Infusione e stimolazione combinate con voltammetria ciclica a scansione rapida (CIS-FSCV) per valutare la regolazione del recettore dell'area tegmentale ventrale della dopamina fasica

Questo approccio può aiutare a chiarire il ruolo di una specifica area tegmentale ventrale, dei recettori somatodendritici e del rilascio fasico di dopamina nel nucleo accumbens. Il vantaggio principale di questo approccio è che le domande sul controllo della funzione dei recettori sul rilascio fasico di dopamina possono essere affrontate nel cervello intatto. Ottimizzare la posizione del microelettrodo in fibra di carbonio e dello stimolatore bipolare può essere impegnativo e alcuni consigli per i principianti stanno iniziando a registrare nello striato dorsale.

A causa dell'uso e della manipolazione di diversi tipi di elettrodi, inclusi elettrodi di registrazione, di riferimento e di stimolazione, sarà utile una guida visiva su quando e dove questi elettrodi vengono impiantati. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, pulire il cuoio capelluto di un ratto anestetizzato con tre scrub sequenziali di iodopovidone ed etanolo al 70%. Dopo l'ultimo scrub, utilizzare pinzette sterilizzate e forbici chirurgiche per tagliare abbastanza tessuto del cuoio capelluto per fare spazio agli elettrodi impiantati.

Pulisci delicatamente la superficie esposta del cranio con applicatori di cotone sterilizzato prima di applicare due o tre gocce di perossido di idrogeno al 3% per aiutare a identificare lambda e bregma. Quindi, utilizzare una punta da trapano da un millimetro impostata a circa 20.000 giri al minuto per praticare un foro di 1,5 millimetri di diametro, 2,5 millimetri anteriormente e 3,5 millimetri lateralmente alla bregma. Impiantare una vite di 1,59 millimetri di diametro esterno e 3,2 millimetri di lunghezza circa a metà del foro fino a quando la vite non è saldamente in posizione.

Quindi, praticare un foro per l'elettrodo di riferimento di un millimetro di diametro nell'emisfero sinistro, 1,5 millimetri anteriormente e 3,5 millimetri lateralmente al bregma. Inserire circa due millimetri di filo di riferimento nel foro mentre si avvolge il filo attorno e sotto la testa della vite impiantata. Quindi impiantare completamente la vite, fissando l'elettrodo di riferimento in posizione.

Nell'emisfero destro, praticare un foro di 1,5 millimetri di diametro, 1,2 millimetri anteriormente e 1,4 millimetri lateralmente alla bregma, e utilizzare una pinzetta per rimuovere con cura la dura. Per l'elettrodo stimolante, praticare un foro quadrato di due millimetri anteriormente-posteriore e cinque millimetri medial-laterale centrato a 5,2 millimetri posteriormente e un millimetro lateralmente alla bregma. Utilizzando le barre stereotassiche del braccio, abbassare la cannula guida dell'elettrodo stimolante bipolare cinque millimetri sotto la dura.

Utilizzando le barre stereotassiche del braccio, abbassare il microelettrodo in fibra di carbonio quattro millimetri sotto la dura madre nella porzione più dorsale dello striato e collegare il filo di riferimento e la fibra di carbonio a un potenziostato. Quindi applicare una forma d'onda triangolare da meno 0,4 a 1,4 volt, 400 volt al secondo per 15 minuti a 60 Hertz, seguita da uno stimolo di 10 minuti a 10 Hertz. Per ottimizzare la posizione dell'elettrodo stimolante, impostare lo stimolatore in modo che produca una forma d'onda elettrica bipolare con una frequenza di 60 Hertz, 24 impulsi, corrente di 300 microampere e due millisecondi per larghezza dell'impulso di fase.

Abbassare delicatamente lo stimolatore con incrementi di 0,2 millimetri da 5 a 7,8 millimetri sotto la dura, stimolando il VTA ad ogni incremento. Continuare ad abbassare la cannula guida dell'elettrodo stimolante bipolare fino a quando una stimolazione non produce un rilascio fasico di dopamina al microelettrodo in fibra di carbonio all'interno dello striato dorsale. Una volta osservato un rilascio di dopamina, abbassare il microelettrodo in fibra di carbonio fino a quando non si trova almeno sei millimetri sotto la dura madre nella parte più dorsale del nucleo accumbens.

Quando l'elettrodo è in posizione, stimolare il VTA e registrare l'ampiezza del picco di dopamina, quindi abbassare o alzare il microelettrodo in fibra di carbonio fino al sito che produce il maggior rilascio di dopamina, assicurandosi che il picco della risposta della dopamina sia rappresentato come un chiaro picco di ossidazione a 0,6 volt e un picco di riduzione a meno 0,2 volt. Una volta ottimizzata la posizione della cannula guida dell'elettrodo in fibra di carbonio e stimolante, stimolare l'animale ogni tre minuti per 20-30 minuti. Dopo aver raggiunto una linea di base stabile, abbassare delicatamente la cannula interna a mano nella cannula guida premontata nello stimolatore bipolare e ottenere ulteriori due o tre registrazioni di base per confermare che l'inserimento della cannula non ha causato un cambiamento nel segnale evocato.

Una volta stabilita una risposta di base, utilizzare una pompa a siringa e una microsiringa per infondere 0,5 microlitri della soluzione farmacologica di interesse nel VTA per un periodo di due minuti. Dopo l'infusione, lasciare la cannula interna in posizione per almeno un minuto prima della rimozione, continuando a registrare la risposta ogni tre minuti per misurare gli effetti post-infusione. Come dimostrato in questi grafici di colori rappresentativi, l'infusione salina non altera il rilascio fasico di dopamina stimolato.

L'infusione di NMDA produce un robusto aumento del rilascio fasico di dopamina stimolato, mentre l'antagonista competitivo del recettore NMDA, AP5, produce una robusta diminuzione. Sia l'antagonista non competitivo del recettore nicotinico dell'acetilcolina mecamilamina che l'antagonista competitivo non selettivo del recettore dell'acetilcolina muscarinico competitivo scopolamina producono una robusta diminuzione del rilascio fasico di dopamina stimolato. In questo grafico si può osservare un riassunto degli effetti dei farmaci testati nel tempo.

La cannula per infusione deve essere inserita con cura nell'elettrodo stimolante bipolare. In caso contrario, possono verificarsi danni eccessivi, che portano a cambiamenti artefatti nel rilascio fasico di dopamina. Questo approccio ha permesso ai ricercatori di affrontare più finemente i meccanismi recettoriali specifici con cui il rilascio fasico di dopamina è regolato in vivo.