Convalida del sequenziamento dei nanopore dell'intero genoma, usando Usutu Virus come esempio
11 marzo 2020
In precedenza abbiamo convalidato un protocollo per il sequenziamento del virus USsutu intero genoma basato sull'amplicon (USUV) su una piattaforma di sequenziamento nanoporo. Qui, descriviamo i metodi utilizzati in modo più dettagliato e determiniamo il tasso di errore della cella di flusso nanopora R10.
Usiamo il sequenziamento genetico dei virus per cercare di capire da dove provengono i virus e come si diffondono. E per usare questi dati in tempo reale, per esempio durante un'epidemia, dobbiamo capire esattamente quanto siano accurati i dati che forniamo. I principali vantaggi di queste tecniche sono che è relativamente economico, è veloce e consente la codifica di base in tempo reale che può essere utilizzata per il sequenziamento sul campo.
Questo metodo può essere utilizzato per la generazione tempestiva di dati di sequenza che, ad esempio, possono essere utilizzati per determinare l'origine di una moltitudine di agenti patogeni. Questa tecnica può essere complessa per gli utenti per la prima volta ed è richiesta la conoscenza unix di base. Soprattutto per l'installazione dei diversi pacchetti software.
La visualizzazione di questo metodo aiuterà gli utenti a determinare il tasso di errore dei loro protocolli di sequenziamento specifici. E per rispondere alle domande di ricerca. L'esecuzione della sequenza viene avviata su un MinION collegato al MinIT.
Dopo aver preformato una sequenza sulla piattaforma Nanopore, caricare il carico di dati in Porechop. Per prevenire la contaminazione e migliorare la precisione, utilizzare il flag richiedi carattere di sottolineatura due, contrassegnare i codici a barre di sottolineatura e inserire il comando come indicato. Dopo il de-multiplexing, utilizzare cutadapt per rimuovere sequenze primer e sequenze con una lunghezza inferiore a 75 nucleotidi usando il comando come indicato.
Utilizzate Minimap2 per mappare le letture della sequenza de-multiplex rispetto al pannello di ceppi di riferimento distinti utilizzando Minimap2. E usa Samtools per generare una sequenza di consenso. Per gli allineamenti basati su riferimenti, è essenziale preformare un'esplosione e cercare con la sequenza di consenso generata per identificare il ceppo di riferimento più vicino.
Ripetere quindi l'allineamento basato sul riferimento con la deformazione di riferimento più vicina come riferimento. Per determinare la copertura di lettura richiesta per compensare il profilo di errore nel sequenziamento nanopore, selezionare la mappatura della sequenza a un'Amplicon e utilizzare Minimap2 per mappare le letture del Nanopore rispetto a questa Amplicon. Utilizzare Samtools per selezionare solo il mapping delle letture in Amplicon26 e per convertire il file bam in fastq utilizzando i comandi indicati.
Selezionare casualmente sottoinsiemi di, ad esempio, 200 letture di sequenza mille volte. Tutte le letture di sequenza selezionate casualmente vengono allineate ad Amplicon26. Utilizzare KMA per mappare le letture della sequenza e generare immediatamente una sequenza di consenso utilizzando le impostazioni ottimizzate per il sequenziamento del Nanopore come indicato dal nanoflag BC.
Per ispezionare le sequenze di consenso generate, utilizzare i comandi come indicato. Per visualizzare il tasso di errore nelle statistiche dot txt sotto l'intestazione, il tasso di errore non corrisponde alle basi mappate, utilizzare il comando come indicato. Per visualizzare il numero di indeli visualizzati sotto le indelienze titolo per ciclo, utilizzare il comando come indicato.
Utilizzando la cella di flusso più recenti in combinazione con il flip-flop del colore di base, una copertura di lettura di 40 volte si traduce in risultati identici rispetto al sequenziamento Illumina. Una copertura di lettura di 30 volte si traduce in un tasso di errore dello 0,02% che corrisponde a un errore ogni 585.000 nucleotidi sequenziati. Mentre una copertura di lettura di 20 volte si traduce in un errore ogni 63, 529 nucleotidi sequenziati.
Una copertura di lettura di 10 volte si traduce in un errore ogni 3.312 nucleotidi sequenziati. Il che significa che oltre 3 nucleotidi per quattro genoma del virus Usutu sono chiamati sbagliati. Con una copertura di lettura superiore a 30 volte, non si osservano indeli.
Una copertura di lettura di 20 volte si traduce nei rilevamenti di una posizione indelebile, mentre una copertura di lettura di 10 volte si traduce in indeli in 29 posizioni. La cosa più importante da ricordare è che, sebbene non sempre apparente, gli aggiornamenti nel software si verificano frequentemente e possono influenzare i risultati. Ci sono diverse opzioni di software da utilizzare.
Abbiamo dimostrato i programmi più comunemente usati. Ma software diversi e diverse versioni di tali software possono comportare risultati diversi. Vi abbiamo mostrato un esempio di come controlliamo la qualità dei dati di sequenza che generiamo.
E questo è fondamentale per un supporto affidabile alle epidemie.
Panoramica
Questo studio descrive un protocollo validato per il sequenziamento dell'intero genoma del virus Usutu (USUV) basato su amplificazione mediante una piattaforma di sequenziamento nanopori. I metodi sono descritti in dettaglio, con particolare attenzione alla determinazione del tasso di errore associato alla flow cell R10 nanopori.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Virologia
- Genomica
- Tecnologia del sequenziamento
Sfondo
- Comprensione dell'origine e della diffusione dei virus attraverso il sequenziamento genetico.
- Importanza della precisione dei dati durante le epidemie.
- Vantaggi del sequenziamento nanopori: economicità e velocità.
- Complessità per gli utenti alle prime armi, che richiede conoscenze di base di Unix.
Scopo dello studio
- Fornire una metodologia dettagliata per il sequenziamento di USUV.
- Valutare i tassi di errore del sequenziamento nanopori.
- Migliorare l'accuratezza dei protocolli di sequenziamento.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di MinION e MinIT per il sequenziamento.
- Elaborazione dei dati con Porechop e cutadapt per la rimozione dei primer.
- Mappatura delle sequenze con Minimap2 e generazione di sequenze consenso con Samtools.
- Valutazione dei tassi di errore e delle posizioni di indel in base a coperture di lettura variabili.
Risultati principali
- Una copertura di lettura di 30 volte produce un tasso di errore dello 0,02%.
- Una copertura più elevata (superiore a 30 volte) non mostra indel.
- Una copertura inferiore comporta un aumento di errori e indel.
- Gli aggiornamenti del software possono influenzare in modo significativo i risultati del sequenziamento.
Conclusioni
- Il sequenziamento con nanopori è un metodo valido per il supporto in tempo reale durante un focolaio.
- Comprendere i tassi di errore è fondamentale per generare dati affidabili.
- Diverse versioni di software possono produrre risultati differenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il sequenziamento accurato del genoma virale è essenziale per la risposta immediata alle epidemie e per l'epidemiologia genomica. Comprendere i tassi di errore specifici della piattaforma consente la generazione di dati affidabili per le decisioni sanitarie pubbliche. La validazione del sequenziamento nanopori rispetto a piattaforme consolidate garantisce affidabilità nel tracciamento dei patogeni e nell'analisi della trasmissione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle origini virali e dei percorsi di trasmissione mediante sequenziamento del genoma ad alta fedeltà.
- Valore operativo: Supporta la verifica rapida di ipotesi durante focolai grazie a capacità di sequenziamento portatili e in tempo reale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce flussi di lavoro standardizzati per il sequenziamento del genoma virale basato su amplificazione con valutazione quantificabile del tasso di errore.
- Valore operativo: Facilita la riproducibilità del saggio attraverso soglie definite di copertura della lettura e ottimizzazione dei parametri del software.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Genera sequenze consenso adatte a studi funzionali successivi e alla caratterizzazione antigenica.
- Valore operativo: Consente l'implementazione di linee guida per il sequenziamento scalabili e adattabili a minacce virali emergenti con infrastrutture minime.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro di scoperta virale, dalla rilevazione iniziale alla caratterizzazione genomica, supportando l'identificazione di candidati promettenti nello sviluppo di antivirali mediante un accurato tracciamento delle ceppi.
- Biologia della scoperta: Consente l'identificazione precisa di ceppi virali e il tracciamento delle mutazioni per la riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli terapeutici.
- Screening: Fornisce dati genomici quantitativi e riproducibili, adatti per valutare gli effetti dei composti antivirali sull'evoluzione virale.
- Analisi: Genera metriche sul tasso di errore e frequenze di inserzioni e delezioni (indel) che informano sulle soglie di qualità dei dati per decisioni di avanzamento o interruzione.
- Ricerca traslazionale: Supporta la continuità dal rilevamento di focolai alla validazione preclinica fornendo dati tracciabili sulle linee virali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di sequenziamento portatile applicabile a diverse famiglie virali e reti di sorveglianza geografiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sull'evoluzione virale mediante sequenziamento del consenso corretto per errori.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione tra laboratori grazie a una copertura di lettura definita (30x) e protocolli software per un'accuratezza costante.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo di antivirali fornendo un background genomico affidabile sulle varianti circolanti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei bersagli in base al rischio, basandosi su un'epidemiologia virale geneticamente convalidata.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede una conoscenza di base di Unix per l'installazione del software e l'esecuzione da riga di comando.
- Richiede l'hardware MinION/MinIT e l'accesso a pannelli di ceppi di riferimento per l'allineamento.
- Necessita di supporto bioinformatico interdisciplinare per la standardizzazione dei flussi di lavoro e il controllo delle versioni del software.
- È necessario tenere conto degli aggiornamenti frequenti del software, che potrebbero modificare i profili di errore e i risultati della sequenza consenso.
- L'efficacia dipende dal mantenimento di una copertura minima di lettura (30x) per sopprimere le indel e raggiungere un'accuratezza equivalente a quella di Illumina.
