'OPKA per mostrare le funzioni opsono-fagocitichedegli anticorpi 13,14,16,<s...

Riconoscimento, aderenza, internalizzazione e degradazione di un agente patogeno sono parte integrante della fagocitosi1, una via saliente nella risposta immunitaria innata dell'ospite descritta per la prima volta da Ilya Metchnikoff nel 18832,3. I leucociti fagocitici, così come altre cellule del sistema immunitario, sono altamente discriminatori nella loro selezione di bersagli; sono in grado di distinguere tra "non-sé infettivo" e "sé non infettivo" attraverso modelli molecolari associati agli agenti patogeni per il loro repertorio di recettori di riconoscimento dei modelli (PRR)4,5. Il riconoscimento dell'ospite di un agente patogeno può verificarsi anche con il legame delle opsonine ospiti, come complemento eanticorpi 6. Questo processo, chiamato opsonizzazione, ricopri l'agente patogeno con queste molecole, migliorando l'internalizzazione al legame con i recettori opsonici (ad esempio, complemento e recettori Fc) sulle cellule fagocitiche6. Affinché un agente patogeno aderisca a un fagocita, è necessario il legame collettivo di più recettori con i loro ligandi affini. Solo allora l'aderenza può attivare e sostenere le cascate di segnalazione all'interno della cella host per avviare l'internalizzazione6.
A causa dell'importanza della fagocitosi nella clearance degli agenti patogeni e nella prevenzione delle infezioni, gli agenti patogeni extracellulari hanno sviluppato numerosi modi per sovvertire questo processo per prolungarne la sopravvivenza. Una strategia importante è la produzione di una capsula polimerica anionica (ad esempio polisaccaride o poliaminoacido) che è anti-fagocitica in virtù della sua carica, è scarsamente immunogenica e protegge le molecole sull'involucro batterico dai PRR6,7. Agenti patogeni come Cryptococcus neoformans e Streptococcus pneumoniae hanno capsule composte da polimeri saccharide, mentre Staphylococcus epidermidis e alcune specie di Bacillus producono acido poli-ɣ-glutammico (PGGA)7,8. Tuttavia, altri agenti patogeni producono capsule che assomigliano all'io non infettivo. Ad esempio, lo Streptococcus pyogenes e un ceppo patogeno di B. cereus hanno una capsula di acido ialuronico che non è solo anti-fagocitico ma che potrebbe anche non essere riconosciuta come estranea dal sistema immunitario9,10.
La coniugazione della capsula in proteine portanti li converte da antigeni poveri e indipendenti dalla T in antigeni altamente immunogenici dipendenti da T che possono indurre alti tigatori di anticorpi anti-capsula sierati11,12. Questa strategia viene utilizzata per i vaccini autorizzati contro S. pneumoniae, Haemophilus influenzaee Neisseria meningitides11. Le attività opsoniche degli anticorpi anti-capsula sono state comunemente valutate da test di uccisione opsono-fagocitica (OPKA)13,14,15,16. Questi test testano se gli anticorpi funzionali possono innescare la fagocitosi e uccidere14. Tuttavia, l'uso di OPKA con agenti patogeni infettivi, come agenti e tossine di selezione biologica di livello 1 (BSAT), tra cui B. anthracis17, è pericoloso e presenta rischi per la sicurezza; questi saggi richiedono un'ampia gestione di un agente selezionato. La manipolazione di agenti selezionati può essere effettuata solo in laboratori di livello di biosicurezza limitato 3 (BSL-3); il lavoro in questi settori richiede procedure operative prolungate a causa delle numerose precauzioni di sicurezza che devono essere seguite. Anche i laboratori BSL-3 in genere non sono dotati delle attrezzature specializzate utilizzate per il lavoro OPKA, come microscopi e citometri. Pertanto, abbiamo sviluppato un saggio alternativo basato sull'uso di batteri inattivati18,19. Ci riferiamo a questo come un saggio opsono-aderenza (OAA) che non dipende dall'internalizzazione e dall'uccisione delle uscite di saggio; invece, l'aderenza di agenti patogeni inattivati opsonizzati è usata come indice di fagocitosi. Meccanicamente, L'OAA è un sostituto adatto perché l'aderenza avviene a priori ed è intimamente intrecciata con l'internalizzazione e l'uccisione intracellulare. Dal punto di vista della biosicurezza, l'OAA è preferito perché richiede una manipolazione minima di un agente infettivo, è sperimentalmente di durata inferiore rispetto all'OPKA e può essere eseguito nei laboratori BSL-2 dopo che uno stock di agente patogeno inattivato è stato prodotto e trasferito.
Dimostriamo l'utilizzo dell'OAA per esaminare la funzione opsonica degli anticorpi anti-capsule trovati nei sieri di primati non umani (NMP) vaccinati con un coniugato a capsula [cioè PGGA da B. anthracis coniugato al complesso proteico della membrana esterna (OMPC) di Neisseria meningitides]20. I bacilli opsonizzati al siero sono stati incubati con una linea cellulare di macrofagi di topo aderente, RAW 264.7. Dopo la fissazione, il monostrato cellulare e i bacilli aderenti sono stati immaginiti dalla microscopia a fluorescenza. L'aderenza batterica è aumentata quando i bacilli sono stati incubati con siero da NSP vaccinati con il coniugato della capsula rispetto al siero di controllo20. Aderenza correlata alla sopravvivenza della sfida dell'antrace20,21. Pertanto, l'uso di OAA ha caratterizzato la funzione degli anticorpi anti-capsula e ha notevolmente facilitato il test del nostro candidato vaccino.

<table><tbody><tr><td>0,20 & micro; m filtro per siringa (25 mm, cellulosa rigenerata)</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>431222</td> siringa da <td></td></tr><tr><td>10 ml (punta Luer-Lok)</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15&micro; 96 pozzetti piastre nere (piastra #1 per imaging)</td><td>In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA</td><td>P96-1-N</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica, Hatfield, PA</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Pallone trattato con coltura tissutale di 75 cm</td><td>quadrati Corning, Corning, NY</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Agar (polvere)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Baby Rabbit Complement</td><td>Cedarlane Labs, Burlington, NC</td><td>CL3441</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito Bacto</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion (BHI)</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Blood Agar (TSA con sangue di pecora)</td><td>Remel, Lenexa, KS</td><td>R01198</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Sarstedt, Newton, NC</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>Costar Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti (piastre #2 e 3 per diluizioni)</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>Microscopia elettronica Science, Hatfield, PA</td><td>72200-10</td><td></td></tr><tr><td>Brodo nutriente</td><td>Difco BD, Sparks, MD</td><td>234000</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto glucosio</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>11965-092</td><td>contiene 4500 mg/L di glucosio, 4 mM di L-glutammina, Phenol Red</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto Cell Imaging System (microscopio a fluorescenza)</td><td>Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>Siero</td> <td>fetale bovinoHyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>non irradiato con raggi gamma, non inattivato dal calore</td></tr><tr><td>Isotiocianato di fluoresceina</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>F143</td><td></td></tr><tr><td>HCS Cell Mask Orange Cell Stain</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Emocitometro H32713</td><td></td></tr><tr><td>(Neubauer migliorato)</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA</td><td>3900</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di inchiostro di china</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>261194</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina (200 mM)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA</td><td>25030081</td><td>integrare il terreno con 2 mM di L-glutammina aggiuntiva</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U (microscopio composto invertito)</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td>PBS senza calcio o magnesio</td><td>Lonza, Walkersville, MD</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina, 100x</td><td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>piastre di Petri (100 x 15 mm)</td><td>Falcon, Corning, Durham, NC</td><td>351029</td><td>per piastre di agar</td></tr><tr><td>RAW 264.7 linea cellulare di macrofagi (Tib47)</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano (0,4%)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia a scansione laser Zeiss 700 (microscopio confocale)</td><td>Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY</td><td>4109001865956000</td><td></td></tr></tbody></table>

test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

Il saggio opsono-aderenza è un saggio funzionale che enumera l'attaccamento di agenti patogeni batterici ai fagociti professionisti. Poiché l'aderenza è necessaria per la fagocitosi e l'uccisione, il saggio è un metodo alternativo ai test di uccisione opsono-fagocitica. Un vantaggio del saggio opsono-aderenza è la possibilità di utilizzare agenti patogeni inattivati e linee cellulari di mammiferi, che consente la standardizzazione in più esperimenti. L'uso di un agente patogeno inattivato nel saggio facilita anche il lavoro con agenti infettivi di livello di biosicurezza 3 e altri agenti patogeni virulenti. Nel nostro lavoro, il saggio opsono-aderenza è stato utilizzato per valutare la capacità funzionale degli anticorpi, dai sieri di animali immunizzati con un vaccino a base di capsula di antrace, per indurre l'aderenza del Bacillus anthracis fisso a una linea cellulare di macrofagi del topo, RAW 264.7. La microscopia a fluorescenza automatizzata è stata utilizzata per catturare immagini di bacilli che aderiscono ai macrofagi. L'aumento dell'aderenza è stato correlato con la presenza di anticorpi anti-capsula nel siero. I primati non umani che mostravano alte concentrazioni di anticorpi anti-capsula sierati erano protetti dalla sfida dell'antrace. Pertanto, il saggio opsono-aderenza può essere usato per chiarire le funzioni biologiche degli anticorpi specifici dell'antigene nei sieri, per valutare l'efficacia dei candidati al vaccino e di altre terapie e per servire come possibile correlato dell'immunità.

Questa sezione mostra le micrografie rappresentative raccolte durante un esperimento OAA insieme ai risultati che mostrano che l'OAA può essere utilizzato per esaminare la funzione biologica degli anticorpi. Qui, il test è stato utilizzato con successo per valutare l'efficacia di un candidato al vaccino contro l'antrace. È fondamentale verificare lo stato di incapsulamento sui bacilli poiché il poco o nessun incapsulamento li fa aderire alle cellule ospiti, producendo uno sfondo elevato. La figura 1<...

Il saggio opsono-aderenza è un metodo alternativo al saggio di uccisione opsono-fagocitica per valutare le funzioni opsoniche degli anticorpi nello sviluppo del vaccino.

Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Il test Opsono-Adherence analizza la presenza di anticorpi oponici funzionali prodotti negli animali dopo la vaccinazione, che hanno dimostrato di essere correlati con l'efficacia di diversi vaccini umani autorizzati. Questo test è preferito per l'uso con agenti biologici selezionati e altri patogeni infettivi e può essere eseguito in un laboratorio BSL-1 o BSL-2 dopo il trasferimento dell'agente BSL-3 inattivato. Gli anticorpi contro le capsule batteriche, inclusa la capsula di Bacillus anthracis, si sono dimostrati efficaci in modelli animali di infezione.I saggi di aderenza Opsono valutano funzionalmente gli anticorpi senza infettare gli animali. Seguire tutte le procedure istituzionali di sicurezza quando si lavora con ceppi virulenti incapsulati di Bacillus anthracis. Per questo video, stiamo utilizzando un ceppo inattivato in condizioni di livello di biosicurezza due.Iniziare questa procedura con la preparazione delle celle RAW 264.7, come descritto nel protocollo di testo. Per preparare le cellule per il test di aderenza all'opsono, sostituire il pallone con un terreno fresco e utilizzare un raschietto cellulare per raschiare delicatamente le cellule dal pallone. Pipettare su e giù per rompere i grumi di cellule e facilitare il conteggio delle cellule.Piastra 14.000 celle per pozzetto in una piastra a fondo piatto di vetro a 96 pozzetti di spessore 0,15 micron. Lasciare crescere le cellule per tre giorni, sostituendo il terreno esaurito un giorno prima di eseguire l'OAA. Dopo tre giorni di incubazione, il numero di cellule dovrebbe essere di circa 50.000 cellule per pozzetto.Per iniziare il saggio, preparare una piastra master di Bacillus anthracis da un stock di spore striandola per l'isolamento su una piastra di agar NBY. A scopo dimostrativo, è stata utilizzata una piastra di agar con sangue di pecora. Incubare a 37 gradi Celsius per un giorno prima di coltivare in brodo.Quindi, inoculare 30 millilitri di brodo di coltura in un pallone ventilato da 250 millilitri con diverse colonie di bacilli. Agitare il brodo di coltura a 125 giri/min, 37 gradi Celsius, con il 20% di CO2 e umidità per 18-24 ore. Utilizzare la colorazione negativa con inchiostro di china per garantire un incapsulamento sufficiente e che i bacilli siano in catene corte prima del fissaggio.Per fare ciò, mescola cinque microlitri di sospensione batterica con due microlitri di inchiostro di china su un vetrino da microscopio. Quindi, posizionare un vetro di copertura di uno o 1,5 micron di spessore sopra la sospensione senza creare bolle. Osservare la sospensione batterica utilizzando un obiettivo a olio da 40 a 100 volte su un microscopio ottico.Una capsula spessa esclude l'inchiostro di china. Assicurarsi che i bacilli siano incapsulati osservando una zona di sgombero che circonda ciascun batterio. Assicurarsi inoltre che le catene dei bacilli siano corte.Per determinare le unità formanti colonie, o CFU, diluire in serie 100 microlitri di coltura da uno a 10 in soluzione PBS e diluire la coltura su piastre di agar di sangue di pecora. Incubare per 12-18 ore a 37 gradi Celsius. Contare le CFU e determinare il numero di batteri per millilitro di coltura.Dopo essersi assicurati che i bacilli siano sufficientemente incapsulati, diluiti e placcati, fissare la coltura batterica rimanente aggiungendo 10 millilitri di paraformaldeide al 16% ai 30 millilitri di coltura a una concentrazione finale di paraformaldeide al 4%. Trasferire il volume in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi, agitare lentamente su uno shaker a temperatura ambiente per sette giorni.Per verificare la sterilità, trasferire quattro millilitri, o il 10% del volume, di sospensione batterica fissa in una provetta conica da 50 millilitri. Lavare la sospensione aggiungendo PBS e pellettare ad un minimo di 3000 G per 45 minuti. Quindi rimuovere il surnatante, assicurandosi che il pellet soffice non venga disturbato.Dopo aver ripetuto questo lavaggio almeno due volte, risospendere il campione fissato in quattro millilitri di PBS. E' necessario rimuovere tutto il fissativo durante i lavaggi in modo che il fissativo non interferisca con il test di vitalità. Se necessario, aumentare il numero di lavaggi.Per il test di vitalità, inoculare 40 millilitri di un terreno di crescita batterica con quattro millilitri di sospensione lavata e incubare a 37 gradi Celsius per sette giorni. Controllare la densità ottica a 600 nanometri in uno spettrofotometro prima e dopo sette giorni per misurare la torbidità. Dopo sette giorni di incubazione in brodo, impiattare almeno 100 microlitri di brodo su una piastra di agar e incubare per altri sette giorni.Se non si osserva alcun aumento della torbidità e nessuna crescita sulle piastre, la coltura originale viene considerata sterile e può essere trasferita in un laboratorio BSL-2. Segui le linee guida istituzionali per l'approvazione del trasferimento. Lavare tre volte il brodo batterico inattivato in PBS per rimuovere il fissativo.Aggiungere la soluzione FITC alla concentrazione finale di 75 microgrammi per millilitro. Agitare lentamente la miscela per 18-24 ore a quattro gradi Celsius. Lavare i batteri come prima per rimuovere la FITC in eccesso.Dopo il lavaggio finale, risospendere i bacilli in PBS allo stesso volume iniziale e conservare i bacilli a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Inattivare a caldo un piccolo volume di sieri di prova provenienti da primati non umani a 56 gradi Celsius per 30 minuti in un blocco termico o in una macchina per PCR.Cadere e lavare i batteri marcati con FITC con PBS due volte pellettando a 15.000 volte G per tre-cinque minuti. Risospensione in PBS nello stesso volume iniziale. In una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti, diluire in serie i sieri di prova in terreno cellulare.In un'altra piastra a fondo tondo da 96 pozzetti, aggiungere 10 microlitri di sieri di prova diluiti in ciascun pozzetto. Quindi, aggiungi 10 microlitri di coniglietto appena ricostituito complemento. Alla piastra numero tre, aggiungere il volume appropriato di bacilli marcati con FITC per una molteplicità di infezioni di 20.Ad esempio, a un volume contenente 50.000 volte 20 bacilli per 50.000 cellule. Rabboccare ogni pozzetto nella piastra numero tre con il volume appropriato di terreno cellulare per un totale di 105 microlitri. Incubare la piastra numero tre a 37 gradi Celsius per 30 minuti in presenza del 5% di CO2 con umidità per opsonizzare i bacilli.Posizionare la piastra numero uno, che contiene celle di aderenza, su un blocco termico a 37 gradi Celsius. Utilizzare un pipettatore multicanale per rimuovere il terreno esaurito dai pozzetti e sostituirlo rapidamente con 100 microlitri di batteri opsonize della piastra numero tre, assicurandosi che non si generino bolle nei pozzetti durante il pipettaggio. Per non disturbare il monostrato cellulare, aggiungere volume ai lati dei pozzetti.Incubare la piastra numero uno a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 e umidità per 30 minuti per garantire l'aderenza. Lavare ogni pozzetto cinque volte con 150 microlitri di PBS, oltre al blocco termico a 37 gradi Celsius, per rimuovere i bacilli non attaccati. Pipettare a lato dei pozzetti per assicurarsi che le cellule non si disperdano accidentalmente durante il lavaggio.Aggiungere 150 microlitri di paraformaldeide al 4% in ogni pozzetto e fissare le cellule per un'ora. Dopo aver lavato le cellule due volte con PBS, mescolare due microlitri di colorazione di cellule arancioni ad alto contenuto in 10 millilitri di PBS. Quindi, aggiungere 150 microlitri di questa soluzione colorante per fissare le cellule e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Posiziona la piastra numero uno sul tavolino e metti a fuoco le celle utilizzando il campo chiaro o il contrasto di fase. Nella scheda Acquisizione, selezionare il formato a 96 pozzetti come impostazione della piastra. Quindi, seleziona Impostazioni canale.Quindi, seleziona l'impostazione su Modalità piastrella. Indicare il numero di immagini da acquisire. Cambia la modalità di acquisizione in bianco e nero o monocromatico e imposta il Binning su almeno due a due.Attivare l'autofocus o il modulo di messa a fuoco. Indicare la frequenza con cui deve essere eseguita la funzione di messa a fuoco automatica. Quindi, attiva la funzione Z-Stack, se disponibile.Indica il numero di Z-Stack che cattureranno lo spessore del monostrato cellulare e dei bacilli aderenti. Designare una cartella di file in cui salvare le immagini. Ora, esegui il programma di imaging automatizzato.Eseguire la raccolta e l'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo. Il ceppo di Ames di bacillus anthracis è stato colorato negativamente con inchiostro di china per esaminare l'incapsulamento. Lo stato di incapsulamento deve essere verificato, poiché un incapsulamento minimo o nullo le fa aderire alle cellule ospiti senza anticorpi, producendo un elevato background.L'intensità della fluorescenza e le caratteristiche di fotosbiancamento dei bacilli sono state esaminate utilizzando la microscopia confocale. È fondamentale verificare che la fluorescenza dei bacilli non sbiadisca in modo significativo nel tempo, perché i bacilli subiranno lunghe esposizioni alla luce durante l'imaging. Le immagini di massima proiezione del Bacillus anthracis attaccato ai monostrati cellulari sono mostrate qui.Si tratta di campi visivi rappresentativi che sono stati contati e valutati per il test di aderenza all'opsono. L'aumento dell'attaccamento dei Bacilli incubati con antisiero coniugato in capsula è dovuto alla presenza di anticorpi anti-capsula che opsonano i Bacilli. I titoli sierici dei primati non umani vaccinati con 10 e 50 microgrammi di capsula coniugata sono significativamente più alti dei titoli per il coniugato e la capsula da soli.Stiamo sviluppando un test simile che utilizza la citometria a flusso e i neutrofili umani, che sono cellule non aderenti, per misurare l'attività opsonica e anche per quantificare la capsula sulla superficie dei batteri. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione del test di aderenza all'opsono. Non dimenticare che lavorare con gli agenti patogeni BSL-3 è estremamente pericoloso.Le linee guida istituzionali e le precauzioni di sicurezza devono essere seguite rigorosamente.

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Il video mostra un test di uccisione opsonofagocitaria in vitro utilizzando una co-coltura di neutrofili umani con Streptococcus pneumoniae. Gli anticorpi e le proteine del complemento facilitano l'opsonizzazione dei batteri, consentendo ai neutrofili di riconoscere e uccidere i batteri, mostrando un'attività opsonofagocitaria di successo.

Valutazione dell'attività di uccisione opsonofagocitaria contro patogeni batterici

Questo video dimostra un test di aderenza all'opsono per esaminare l'interazione tra batteri opsonizzati e cellule immunitarie. I batteri marcati in fluorescenza, trattati con siero di prova contenente anticorpi anti-capsula, vengono incubati con macrofagi. Dopo aver colorato i macrofagi con la fluorescenza, i batteri attaccati sulla superficie dei macrofagi vengono osservati al microscopio per la visualizzazione.

Un test di aderenza all'opsono per valutare l'opsonizzazione dei batteri incapsulati da parte degli anticorpi anti-capsula

Una nuova tecnica per la visualizzazione rapida dell'antigene su una superficie batterica è presentata, che coinvolge la superficie biotinylation seguita dall'esposizione alle proteine di interesse in fusione con avidina monomerico. Caricamento di BCG con antigeni selezionati correttamente, migliora la sua immunogenicità, suggerendo che la decorazione di superficie può sostituire tradizionali approcci genetici.

Espressione di antigeni esogeni nel Mycobacterium bovis BCG vaccino via genetica decorazione superficiale con il sistema avidina-biotina

Qui presentiamo un elegante protocollo per la valutazione in vivo di vaccino efficacia e host le risposte immunitarie. Questo protocollo può essere adattato per i modelli di vaccino che studiano virale, batterica o parassitari patogeni.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Questo test di uccisione anticorpli viene utilizzato per confrontare la capacità delle cellule fagocitiche immuni di rispondere e uccidere i batteri basati su diversi trattamenti e/o condizioni. Classicamente, questo test serve come il gold standard per valutare le funzioni effettrici degli anticorpi alzati contro un batterio come opsonina.

Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni

Qui viene presentato un semplice protocollo per la produzione di nanoparticelle di mRNA basate su polimeri poli(beta aminoestere), facili da personalizzare cambiando l'mRNA incapsulato. Viene inoltre descritto il flusso di lavoro per la sintesi dei polimeri, le nanoparticelle e la loro caratterizzazione essenziale in vitro. Viene aggiunta anche una prova di concetto per quanto riguarda l'immunizzazione.

Sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle poli(beta aminoesters) caricate con mRNA a fini vaccinali

Il protocollo presenta metodi dettagliati per valutare se l'adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D promuove risposte immunitarie cellulari efficaci.

In vitro Valutazione dell'attività cellulare del vaccino adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D

Nell'infezione da Mycoplasma pneumoniae, i test sierologici possono generare buoni risultati, ma con bassa specificità a causa della reazione crociata immunologica. L'ELISA interno per la cattura dell'antigene, descritto in questo articolo, garantisce un'elevata specificità delle specie e ha dimostrato di essere un test di screening affidabile per una diagnosi accurata di M. pneumoniae.

Saggio immunoassorbente legato all'enzima di cattura dell'antigene per la rilevazione specifica di Mycoplasma pneumoniae

Il presente protocollo prepara e valuta le proprietà fisiche, la risposta immunitaria e l'effetto protettivo in vivo di un nuovo vaccino adiuvante nanoemulsione.

Valutazione della risposta immunitaria di un vaccino adiuvante nanoemulsione contro l'infezione da Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA)

Qui, presentiamo un protocollo alternativo per indurre attivamente l'encefalomielite autoimmune sperimentale in topi C57BL / 6, utilizzando l'epitopo immunogenico mielinico oligodendrocitario glicoproteina (MOG) 35-55 sospeso in adiuvante di Freund incompleto contenente la sottospecie di Mycobacterium avium uccisa dal calore paratuberculosis.

Attività adiuvante del Mycobacterium paratuberculosis nel migliorare l'immunogenicità degli autoantigeni durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

In questo protocollo, abbiamo sviluppato un acido retinoico (RA) incapsulato in nanoemulsione cationica da utilizzare come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose antigene-specifiche. Aggiungendo l'artrite reumatoide approvata dalla FDA alla nanoemulsione, le sIgA antigene-specifiche sono state promosse nella vagina e nell'intestino tenue dopo l'iniezione intramuscolare della nanoemulsione.

Acido retinoico incapsulato con nanoemulsione cationica come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose specifiche per le OVA

Impara l'assay di opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo di vaccini contro Bacillus anthracis. Questo metodo sicuro permette di analizzare l'efficacia degli anticorpi senza infettare animali.

Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati (Video) | JoVE Journal

Test opsono-aderenza per valutare gli anticorpi funzionali nello sviluppo del vaccino contro bacillus anthracis e altri agenti patogeni incapsulati

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