Micropatterning a cella singola semplice senza litografia con stencil laser-cut
3 aprile 2020
Questo protocollo introduce un metodo di micromodellazione senza litografia che è semplice e accessibile a coloro che hanno un background di bioingegneria limitato. Questo metodo utilizza stencil personalizzati tagliati al laser per micropattern proteine a matrice extracellulare in una forma di interesse per la modulazione delle morfologie cellulari. La procedura per la micropatterning è dimostrata utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti.
Descriveremo un metodo di micropattern a singola cella privo di litografia basato su stencil che supera molti ostacoli associati alla fotolitografia e alla litografia morbida. Gli stencil sono riutilizzabili e il processo è economico e personalizzabile. Questo metodo ha aperto una nuova strada per i ricercatori non ingegneri per studiare la forma cellulare e la meccanotraduzione indotta dall'area in vari contesti fisiologici e patologici.
Inoltre, questo protocollo consente la micropatterning di migliaia di cellule che possono essere utilizzate per lo screening dei farmaci ad alta produttività e la modellazione delle malattie in un piatto. La dimostrazione visiva faciliterà l'impianto di due passaggi cruciali: distacco di coverslip dall'idrogel, essiccazione dell'idrogel sufficientemente prima di posizionare lo stencil. Preparare la soluzione di idrogel di poliacrilammide in un nuovo tubo di centrifuga di propilene da 50 millilitri come descritto nel manoscritto.
Successivamente, per preparare la soluzione di fotoinizio del 5%, sciogliere gli ingredienti in 700 microlitri di etanolo al 100%. Gli ingredienti non sono solubili in acqua, quindi assicurati di dissolversi completamente con il vortice. Aggiungere 300 microlitri di PBS per un volume finale di un millilitro.
Lavorando su ghiaccio, diluire la soluzione di stock proteico della matrice di membrana basale con supporti DMEM F12 ghiacciati o 1X PBS al rapporto di diluizione ottimizzato. Tenere sul ghiaccio per un uso successivo. Quando si lavora con la matrice a membrana basale, assicurarsi di lavorare sempre sul ghiaccio e utilizzare soluzioni di freddo ghiaccio in punte e tubi di pipetta refrigerati.
Posizionare una lampada da banco UV in una cappa di sicurezza biologica. Quindi, posizionare i film di paraffina sterilizzati preparati in precedenza. Se le pellicole di paraffina non sono completamente asciutte, utilizzare un sistema di aspirazione sottovuoto per rimuovere eventuali liquidi residui.
Usando le forcep autoclavate, posiziona sei coverlips autoclavate sul film di paraffina sei in ogni piastra di Petri. Per preparare la soluzione finale di poliacrilammide cross-linkable UV, diluire la soluzione fotoiniziatore con la soluzione precursore dell'idrogel di poliacrilammide. Sterilizzare la soluzione utilizzando un'unità filtrante da 50 millilitri con una dimensione dei pori di 0,22 micrometri.
Quindi erogare 200 microlitri di soluzione finale in poliacrilammide retibile UV su ciascuno dei sei coprispacchi in vetro nelle piastre di Petri. Utilizzando le forcep autoclavate, coprire con cura ogni coverlip con un secondo coverslip intrappolando uno strato della soluzione tra i due copripavimenti. Posizionare le piastre di Petri contenenti i copripacchi sotto la lampada da banco UV con il coperchio chiuso.
La copertura del white paper sulla superficie non bianca è importante per ridurre al minimo la perdita di intensità UV. Per la protezione dalle radiazioni UV, coprire la lampada con un foglio di alluminio. Fotopolimerizzare gli idrogel di poliacrilammide per cinque minuti.
Utilizzare una lama di rasoio per separare accuratamente ogni paio di coverlips. Riempire il serbatoio contenente sei compositi di coverslip idrogel con PBS. Dopo il risciacquo per cinque minuti, riportare i compositi di coverlip dell'idrogel al film di paraffina nella piastra di Petri.
Ottenere un tubo di Sulfo-SANPAH dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius. Aggiungere 1.200 microlitri di PBS pre-refrigerato al tubo e mescolare tubazione su e giù. Distribuire 200 microlitri del Sulfo-SANPAH diluito sul film di paraffina nella piastra di Petri.
Posizionare un composito di coverslip idrogel sul Sulfo-SANPAH con l'idrogel che contatta il Sulfo-SANPAH. Quindi, posizionare i compositi di copertura dell'idrogel sotto la lampada UV ed esporli per cinque minuti per attivare il Sulfo-SANPAH. Se il Sulfo-SANPAH passa dall'arancione al marrone indicando l'attivazione e l'incorporazione di successo, procedere ai passaggi successivi entro 10 minuti.
Reintegrare il serbatoio monouso in polipropilene con PBS fresco. Trasferire i compositi di frantoio attivati nel serbatoio e sciacquarli brevemente per rimuovere il Sulfo-SANPAH non legato. Posizionare i compositi di coverlip dell'idrogel sul film di paraffina nelle piastre di Petri e tamponarli con cura con salviette sterili senza pelucchi.
Posizionare uno stencil sopra ogni idrogel coverslip composito. Per garantire una tenuta stretta tra lo stencil e il composito, rimuovere l'umidità in eccesso tamponando con salviette autoclavate senza pelucchi. Erogare con cura la soluzione proteica della matrice di membrana basale diluita posizionando 200 microlitri sopra ogni composito di coprisciuma idrogel.
Incubare i costrutti durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, trasferire i compositi su una piastra a sei pozza. Una tenuta stretta tra idrogel e stencil può essere facilmente convalidata osservando se la soluzione proteica della matrice è stata mantenuta sopra lo stencil.
La mancata formare una tenuta stretta porta a una rapida perdita della soluzione proteica attraverso i fori. Immergere completamente i compositi in PBS. Utilizzando pinzette in autoclave, staccare accuratamente gli stencil dagli idrogel senza strappare gli idrogel.
Rimuovere il PBS dai pozzi e riempire i pozzi con DMEM. Incubare il piatto durante la notte a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso la piastra dall'incubatore, esaminare il DMEM.
Se il DMEM non è torbido, i compositi idrogel coverslip sono pronti per essere utilizzati per la placcatura cellulare. Gli stencil erano fabbricati contenenti matrici di quadrati e rettangoli. Substrati idrogel micropatterned sono stati creati dagli stencil e sono state ottenute isole di proteine matrici.
Sono state ottenute anche isole cellulari. Ad esempio, isole di cardiomiociti pluripotenti derivati da cellule staminali indotte dall'uomo. La concentrazione di proteine matriciali ha svolto un ruolo essenziale nel generare modelli propri.
Una concentrazione ottimale ha portato ad una distribuzione omogenea delle proteine. Le concentrazioni di soluzione proteica a matrice non ottimale hanno portato a modelli non ottimale. È fondamentale utilizzare il lato anteriore dello stencil.
Se viene utilizzato il lato posteriore dello stencil, la dimensione delle isole proteiche della matrice aumenta a causa della direzione del taglio laser. Mentre l'uso del lato posteriore dello stencil non influisce in modo significativo sulla larghezza dei motivi rettangolari, l'altezza è aumentata significativamente portando a una riduzione delle proporzioni desiderate. La modelliatura a base di stencil è stata applicata ai substrati di elastomero di silicio.
I cardiomiociti modellati sui substrati di elastomero di silicio sono stati visualizzati dall'immunocitochimica della troponina cardiaca T a basso ingrandimento e dalla proteina sarcomerica alfa-actina ad alto ingrandimento. Il modello a base di stencil è stato anche applicato al modello di due cardiomiociti fianco a fianco su idrogel con rigidità diverse. La scoperta di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e dei corrispondenti protocolli di differenziazione ne ha fatto un modello umano ideale in vitro per lo studio dell'oncogenesi e della patogenesi.
Tuttavia, una delle principali limitazioni all'uso del sistema IPS è l'assenza di struttura al microambiente che ha particolare composizione biochimica e rigidità per interagire con le cellule. Il patterning può essere combinato con microscopia a forza di trazione e test immunocitochimica per caratterizzare la struttura e la funzione dei cardiomiociti. L'analisi dei tipi cellulari derivati dall'IPS, nel nostro caso cardiomiocita, in una morfologia più fisiologica apre opportunità per studiare cardiomiociti impegnativi nel piatto di coltura.
La tecnica può anche essere applicata a molti altri sistemi come e piastre di screening ad alto contenuto. La forma e il substrato possono essere facilmente adattati all'applicazione.
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Panoramica
Questo protocollo introduce un metodo di micromodellazione senza litografia basato su stencil che è accessibile per i ricercatori con limitata esperienza in bioingegneria. Il metodo utilizza stencil riciclabili tagliati al laser per micromodellare proteine della matrice extracellulare, consentendo la modulazione delle morfologie cellulari, in particolare nei cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Bioingegneria
- Ricerca sulle cellule staminali
Contesto
- I metodi tradizionali di fotolitografia e litografia morbida possono essere complessi e costosi.
- Questo nuovo metodo è progettato per essere economico e personalizzabile.
- Consente ai ricercatori non ingegneri di esplorare la forma cellulare e la meccanotrasduzione.
- La micromodellazione può essere applicata a migliaia di cellule per applicazioni ad alto rendimento.
Obiettivo dello studio
- Fornire un metodo semplice di micromodellazione accessibile a una gamma più ampia di ricercatori.
- Facilitare gli studi sulla morfologia cellulare e la meccanotrasduzione in vari contesti.
- Consentire lo screening farmacologico ad alto rendimento e la modellazione delle malattie.
Metodi utilizzati
- Preparazione della soluzione di idrogel di poliacrilammide.
- Utilizzo di stencil tagliati al laser per la micromodellazione.
- Stacco del vetrino da idrogel.
- Asciugatura dell'idrogel prima del posizionamento dello stencil.
Principali risultati
- Il metodo modella con successo le proteine della matrice extracellulare.
- Dimostra la capacità di modulare efficacemente le morfologie cellulari.
- Le applicazioni ad alto rendimento sono possibili con questo approccio.
- Le dimostrazioni visive migliorano la comprensione del protocollo.
Conclusioni
- Questo metodo senza litografia semplifica il processo di micromodellazione.
- Apre nuove strade per la ricerca in biologia cellulare e meccanotrasduzione.
- Il protocollo è adatto a una vasta gamma di applicazioni nella ricerca biomedica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This lithography-free stencil-based micropatterning method addresses accessibility barriers in single-cell analysis, enabling broader R&D teams to study mechanotransduction and cell fate determination without specialized microfabrication expertise. By supporting high-throughput patterning of thousands of cells, it enhances predictive confidence in target validation and phenotypic screening workflows. The approach reduces technical complexity and cost, facilitating scalable adoption in early discovery and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modulating cell shape and size to study mechanotransduction pathways in disease-relevant systems.
- Operational Value: Provides a robust, inexpensive platform for functional target validation using iPSC-derived cardiomyocytes and other cell types.
- Predictive Confidence: Supports portfolio triage by generating quantitative morphological and functional readouts that de-risk mechanistic assumptions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by creating standardized micropatterned substrates with controlled extracellular matrix presentation.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through reusable laser-cut stencils and consistent hydrogel-based protein patterning.
- Scalability: Supports high-throughput screening readiness by patterning arrays of up to 2,000 cells per experiment, facilitating dose-response and phenotypic profiling.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applies to iPSC-derived cardiomyocytes, enabling study of adult-like rectangular morphologies that better model physiological mechanotransduction in cardiac disease contexts.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by allowing assessment of cell structure and function across substrate stiffnesses, supporting biomarker alignment and risk-adjusted advancement.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in phenotype-genotype relationships by isolating the effect of cell geometry on signaling pathways, improving predictive value for in vivo translation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, providing standardized cell preparation for mechanistic and phenotypic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise control of cell shape and area to study mechanotransduction in iPSC-derived models.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via reproducible micropatterning of thousands of cells, enabling reliable compound screening in disease modeling applications.
- Analytics: Generates measurable outputs such as cell alignment, protein island formation, and morphological metrics that help teams compare conditions across genetic or pharmacological perturbations.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing patterning on tunable substrates (e.g., silicon elastomer) to assess stiffness-dependent responses, relevant to fibrotic or ischemic cardiac models.
- Enterprise Reuse: Positions the stencil-based approach as a reusable capability across projects, reducing redundant setup and enabling cross-team adoption in mechanobiology and phenotypic screening platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through controlled single-cell micropatterning.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability through reusable stencils and hydrogel-based patterning compatible with standard cell culture workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of shape-dependent phenotypic responses, reducing late-stage biological risk in cardiovascular and mechanotransduction-focused programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating high-content, morphology-linked data that inform target selection and lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture and molecular biology expertise; no specialized microfabrication training needed.
- Depends on access to UV light source, laser-cut stencil fabrication (outsourcable), and standard hydrogel reagents (e.g., acrylamide, Sulfo-SANPAH).
- Necessitates cross-team standardization of stencil orientation and hydrogel preparation to ensure consistent protein patterning and aspect ratio control.
- Adaptation considerations include substrate compatibility (e.g., glass, elastomers) and extracellular matrix protein optimization for specific cell types.
- Practical limitations include the need for careful stencil handling to avoid hydrogel tearing and precise timing during Sulfo-SANPAH activation to ensure efficient protein immobilization.
