Campionamento e analisi dei segnali di profumo animale

Abbiamo sviluppato una metodologia efficace per il campionamento e l'analisi dei segnali di odore al fine di capire come possono essere utilizzati nella comunicazione animale. In particolare, utilizziamo la microesezione a fase solida headspace abbinata alla spettrometria gascromatografia-massa per analizzare i componenti volatili degli odori animali e dei segni olfatto.

Il ruolo svolto dall'odore nella comunicazione animale è attualmente sottovalutato e così sottovalutato. In particolare si sa molto poco dei cambiamenti chimici alla base dei segnali olfattivi negli animali, compresi gli esseri umani. E ciò è dovuto anche a sfide metodologiche, alla registrazione e alla quantificazione di composti chimici degli odori utilizzati dagli animali per comunicare.

Ci sono diverse potenziali sfide quando si lavora con miscele chimiche altamente complesse e queste includono anche quando si campiona e si analizzano i campioni di odore. Stiamo conducendo l'analisi degli odori utilizzati dagli animali per capire come possono essere utilizzati da loro quando comunicano tra loro. Abbiamo combinato la citochimica con l'endocrinologia bioecologia e la citologia per migliorare la nostra comprensione del ruolo svolto dall'odore nella comunicazione animale.

Per la nostra attuale metodologia a Wolverhampton, abbiamo adottato la tecnica della microstruttura in fase solida Headspace accoppiata con spettrometria di massa gascromatografica, costruita su e una metodologia invisibile sono utilizzate in passato. Gli odori campione vengono raccolti in uno dei seguenti modi. Uno, odori campione rilasciati spontaneamente da soggetti di studio abituati.

Ad esempio, i primati dello zoo raccolgono secrezioni di odore di ghiandola profumata mediante marcatura del profumo su carta da filtro sterile o campioni di urina direttamente in fiale. Due, dopo aver allenato i soggetti dello studio utilizzando rinforzo positivo raccolgono secrezioni di odore strofinando lo sguardo profumato con tamponi di cotone sterili. Tre, dopo la sedazione dei soggetti dello studio, raccolgono secrezioni di odore strofinando ghiandole profumate con tamponi di cotone sterili, da campioni in viti sterili da 10 millilitri con cappuccio, flaconcini di vetro trasparente e guarnizione con tappi con viti che incorporano il settore del silicone P T F E.

Conservare immediatamente le fiale a meno 20 gradi Celsius. Si noti che è fondamentale utilizzare dispositivi di protezione individuale puliti come guanti in nitrile durante il campionamento. Cambiare spesso i guanti evitare il contatto diretto della pelle con campioni e fiale.

Si preferisce utilizzare fiale nuove di zecca. Tuttavia, in caso di fiale usate, è fondamentale pre-pulire le fiale e quindi utilizzare lo stesso protocollo. Prendi gli spazi vuoti ambientali ogni volta che vengono raccolti segni di profumo.

Eseguire questa operazioni esponendo all'ambiente una carta da filtro o un batuffolo di cotone inutilizzato e flaconcini durante il campionamento. I campioni vengono preparati sul campo. Per una carta filtrante marcata profumata tagliare un quadrato di circa 10 millimetri dalla carta e posizionare in una fiala di spazio della testa sormontata da una vite da 10 millilitro.

Per un tampone, tagliare la testa del tampone all'estremità dell'albero del tampone e posizionarlo in una fiala dello spazio della testa. Dopo che ogni campione è stato preparato smaltire o pulire l'uso della lama per tagliare il supporto di campionamento, con un'appropriata salvietta antibatterica e o alcool e asciugare accuratamente. Conservare tutti i campioni a meno 20 gradi celsius.

Si noti che i campioni devono essere conservati a meno 20 gradi Celsius, tuttavia, nel negozio sul campo al più basso è possibile la temperatura e trasferire a meno 20 gradi Celsius alla prima opportunità. Prima dell'analisi rimuovere i campioni dal congelatore e permettere di camminare naturalmente a temperatura ambiente per almeno un'ora. Impostare i metodi analitici sul GCMS come segue per le condizioni di analisi SPMS seguire le istruzioni del produttore per condizionare le fibre SBME prima del primo utilizzo.

È fondamentale che l'assieme SBME sia installato correttamente nel campionatore automatico e che sia allineato all'unità di condizionamento della fibra dei vassoi del campionatore automatico e alla porta di ingresso GC. Un allineamento errato potrebbe causare danni o distruzione della fibra Sbme. Assicurarsi che l'alimentazione di gas persico all'unità di condizionamento della fibra sia accesa.

Per migliorare la coerenza del tempo di conservazione del campione, il metodo analitico è il tempo di conservazione bloccato, aggiungere i flaconcini campione al vassoio del campionatore automatico posizionare una fiala vuota dello spazio della testa per fungere da vuoto di sistema nella prima posizione del vassoio del campionatore automatico. Posizionare il vuoto ambientale nella seconda posizione, quindi posizionare tutti i campioni rimanenti per l'analisi nelle posizioni successive del vassoio del campionatore automatico. Creare una sequenza analitica per analizzare ogni campione all'interno del vassoio del campione.

Nella schermata iniziale del cacciatore di massa, selezionate la sequenza per la barra dei menu e quindi la sequenza di caricamento dal menu a discesa. Verrà visualizzata una tabella di sequenza vuota che completerà la tabella delle sequenze per tutti gli spazi vuoti e gli esempi inserendo le informazioni appropriate, ad esempio come tabella di sequenza completata. Si noti che le informazioni esatte per la tabella di sequenza dipenderanno dalla formattazione dei laboratori della tabella.

Le informazioni minime includerebbero in genere il nome del campione di esempio, il percorso del file e il metodo analitico del numero e il percorso del file di dati e l'allocazione del nome di un file di dati corrispondente al nome di esempio invecchiato per l'elaborazione dei dati futuri. Ulteriori campioni possono essere aggiunti alla sequenza durante l'analisi. Eseguite la sequenza selezionando la sequenza dalla barra dei menu e quindi eseguite la sequenza.

Dopo l'analisi, i campioni sono stati restituiti al congelatore il prima possibile. Si noti che potrebbe essere possibile rianalizzare i campioni. Ma va notato che alcuni componenti volatili potrebbero essere stati completamente estratti durante l'analisi iniziale e alcuni composti potrebbero aver subito una decomposizione termica e batterica a 40 gradi Celsius.

Pertanto, il risultato nel cromatogramma potrebbe non essere completamente rappresentativo della marcatura del profumo originale. L'analisi iniziale dei dati include l'integrazione di cromatogrammi per ottenere il tempo di conservazione e i dati dell'area di picco insieme all'identificazione provvisoria dei picchi utilizzando il software della stazione cam e i database spettrali di massa del nido. L'analisi dei dati può essere effettuata manualmente o con un metodo semi-automatizzato.

Se si utilizza il metodo semi-automatizzato, a volte è utile intraprendere un certo grado di analisi manuale dei dati per verificare le identificazioni provvisorie. Per avviare l'analisi dei dati, aprire il file di dati facendo clic sul file appropriato nella barra di spostamento sinistra. Il cromatogramma ionico totale TIC verrà visualizzato nella finestra superiore della schermata di analisi dei dati.

Per integrare il TIC utilizzando l'integratore RTE, selezionare prima il cromatogramma dalla barra dei menu, quindi selezionare integratore dal menu a discesa che viene visualizzata una casella pop-up e scegliere l'integratore RTE. Tornare al menu del cromatogramma e ora selezionare Integra. Per regolare i parametri di integrazione in modo da integrare picchi o un rumore di base superiore a tre volte superiore, selezionare nuovamente il cromatogramma dalla barra dei menu e quindi i parametri di integrazione di MS Signal dal menu a discesa.

Nella casella pop-up, regolare l'area di picco minima in base alle esigenze 1.0 produce risultati accettabili nei nostri esempi. Per identificare i picchi e generare un report riepilogativo, selezionare esporta report dalla barra dei menu e quindi creare report sui risultati della ricerca in XLS. Si noti che le librerie spettrali da cercare insieme al numero di corrispondenze di libreria da visualizzare devono essere preimpostate all'interno del software prima di poter eseguire una ricerca in libreria.

Il report foglio di calcolo risultante contiene i dati di integrazione per ogni picco e una corrispondenza provvisoria della libreria spettrale per assegnare l'identità. In genere la qualità della libreria o la corrispondenza della libreria deve essere maggiore di 80 per accettare l'identificazione provvisoria. Salvare il foglio di calcolo.

Per identificare un picco direttamente dal TIC, scegli il picco di interesse. Se il picco è piccolo, ingrandisci disegnando una casella intorno al picco, tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse allungare la casella sul picco e rilasciare il pulsante del mouse. Posizionare la linea del cursore in modo che si trova nel punto più alto del picco o subito dopo.

Il doppio clic, il pulsante destro del mouse e lo spettro di massa per il picco appariranno nella finestra bassa della schermata di analisi dei dati. Per eseguire una ricerca in una libreria spettrale, spostare il cursore in un punto qualsiasi della finestra spettrale e fare doppio clic con il pulsante destro del mouse, i risultati della ricerca della libreria verranno visualizzati in una nuova finestra. Per rimuovere prima il rumore di fondo da uno spettro di interesse, fare doppio clic con il pulsante destro del mouse sul picco in questione, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse in un'area senza picchi immediatamente davanti al picco di interesse, fare clic sul pulsante di sottrazione nella barra multifunzione del menu o selezionare cromatogramma per la barra dei menu e quindi sottrarre gli spettri dal menu a discesa.

Lo spettro sottratto verrà visualizzato nella finestra inferiore della schermata di analisi dei dati e mostrerà un trattino accanto ai dati di scansione nell'intestazione della finestra. A seguito di questo protocollo, abbiamo provvisoriamente identificato un totale di 32 composti chimici volatili dall'analisi di 14 segni di profumo genitale rilasciati spontaneamente su carta da filtro da lemuri arruffati rossi e confrontato profili di odori con caratteristiche del segnalatore composti volatili presenti naturalmente come idrocarburi, terpeni, alcoli e chetoni Turpin erano presenti all'interno di questi profili e includono i composti che in precedenza erano stati trovati per agire come ormoni sessuali e segnali di fitness in altre specie animali. I composti che sono stati provvisoriamente identificati sono elencati nella tabella uno.

I cromatogrammi rappresentativi uno da un controllo e uno da un segno di profumo di Lima sono mostrati nella figura uno. Il numero e l'abbondanza relativa dei componenti variavano da campione a campione tra diverse materie di studio. Tuttavia, sei composti etichettati da A a F sul cromatogramma erano presenti in tutti i campioni.

Questi composti sono stati piegati rispettivamente in altezza all'isola di E un paracristalismo esanale sei paramentha due otto coloranti uno due pinene quattro e pentodecano. I risultati di questo studio hanno suggerito che i lemuri arruffati rossi usano la marcatura inviata per trasmettere informazioni sul sesso e sull'età femminile con un marchio no genitale che gioca un ruolo nella comunicazione socio-sessuale. Un altro risultato rappresentativo dopo l'uso di questo protocollo è stato il nostro studio della pubblicità della fertilità da parte di babbuini di olive femminili.

Abbiamo identificato un totale di 74 composti volatili dall'analisi di 395 campioni di odore vaginale di babbuino femminile. Questi includevano una serie di composti volatili odorosi presenti in natura come chetoni, alcoli, aldeidi, terpeni, acidi grassi volatili e idrocarburi. I cromatogrammi tipici usano per confrontare campioni di odori vaginali di troll e babbuini femminili di periodi fertili e non fertili sono mostrati nella figura due.

Esaminiamo le relazioni tra profili di odore vaginale e ricettività sessuale dei babbuini femminili. I nostri risultati hanno mostrato che la quantità totale di odore vaginale differisce con la fertilità suggerendo che l'odore potrebbe svolgere un ruolo nel segnalare la fertilità del babbuino femminile. Abbiamo anche trovato differenze nell'odore vaginale tra i tipi di gruppo, ma non siamo stati in grado di distinguere gli effetti della composizione di gruppo, dell'età femminile.

Sono i vantaggi combinati del campionamento e dell'uso del GCMS. Quindi, l'utilizzo della micro estrazione in fase solida dello spazio della testa consente di analizzare una vasta gamma di campioni diversi utilizzando GCMS. Siamo in grado di separare i componenti di queste marcature complesse e quindi identificare ciascuno di questi singoli componenti usando lo spettrometro di massa.

E poi, l'intera tecnica combinata è molto potente e ci dà molte informazioni su questi segni di profumo, che in passato ci sarebbe stata molta estrazione della preparazione del campione necessaria per poter ottenere i risultati.