Fabbricazione di reti di nanotubi lipidici multicomponenti utilizzando il test di motilità di Kinesin gliding
26 luglio 2021
Questo protocollo descrive un processo per fabbricare reti di nanotubi lipidici utilizzando la motilità della kinesina planante in combinazione con vescicole lipidiche unilamellari giganti.
Questo protocollo consente la semplice generazione di reti di nanotubi lipidici su larga scala in cui i singoli nanotubi mostrano un comportamento di separazione di fase simile a quello della vescicola genitore. Il vantaggio principale di questo approccio è che cooptiamo il lavoro svolto dai motori molecolari per auto-assemblare i nanotubi lipidici in modo altamente parallelo e senza l'intervento umano. Per impostare un test di motilità di scorrimento, in primo luogo, apporre tre serie di strisce di nastro biadesivo su una slitta di vetro a cinque millimetri di distanza.
Premere delicatamente un coperchio scivolare sul nastro e aggiungere 30 microlitri di una soluzione di kinesina monoparolare nella cella di flusso preparata. Dopo cinque minuti, aggiungere 30 microlitri di una soluzione di microtubuli da 10 microgrammi/millilitro nella cella, premendo delicatamente una salvietta da laboratorio contro l'estremità opposta del canale di flusso per facilitare lo scambio di soluzione. Dopo altri cinque minuti di incubazione, lavare la cella da una a tre volte con 50 microlitri di soluzione di motilità a temperatura ambiente per lavaggio prima di aggiungere 30 microlitri di soluzione di streptavidina da 10 microgrammi / millilitro alla cella di flusso.
Dopo 10 minuti, aggiungere 30 microlitri di una soluzione 10X GUV per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere due microlitri di una soluzione AMP-PNP da 100 millimolari e chiudere la camera con sigillante. Trasferire la camera di flusso su un microscopio invertito per l'imaging e selezionare il set di filtri appropriato.
Utilizzare un obiettivo a olio 100X per mettere a fuoco prima la superficie dello slittamento del coperchio prima di acquisire un'immagine di una rete di interesse. Quindi aprire l'immagine in ImageJ e fare clic su Immagine, Colore e Composito per sovrapporre i canali rosso e verde per creare un'immagine composita. Dopo l'imaging, apri l'immagine di interesse e fai clic su Analizza e imposta scala per calibrare la scala per il microscopio.
Inserisci i pixel fino al fattore di conversione del micrometro e fai clic su OK. Utilizzare lo strumento linea multipunto per tracciare i nanotubi a partire dal GUV padre e tenere premuti Ctrl e M per misurare la lunghezza. Lo strumento di elaborazione delle immagini salverà ogni nuova misurazione nella finestra dei risultati. Quando tutti i tubi sono stati misurati, selezionare Immagine, Regola e Soglia e fare clic su Applica per applicare la soglia.
Quindi, disegnare un rettangolo di lunghezza nota sul tubo desiderato. Per misurare la densità integrata dell'area, fare clic su Analizza e misura Per determinare il partizionamento lipidico nei nodi dei nanotubi liquidi, utilizzare lo strumento linea per disegnare una linea sul nodo di interesse e misurare l'intensità del nodo sia nei canali verde che rosso. In questa analisi rappresentativa, sono state fabbricate reti di nanotubi liquidi come dimostrato per generare fasi disordinate e ordinate liquide, nonché vescicole separate da fasi.
Ad esempio, le vescicole sintetizzate con il 45% di lipidi saturi e il 55% di lipidi insaturi si traducono in vescicole che si separano in fasi liquide-disordinate e solide coesistenti. Se si include il colesterolo, tuttavia, si può quindi osservare la coesistenza liquido-liquido, creando GUV che si separano in fasi coesistenti ordinate liquide e liquido-disordinate. Inoltre, i nodi possono essere osservati all'interno delle miscele separate da fase.
La cosa più importante da ricordare è scegliere il tempo di esposizione appropriato e il set di filtri ND per poter visualizzare i nanotubi lipidici senza foto-sbiancare i fluorofori. Personalizzare la composizione del comportamento di fase dei nanotubi lipidici ci consente di utilizzare un sistema di modelli minimalisti per iniziare a studiare la biofisica dei nanotubi di tunneling che collegano le cellule.
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Panoramica
Questo protocollo consente la semplice generazione di reti lipidiche su larga scala mediante la motilità di chinesina in scorrimento. I singoli nanotubi mostrano un comportamento di separazione di fase simile a quello dei vescicoli parentali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Biologia Cellulare
Sfondo
- I nanotubi lipidici sono importanti per lo studio della dinamica delle membrane.
- I motori chinesina facilitano l'autoassemblaggio delle strutture lipidiche.
- La separazione di fase nei sistemi lipidici può fornire informazioni sui processi cellulari.
- Questo metodo migliora la scalabilità della produzione di nanotubi.
Scopo dello studio
- Realizzare in modo efficiente reti di nanotubi lipidici.
- Utilizzare motori molecolari per l'autoassemblaggio senza intervento umano.
- Studiare il comportamento di fase dei nanotubi lipidici.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di un saggio di motilità scivolante utilizzando chinesina e microtubuli.
- Utilizzo di nastro biadesivo per creare una camera di flusso su un vetrino.
- Aggiunta sequenziale di soluzioni di chinesina e microtubuli.
- Lavaggio e aggiunta di streptavidina per facilitare la formazione di nanotubi.
Risultati principali
- Generazione con successo di reti di nanotubi lipidici.
- Dimostrazione del comportamento di separazione di fase nei nanotubi.
- Alta scalabilità del metodo grazie all'uso di motori molecolari.
- Potenziali applicazioni nello studio della dinamica delle membrane e dei processi cellulari.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per la fabbricazione di nanotubi lipidici.
- L'utilizzo di motori chinesina consente un autoassemblaggio efficiente.
- Questo approccio può favorire la ricerca in biologia lipidica e dinamica delle membrane.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La fabbricazione rapida di reti di nanotubi lipidici multicomponente mediante il saggio di motilità del kinesina in movimento consente modelli in vitro scalabili e riproducibili per lo studio del trasporto associato alle membrane e della biofisica lipidica. Questo approccio supporta la scoperta nelle fasi iniziali fornendo sistemi regolabili e biologicamente rilevanti che riproducono la complessità dei tubuli lipidici cellulari. Il metodo aumenta la fiducia predittiva negli studi meccanicistici e nella selezione di portafogli nella ricerca terapeutica mirata alle membrane.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei meccanismi di trasporto attraverso le membrane in un sistema controllato e regolabile.
- Consente la validazione funzionale di bersagli molecolari coinvolti nella dinamica e nel trasporto dei lipidi.
- Semplifica la riduzione del rischio meccanicistico modellando la separazione di fase e il comportamento di ripartizione dei lipidi.
- Fornisce una piattaforma per la verifica di ipotesi sulle interazioni lipidi-proteine rilevanti per i percorsi patologici.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Permette la preparazione riproducibile e scalabile di reti di nanotubi lipidici per saggi successivi.
- Consente la misurazione quantitativa della lunghezza, larghezza e distribuzione dei lipidi nei nanotubi, per la standardizzazione dei saggi.
- Permette la generazione rapida di sistemi lipidici complessi utilizzando apparecchiature di laboratorio standard.
- Supporta lo screening di composti che influenzano la struttura della membrana o i processi di trasporto.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Fornisce un modello rilevante per lo studio delle nanotubi di tunneling implicati nella comunicazione intercellulare.
- Si allinea alla scoperta di biomarcatori traslazionali consentendo l'analisi del comportamento di fase lipidica e del ripartimento.
- Supporta la continuità dalla scoperta fino alla validazione preclinica di interventi mirati alle membrane.
- Riduce l'ambiguità biologica nella selezione di modelli preclinici per composti attivi sulle membrane.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso della scoperta, dalle prime indagini meccanicistiche allo sviluppo di modelli preclinici per bersagli associati alle membrane.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi e la chiarificazione di percorsi coinvolti nel trasporto e nel segnaling mediati da lipidi.
- Screening: Fornisce reti di nanotubi lipidici pronte all'uso, riproducibili e con proprietà regolabili.
- Analisi: Permette misurazioni quantitative delle dimensioni dei nanotubi e della ripartizione lipidica per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega le informazioni meccanicistiche ottenute in vitro ai fenomeni di membrana rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma standardizzata e scalabile, adattabile a diversi programmi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulla biologia delle membrane.
- Valore operativo: Semplifica la fabbricazione, la standardizzazione e la riproducibilità di sistemi lipidici complessi.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza nell'uso del capitale per portafogli mirati alle membrane.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei candidati terapeutici attivi sulle membrane, corretta per il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biofisica dei lipidi e microscopia a fluorescenza per l'analisi quantitativa.
- Necessita di strumentazione di laboratorio standard per l'assemblaggio della cella a flusso e l'acquisizione di immagini.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di acquisizione e misurazione.
- Adattabile a diverse composizioni lipidiche e sistemi modello per soddisfare esigenze di ricerca varie.
- Dipende da un accurato controllo dei parametri di acquisizione per evitare il fotoblecamento del fluorocromo.
