Name: Campionamento e analisi dei segnali di profumo animale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Scopri le tecniche di campionamento e analisi dei segnali olfattivi animali mediante estrazione in fase solida e spettrometria di massa. Questo metodo consente di identificare i composti volatili chiave nella comunicazione chimica.

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Ringraziamo Keith Holding per la sua assistenza alle analisi chimiche presso il Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton e Ben Mantle per la produzione del video. Siamo inoltre grati al Prof. Gloriano Moneti, al Dott. Giuseppe Pieraccini e ai membri del Mass Spectrometry Center dell'Università di Firenze, Firenze, e al Prof. Luca Calamai e al Dott. Marco Michelozzi dell'ARCA Lab del CNR di Firenze, per il loro aiuto nella messa a punto di questa metodologia. I progetti di ricerca che comprendevano i metodi di campionamento e di analisi descritti nel manoscritto sono stati sostenuti da due Borse intraeuropee Marie Skłodowska-Curie (ID accordo di sovvenzione: 327083, 703611), una piccola sovvenzione ('Il primate arricchito sensoriale') della Primate Society of Great Britain, e una piccola borsa di ricerca ('I cacciatori-raccoglitori hanno uno speciale senso dell'olfatto?') dalla British Academy/The Leverhulme Trust a S.V. Il lavoro di laboratorio necessario per impostare questa metodologia ha anche ricevuto finanziamenti dal Concorso annuale di finanziamento della Facoltà di Scienze e Ingegneria (Wolverhampton) a S.V.

1. Raccolta dei campioni
<ol><li>Odori campione che sono uno dei seguenti:<ol>
<li>Raccogliere spontaneamente rilasciato da soggetti di studio abituati (ad esempio, primati dello zoo) attraverso la marcatura del profumo su carta filtrante sterile (ad esempio, secrezioni di odori di ghiandola profumata) o direttamente in fiale (ad esempio urina).</li>
		<li>Raccogliere strofinando tamponi di cotone sterili dopo aver allenato le materie di studio utilizzando un allenamento di rinforzo positivo.</li>
		<li>Raccogliere strofinando tamponi di cotone sterili dopo la sedazione di soggetti di studio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare i campioni in flaconcini di vetro trasparente sterili con cappuccio a vite da 10 mL e sigillare con tappi con viti con setti FTFE /silicone. Conservarli immediatamente a -20 °C. NOTA: È fondamentale utilizzare dispositivi di protezione individuale puliti, come guanti di nitrile; cambiarli frequentemente; evitare il contatto diretto della pelle con campioni e fiale. Si preferisce utilizzare fiale nuove di zecca; tuttavia, in caso di flaconcini usati, è fondamentale pre-pulire le fiale e quindi utilizzare lo stesso protocollo.</li>
	<li>Prendi gli spazi vuoti ambientali ogni volta che vengono raccolti segni di profumo. Ad esempio, raccogliere i mezzi di campionamento (ad esempio, carta da filtro o tampone) e una fiala headspace esposta all'ambiente durante il campionamento.</li>
</ol>2. Preparazione del campione
<ol><li>Preparare i campioni sul campo tagliando con una lama un quadrato di circa 10 mm da una carta da filtro marcata dal profumo, o la testa del tampone, e posizionandolo in un flaconcino head-space con punta a vite da 10 mL.</li>
	<li>Dopo aver preparato ciascun campione, smaltire o pulire la lama utilizzata per tagliare il supporto di campionamento utilizzando un'appropriata salvietta antibatterica e/o alcool e asciugare accuratamente.</li>
	<li>Conservare tutti i campioni a -20 °C. NOTA: Preferito a -20 °C o comunque il più basso possibile sul campo.</li>
</ol>3. Preparazione all'analisi
<ol><li>Rimuovere i campioni dal congelatore e lasciare riscaldare naturalmente a temperatura ambiente per almeno 1 h.</li>
	<li>Impostare il metodo analitico sul GC-MS come segue:<ol>
<li>Per le condizioni di analisi SPME, seguire le indicazioni del produttore per condizionare le fibre SPME prima del primo utilizzo: pre-condizione della fibra (260 °C per 5 minuti), incubazione del campione (40 °C per 2 min), tempo di estrazione (15 min), tempo di desorbimento (2 min) e post-condizione della fibra (260 °C per 20 min).</li>
		<li>Utilizzare le seguenti condizioni GC: colonna (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), temperatura dell'iniettore (270 °C), portata (1 mL/min), modalità di iniezione (splitless), profilo del forno GC (45 °C per 2 min; da 4 °C/min a 170 °C; da 20 °C/min a 300 °C), linea di trasferimento MSD (280 °C). NOTA: per migliorare tra la coerenza del tempo di conservazione del campione, il metodo analitico è bloccato nel tempo di conservazione).</li>
		<li>Utilizzare le seguenti condizioni MSD: ritardo del solvente (2,5 min) e intervallo di scansione (da 29 a 400 amu). NOTA: Un intervallo da 10 a 400 è stato utilizzato nei protocolli precedenti4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Assicurarsi che l'alimentazione del gas di spurgo all'unità di condizionamento della fibra sia accesa. NOTA: È fondamentale che l'assieme SPME sia installato correttamente nel campionatore automatico e che sia allineato ai vassoi del campionatore automatico, all'unità di condizionamento della fibra e alla porta di ingresso GC. Un allineamento errato potrebbe causare danni o distruzione della fibra SPME.</li>
</ol>4. Analisi
<ol><li>Posizionare una fiala vuota dello spazio di teste (per fungere da vuoto di sistema) nella prima posizione del vassoio del campionatore automatico GC-MS. Posizionare il vuoto ambientale nella seconda posizione del vassoio del campionatore automatico. Posizionare i campioni per l'analisi nelle posizioni successive del vassoio del campione automatico.</li>
	<li>Creare una sequenza analitica per analizzare ogni campione all'interno del vassoio del campione.<ol>
<li>Nella schermata iniziale di MassHunter, selezionate Sequenza | Sequenza di carico.</li>
		<li>Completare la tabella delle sequenze per tutti gli spazi vuoti e i campioni inserendo le informazioni appropriate. Salvare la tabella delle sequenze completata. NOTA: Le informazioni esatte per la tabella di sequenza dipenderanno dalla formattazione dei laboratori per la tabella. Le informazioni minime includerebbero normalmente il tipo di campione, il nome del campione, la posizione e il numero del flaconcino, il metodo analitico e il percorso e il nome del file di dati (l'allocazione di un nome di file di dati corrispondente al nome del campione aiuta l'elaborazione futura dei dati). Ulteriori campioni possono essere aggiunti alla sequenza durante l'analisi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguite la sequenza selezionando Sequenza (Sequence | Eseguire la sequenza.</li>
	<li>Dopo l'analisi, riportare i campioni nel congelatore il prima possibile. NOTA: può essere possibile rianalizzare i campioni, ma va notato che alcuni componenti volatili possono essere stati completamente estratti durante l'analisi iniziale e alcuni composti possono essere stati sottoposti a decomposizione termica e batterica a 40 °C, quindi il cromatogramma risultante potrebbe non essere completamente rappresentativo della marcatura olografica originale.</li>
</ol>5. Analisi dei dati
NOTA: L'analisi iniziale dei dati include l'integrazione di cromatogrammi per ottenere il tempo di conservazione e i dati delle ore di picco insieme all'identificazione provvisoria dei picchi utilizzando il software ChemStation e i database spettrali di massa NIST (National Institute of Standards and Technology), versione MSD F.01.01.2317. L'analisi dei dati può essere effettuata manualmente o con un metodo semi-automatizzato. Se si utilizza il metodo semi-automatizzato, a volte è utile intraprendere un certo grado di analisi manuale dei dati per verificare le identificazioni provvisorie.
<ol><li>Aprire il file di dati facendo clic sul file appropriato nella barra di spostamento sinistra. Il cromatogramma ionico totale (TIC) verrà visualizzato nella finestra superiore della schermata di analisi dei dati.</li>
	<li>Per integrare il TIC utilizzando l'integratore RTE, selezionare Chromatogram | Integrare.</li>
	<li>Regolare i parametri di integrazione in modo da integrare picchi superiori a 3 volte il rumore di base. Selezionare cromatogramma | Parametri di integrazione del segnale MS. Nella casella di uscita regolare l'area di picco minima in base alle esigenze (1.0 produce risultati accettabili nei nostri esempi).</li>
	<li>Per identificare i picchi e generare un report riepilogativo, selezionare Esporta report | Report dei risultati della ricerca nella libreria a XLS. NOTA: Le librerie spettrali da cercare insieme al numero di corrispondenze di libreria da visualizzare devono essere preimpostate all'interno del software prima di poter eseguire una ricerca in libreria.</li>
	<li>Il report foglio di calcolo risultante contiene i dati di integrazione per ogni picco e una corrispondenza provvisoria della libreria spettrale per assegnare l'identità. In genere, la corrispondenza qualità/libreria libreria deve essere >80 per accettare l'identificazione provvisoria. Salvare il foglio di calcolo.</li>
	<li>Identificare un picco direttamente dal TIC.<ol>
<li>Scegli il picco di interesse.</li>
		<li>Se il picco è piccolo, ingrandire disegnando una casella intorno al picco tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse, allungare la casella sul picco e rilasciarlo.</li>
		<li>Posizionare la linea del cursore in modo che si trova nel punto più alto del picco (o subito dopo).</li>
		<li>Fare doppio clic sul pulsante destro del mouse e lo spettro di massa per il picco apparirà nella finestra inferiore della schermata di analisi dei dati.</li>
		<li>Per cercare nella libreria spettrale, spostare il cursore in un punto qualsiasi della finestra spettrale e fare doppio clic con il pulsante destro del mouse. I risultati della ricerca nella raccolta verranno visualizzati in una nuova finestra.</li>
		<li>Per rimuovere il rumore di fondo da uno spettro di interesse, fare doppio clic con il pulsante destro del mouse sul picco in questione. Quindi fare doppio clic sul pulsante destro del mouse in un'area senza picchi immediatamente di fronte al picco di interesse. Selezionare cromatogramma | Sottrarre spettri. Lo spettro sottratto verrà visualizzato nella finestra inferiore della schermata di analisi dei dati e mostrerà '(-)' accanto ai dati SCAN nell'intestazione della finestra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wyatt, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWyatt%2C+TD+%22Pheromones+and+Animal+Behavior%3A+Chemical+Signals+and+Signatures%22">Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).</li>
<li>Heymann, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neglected+sense-olfaction+in+primate+behavior%2C+ecology%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution.</a> American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).</li>
<li>Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22secret%22+in+secretions%3A+Methodological+considerations+in+deciphering+primate+olfactory+communication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication.</a> American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).</li>
<li>Vaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sternal+gland+scent-marking+signals+sex%2C+age%2C+rank+and+group+identity+in+captive+mandrills%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills.</a> Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).</li>
<li>Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dung+odours+signal+sex%2C+age%2C+territorial+and+oestrous+state+in+white+rhinos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).</li>
<li>Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+phylogenetic+signal+in+milliped+chemical+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Systematics+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses.</a> Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).</li>
<li>Kimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+substances+in+feces%2C+urine+and+urine-marked+feces+of+feral+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses.</a> Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).</li>
<li>Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+signals+during+pregnancy%3A+a+possible+chemical+basis+for+mother-infant+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition.</a> Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+of+scent-gland+secretions+in+an+Old+World+monkey+%28Mandrillus+sphinx%29%3A+influence+of+sex%2C+male+status%2C+and+individual+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity.</a> Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odour+signals+MHC+genotype+in+an+Old+World+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Odour signals MHC genotype in an Old World monkey.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).</li>
<li>Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawliszyn%2C+J+%22Solid+phase+microextraction%3A+theory+and+practice%22">Solid phase microextraction: theory and practice</a>. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).</li>
<li>Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+scent-marking+in+captive+red-ruffed+lemurs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs.</a> American Journal of Primatology. 81 (1), 22951(2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'uso di campioni di controllo, sia controlli ambientali creati al momento della raccolta dei campioni che spazi vuoti del sistema, sono fondamentali per l'interpretazione dei campioni di marchio di profumo. Tutti i picchi attribuiti all'ambiente di campionamento o al sistema strumentale devono essere esclusi dai campioni di marchio di profumo in modo che solo i picchi di interesse siano inclusi in qualsiasi interpretazione. Questi controlli possono anche svolgere un ruolo nella valutazione e nel monitoraggio dello "stat...

Si sa molto poco dei cambiamenti chimici alla base dei segnali olfattivi negli animali1,anche a causa delle sfide metodologiche nella registrazione e quantificazione dei profili chimici volatili degli odori2. Ci sono diverse potenziali insidie quando si lavora con matrici chimiche altamente complesse; questi includono durante il campionamento e l'analisi dei campioni di odore3.
Al Rosalind Franklin Science Center, Università di Wolverhampton, stiamo intraprendendo l'analisi di odori e segni di profumo per capire come possono essere utilizzati dagli animali. Combiniamo la semiochimica con l'ecologia comportamentale, l'endocrinologia e la citologia per migliorare la nostra comprensione del ruolo svolto dai segnali olfattivi nella comunicazione animale.
Abbiamo sviluppato una metodologia e poi analizzato odori e marcature di una varietà di specie tra cui diversi primati non umani (cioè lemuri coronati, lemuri arruffati di rosso, macachi giapponesi, babbuini d'oliva, scimpanzé) e altri mammiferi (ad esempio gatti, mucche). Abbiamo raccolto e analizzato una varietà di campioni, tra cui urina, feci, capelli e secrezioni di odori di ghiandola profumata. Questi odori e segni di profumo consistono in miscele complesse di composti e quindi qualsiasi metodologia utilizzata per la loro analisi deve includere una qualche forma di tecnica separatoria. Come illustrato, si verificano anche in una serie di matrici che richiedono l'uso di tecniche per estrarre i componenti di interesse.
Studi precedenti di Vaglio et al. In particolare, il campionamento dinamico dello spazio di testa comporta l'eliminazione dello spazio della testa con un volume noto di gas inerte che alla fine rimuove tutti i composti volatili ad eccezione di quelli che mostrano una forte affinità per la matrice del campione (ad esempio, composti polari in campioni acquosi).
Per l'attuale metodologia, abbiamo adottato la tecnica della microesezione in fase solida headspace (HS-SPME) abbinata a GC-MS. In particolare, abbiamo sviluppato e migliorato la metodologia già utilizzata da Vaglioet al.
Le tecniche di estrazione senza solventi sono molto efficaci per analizzare composti piccoli e altamente volatili (che altrimenti possono essere persi facilmente da un campione) perché questi metodi immobilizzano i composti su un supporto di fase stabile e solido. L'HS-SPME utilizza una fibra rivestita con un polimero adsorbente per catturare composti volatili nello spazio della testa del campione o per estrarre composti disciolti per immersione in un fluido biologico acquoso11. Il rivestimento polimerico non lega fortemente i composti, quindi riscaldando nella porta di iniezione del GC possono essere rimossi. Questo metodo è più potente delle tecniche di estrazione dei solventi e anche più efficace del DHS.
Nell'approccio corrente i campioni sono contenuti all'interno di fiale di vetro. Queste fiale vengono riscaldate a una temperatura di 40 °C per simulare la temperatura corporea animale al fine di promuovere i componenti volatili del marchio di profumo per occupare lo spazio della testa del flaconcino. Una fibra SPME, rivestita con 65 μm di polidimetilsiloxano/divinilbenzene (PDMS/DVB) materiale assorbente, è esposta all'ambiente dello spazio della testa e i componenti volatili del campione vengono adsorbiti sulla fibra. Al riscaldamento della fibra nella porta di ingresso di un GC-MS, i componenti volatili vengono desorbiti dalla fibra e quindi separati dal GC. I modelli di frammentazione spettrale di massa sono ottenuti per ogni componente utilizzando la SM. Rispetto a questi spettri di massa rispetto ai database spettrali di massa, può essere possibile identificare provvisoriamente i componenti del marchio di profumo. Attraverso l'uso di un campionatore automatico, siamo in grado di analizzare più campioni in lotti in modo coerente.
Dato che ogni tipo di fibra SPME ha una diversa affinità con le sostanze chimiche polari, la fibra viene solitamente scelta a seconda della polarità e/o del peso molecolare dei composti chimici bersaglio. Inoltre, le condizioni gc vengono modificate a seconda del tipo di colonna GC e delle caratteristiche dei composti chimici bersaglio.
Questa tecnica consente l'analisi semi-quantitativa dei componenti volatili delle marcature olmografiche consentendo la separazione e l'identificazione provvisoria dei componenti nel campione, seguita dall'analisi dei rapporti di area di picco per cercare tendenze che potrebbero significare componenti della marcatura del profumo che possono essere coinvolte nella segnalazione.
I principali punti di forza di questo approccio attuale sono:
<ul style="list-style-type: square;"><li>Intervallo di tipi di campione che possono essere analizzati.</li>
	<li>Non sono richieste complesse preparazione o estrazioni del campione.</li>
	<li>La capacità di analizzare componenti volatili.</li>
	<li>La capacità di separare i componenti di una miscela.</li>
	<li>Per essere in grado di identificare i componenti rilevati.</li>
	<li>La capacità di fornire informazioni semi-quantitative e potenzialmente quantitative sui componenti rilevati.</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td>Fiale per autocampionatore da 10 mL</td><td>Agilent</td><td>5188-5392</td><td>Fiale con tappo a vite da 10 ml e</td></tr><tr><td>tappi per fiale da 18 mm</td><td>Agilent</td><td>8010-0139</td><td>Magnetico con setti in PTFE/silicone</td></tr><tr><td>Autocampionatore</td><td>Agilent</td><td>GC120 PAL Autocampionatore</td><td></td>Colonna capillare</tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>HP5-MS</td><td>30 m x 0,25 mm; 0,25 &; micro; m</td></tr><tr><td>Software di analisi dati</td><td>Agilent-ChemStation</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gas cromatografo</td><td>Agilent</td><td>7890B</td><td></td></tr><tr><td>Setti di ingresso</td><td>Agilent</td><td>5182-3442</td><td>Merlin microseal</td></tr><tr><td>Rivelatore selettivo di massa</td><td>Agilent</td><td>5977A</td><td></td></tr><tr><td>Software di reportistica</td><td></td> <td>Microsoft-Excel</td><td></td></tr> <tr><td>Libreria spettrale</td><td>NIST</td><td>-</td><td>NIST/EPA/NIH Libreria spettrale di massa</td></tr> Programma <tr><td>di ricerca della libreria spettrale</td><td>NIST-MS</td><td></td> <td>Search v.2.2</td></tr><tr><td>Splitless Inlet liner</td><td>Agilent</td><td>5190-4048</td><td></td></tr><tr><td>Fibre SPME</td><td>Agilent</td><td>SU57345U</td><td>65 &; m Fibra PDMS/DVB</td></tr></tbody></table>

campionamento e analisi dei segnali di profumo animale

Sampling and Analysis of Animal Scent Signals

Abbiamo sviluppato una metodologia efficace per il campionamento e l'analisi dei segnali di odore, utilizzando la microesezione in fase solida headspace accoppiata alla spettrometria gascromatografia-massa, per capire come possono essere utilizzati nella comunicazione animale. Questa tecnica consente l'analisi semi-quantitativa dei componenti volatili delle secrezioni di odori consentendo la separazione e l'identificazione provvisoria dei componenti nel campione, seguita dall'analisi dei rapporti di area di picco per cercare tendenze che potrebbero significare composti che possono essere coinvolti nella segnalazione. I punti di forza chiave di questo approccio attuale sono la gamma di tipi di campioni che possono essere analizzati; la mancanza di necessità di preparazione o estrazione di campioni complessi; la capacità di separare e analizzare i componenti di una miscela; l'identificazione dei componenti rilevati; e la capacità di fornire informazioni semi-quantitative e potenzialmente quantitative sui componenti rilevati. La limitazione principale alla metodologia riguarda i campioni stessi. Poiché i componenti di interesse specifico sono volatili, e questi potrebbero facilmente andare perduti, o le loro concentrazioni modificate, è importante che i campioni siano immagazzinati e trasportati in modo appropriato dopo la loro raccolta. Ciò significa anche che le condizioni di stoccaggio e trasporto dei campioni sono relativamente costose. Questo metodo può essere applicato a una varietà di campioni (tra cui urina, feci, capelli e secrezioni di odori di ghiandola profumata). Questi odori consistono in miscele complesse, che si verificano in una serie di matrici, e quindi richiedono l'uso di tecniche per separare i singoli componenti ed estrarre i composti di interesse biologico.

A seguito di questo protocollo, abbiamo provvisoriamente identificato un totale di 32 composti chimici volatili dall'analisi di 14 segni di profumo ano-genitale rilasciati spontaneamente su carta filtrante da lemuri arruffati di rosso(Varecia variegata rubra)e confrontato i profili degli odori con le caratteristiche del segnalatore12. All'interno di questi profili erano presenti composti volatili presenti in natura, come idrocarburi, terpeni, alcoli terpenici e chetoni, che includevano co...

Abbiamo sviluppato una metodologia efficace per il campionamento e l'analisi dei segnali di odore al fine di capire come possono essere utilizzati nella comunicazione animale. In particolare, utilizziamo la microesezione a fase solida headspace abbinata alla spettrometria gascromatografia-massa per analizzare i componenti volatili degli odori animali e dei segni olfatto.

Campionamento e analisi dei segnali di profumo animale

We have developed an effective methodology for sampling and analysis of odor signals, by using headspace solid-phase microextraction coupled with gas ...

Il ruolo svolto dall'odore nella comunicazione animale è attualmente sottovalutato e così sottovalutato. In particolare si sa molto poco dei cambiamenti chimici alla base dei segnali olfattivi negli animali, compresi gli esseri umani. E ciò è dovuto anche a sfide metodologiche, alla registrazione e alla quantificazione di composti chimici degli odori utilizzati dagli animali per comunicare.Ci sono diverse potenziali sfide quando si lavora con miscele chimiche altamente complesse e queste includono anche quando si campiona e si analizzano i campioni di odore. Stiamo conducendo l'analisi degli odori utilizzati dagli animali per capire come possono essere utilizzati da loro quando comunicano tra loro. Abbiamo combinato la citochimica con l'endocrinologia bioecologia e la citologia per migliorare la nostra comprensione del ruolo svolto dall'odore nella comunicazione animale.Per la nostra attuale metodologia a Wolverhampton, abbiamo adottato la tecnica della microstruttura in fase solida Headspace accoppiata con spettrometria di massa gascromatografica, costruita su e una metodologia invisibile sono utilizzate in passato. Gli odori campione vengono raccolti in uno dei seguenti modi. Uno, odori campione rilasciati spontaneamente da soggetti di studio abituati.Ad esempio, i primati dello zoo raccolgono secrezioni di odore di ghiandola profumata mediante marcatura del profumo su carta da filtro sterile o campioni di urina direttamente in fiale. Due, dopo aver allenato i soggetti dello studio utilizzando rinforzo positivo raccolgono secrezioni di odore strofinando lo sguardo profumato con tamponi di cotone sterili. Tre, dopo la sedazione dei soggetti dello studio, raccolgono secrezioni di odore strofinando ghiandole profumate con tamponi di cotone sterili, da campioni in viti sterili da 10 millilitri con cappuccio, flaconcini di vetro trasparente e guarnizione con tappi con viti che incorporano il settore del silicone P T F E.Conservare immediatamente le fiale a meno 20 gradi Celsius. Si noti che è fondamentale utilizzare dispositivi di protezione individuale puliti come guanti in nitrile durante il campionamento. Cambiare spesso i guanti evitare il contatto diretto della pelle con campioni e fiale.Si preferisce utilizzare fiale nuove di zecca. Tuttavia, in caso di fiale usate, è fondamentale pre-pulire le fiale e quindi utilizzare lo stesso protocollo. Prendi gli spazi vuoti ambientali ogni volta che vengono raccolti segni di profumo.Eseguire questa operazioni esponendo all'ambiente una carta da filtro o un batuffolo di cotone inutilizzato e flaconcini durante il campionamento. I campioni vengono preparati sul campo. Per una carta filtrante marcata profumata tagliare un quadrato di circa 10 millimetri dalla carta e posizionare in una fiala di spazio della testa sormontata da una vite da 10 millilitro.Per un tampone, tagliare la testa del tampone all'estremità dell'albero del tampone e posizionarlo in una fiala dello spazio della testa. Dopo che ogni campione è stato preparato smaltire o pulire l'uso della lama per tagliare il supporto di campionamento, con un'appropriata salvietta antibatterica e o alcool e asciugare accuratamente. Conservare tutti i campioni a meno 20 gradi celsius.Si noti che i campioni devono essere conservati a meno 20 gradi Celsius, tuttavia, nel negozio sul campo al più basso è possibile la temperatura e trasferire a meno 20 gradi Celsius alla prima opportunità. Prima dell'analisi rimuovere i campioni dal congelatore e permettere di camminare naturalmente a temperatura ambiente per almeno un'ora. Impostare i metodi analitici sul GCMS come segue per le condizioni di analisi SPMS seguire le istruzioni del produttore per condizionare le fibre SBME prima del primo utilizzo.È fondamentale che l'assieme SBME sia installato correttamente nel campionatore automatico e che sia allineato all'unità di condizionamento della fibra dei vassoi del campionatore automatico e alla porta di ingresso GC. Un allineamento errato potrebbe causare danni o distruzione della fibra Sbme. Assicurarsi che l'alimentazione di gas persico all'unità di condizionamento della fibra sia accesa.Per migliorare la coerenza del tempo di conservazione del campione, il metodo analitico è il tempo di conservazione bloccato, aggiungere i flaconcini campione al vassoio del campionatore automatico posizionare una fiala vuota dello spazio della testa per fungere da vuoto di sistema nella prima posizione del vassoio del campionatore automatico. Posizionare il vuoto ambientale nella seconda posizione, quindi posizionare tutti i campioni rimanenti per l'analisi nelle posizioni successive del vassoio del campionatore automatico. Creare una sequenza analitica per analizzare ogni campione all'interno del vassoio del campione.Nella schermata iniziale del cacciatore di massa, selezionate la sequenza per la barra dei menu e quindi la sequenza di caricamento dal menu a discesa. Verrà visualizzata una tabella di sequenza vuota che completerà la tabella delle sequenze per tutti gli spazi vuoti e gli esempi inserendo le informazioni appropriate, ad esempio come tabella di sequenza completata. Si noti che le informazioni esatte per la tabella di sequenza dipenderanno dalla formattazione dei laboratori della tabella.Le informazioni minime includerebbero in genere il nome del campione di esempio, il percorso del file e il metodo analitico del numero e il percorso del file di dati e l'allocazione del nome di un file di dati corrispondente al nome di esempio invecchiato per l'elaborazione dei dati futuri. Ulteriori campioni possono essere aggiunti alla sequenza durante l'analisi. Eseguite la sequenza selezionando la sequenza dalla barra dei menu e quindi eseguite la sequenza.Dopo l'analisi, i campioni sono stati restituiti al congelatore il prima possibile. Si noti che potrebbe essere possibile rianalizzare i campioni. Ma va notato che alcuni componenti volatili potrebbero essere stati completamente estratti durante l'analisi iniziale e alcuni composti potrebbero aver subito una decomposizione termica e batterica a 40 gradi Celsius.Pertanto, il risultato nel cromatogramma potrebbe non essere completamente rappresentativo della marcatura del profumo originale. L'analisi iniziale dei dati include l'integrazione di cromatogrammi per ottenere il tempo di conservazione e i dati dell'area di picco insieme all'identificazione provvisoria dei picchi utilizzando il software della stazione cam e i database spettrali di massa del nido. L'analisi dei dati può essere effettuata manualmente o con un metodo semi-automatizzato.Se si utilizza il metodo semi-automatizzato, a volte è utile intraprendere un certo grado di analisi manuale dei dati per verificare le identificazioni provvisorie. Per avviare l'analisi dei dati, aprire il file di dati facendo clic sul file appropriato nella barra di spostamento sinistra. Il cromatogramma ionico totale TIC verrà visualizzato nella finestra superiore della schermata di analisi dei dati.Per integrare il TIC utilizzando l'integratore RTE, selezionare prima il cromatogramma dalla barra dei menu, quindi selezionare integratore dal menu a discesa che viene visualizzata una casella pop-up e scegliere l'integratore RTE. Tornare al menu del cromatogramma e ora selezionare Integra. Per regolare i parametri di integrazione in modo da integrare picchi o un rumore di base superiore a tre volte superiore, selezionare nuovamente il cromatogramma dalla barra dei menu e quindi i parametri di integrazione di MS Signal dal menu a discesa.Nella casella pop-up, regolare l'area di picco minima in base alle esigenze 1.0 produce risultati accettabili nei nostri esempi. Per identificare i picchi e generare un report riepilogativo, selezionare esporta report dalla barra dei menu e quindi creare report sui risultati della ricerca in XLS. Si noti che le librerie spettrali da cercare insieme al numero di corrispondenze di libreria da visualizzare devono essere preimpostate all'interno del software prima di poter eseguire una ricerca in libreria.Il report foglio di calcolo risultante contiene i dati di integrazione per ogni picco e una corrispondenza provvisoria della libreria spettrale per assegnare l'identità. In genere la qualità della libreria o la corrispondenza della libreria deve essere maggiore di 80 per accettare l'identificazione provvisoria. Salvare il foglio di calcolo.Per identificare un picco direttamente dal TIC, scegli il picco di interesse. Se il picco è piccolo, ingrandisci disegnando una casella intorno al picco, tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse allungare la casella sul picco e rilasciare il pulsante del mouse. Posizionare la linea del cursore in modo che si trova nel punto più alto del picco o subito dopo.Il doppio clic, il pulsante destro del mouse e lo spettro di massa per il picco appariranno nella finestra bassa della schermata di analisi dei dati. Per eseguire una ricerca in una libreria spettrale, spostare il cursore in un punto qualsiasi della finestra spettrale e fare doppio clic con il pulsante destro del mouse, i risultati della ricerca della libreria verranno visualizzati in una nuova finestra. Per rimuovere prima il rumore di fondo da uno spettro di interesse, fare doppio clic con il pulsante destro del mouse sul picco in questione, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse in un'area senza picchi immediatamente davanti al picco di interesse, fare clic sul pulsante di sottrazione nella barra multifunzione del menu o selezionare cromatogramma per la barra dei menu e quindi sottrarre gli spettri dal menu a discesa.Lo spettro sottratto verrà visualizzato nella finestra inferiore della schermata di analisi dei dati e mostrerà un trattino accanto ai dati di scansione nell'intestazione della finestra. A seguito di questo protocollo, abbiamo provvisoriamente identificato un totale di 32 composti chimici volatili dall'analisi di 14 segni di profumo genitale rilasciati spontaneamente su carta da filtro da lemuri arruffati rossi e confrontato profili di odori con caratteristiche del segnalatore composti volatili presenti naturalmente come idrocarburi, terpeni, alcoli e chetoni Turpin erano presenti all'interno di questi profili e includono i composti che in precedenza erano stati trovati per agire come ormoni sessuali e segnali di fitness in altre specie animali. I composti che sono stati provvisoriamente identificati sono elencati nella tabella uno.I cromatogrammi rappresentativi uno da un controllo e uno da un segno di profumo di Lima sono mostrati nella figura uno. Il numero e l'abbondanza relativa dei componenti variavano da campione a campione tra diverse materie di studio. Tuttavia, sei composti etichettati da A a F sul cromatogramma erano presenti in tutti i campioni.Questi composti sono stati piegati rispettivamente in altezza all'isola di E un paracristalismo esanale sei paramentha due otto coloranti uno due pinene quattro e pentodecano. I risultati di questo studio hanno suggerito che i lemuri arruffati rossi usano la marcatura inviata per trasmettere informazioni sul sesso e sull'età femminile con un marchio no genitale che gioca un ruolo nella comunicazione socio-sessuale. Un altro risultato rappresentativo dopo l'uso di questo protocollo è stato il nostro studio della pubblicità della fertilità da parte di babbuini di olive femminili.Abbiamo identificato un totale di 74 composti volatili dall'analisi di 395 campioni di odore vaginale di babbuino femminile. Questi includevano una serie di composti volatili odorosi presenti in natura come chetoni, alcoli, aldeidi, terpeni, acidi grassi volatili e idrocarburi. I cromatogrammi tipici usano per confrontare campioni di odori vaginali di troll e babbuini femminili di periodi fertili e non fertili sono mostrati nella figura due.Esaminiamo le relazioni tra profili di odore vaginale e ricettività sessuale dei babbuini femminili. I nostri risultati hanno mostrato che la quantità totale di odore vaginale differisce con la fertilità suggerendo che l'odore potrebbe svolgere un ruolo nel segnalare la fertilità del babbuino femminile. Abbiamo anche trovato differenze nell'odore vaginale tra i tipi di gruppo, ma non siamo stati in grado di distinguere gli effetti della composizione di gruppo, dell'età femminile.Sono i vantaggi combinati del campionamento e dell'uso del GCMS. Quindi, l'utilizzo della micro estrazione in fase solida dello spazio della testa consente di analizzare una vasta gamma di campioni diversi utilizzando GCMS. Siamo in grado di separare i componenti di queste marcature complesse e quindi identificare ciascuno di questi singoli componenti usando lo spettrometro di massa.E poi, l'intera tecnica combinata è molto potente e ci dà molte informazioni su questi segni di profumo, che in passato ci sarebbe stata molta estrazione della preparazione del campione necessaria per poter ottenere i risultati.

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