Name: Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Scopri l'isolamento di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti da cuori di topo per studiare la riparazione tissutale e la fibrosi. Questo metodo garantisce elevata purezza e flessibilità per caratterizzazioni funzionali.

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Gli autori vogliono ringraziare il Dr. Ivo Kalajzic per i topi sMA-GFP. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health (NIH) con il Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the NIH sotto Il numero R21EB019509 (P.P.Y.) e lo Scientist Development Grant dell'American Heart Association sotto il numero 17SDG3630187 (S.S.). Le analisi della citometria di flusso sono state eseguite presso il VUMC Flow Cytometry Shared Resource, supportato dal Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) e dal Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

<ol><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Cardiac+Fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li>
<li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction%3A+From+Inflammation+to+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt1%2Fbetacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li>
<li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+myocardial+infarction%3A+a+role+in+inflammation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li>
<li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((View+from+the+heart%3A+cardiac+fibroblasts+in+development%2C+scarring+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li>
<li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li>
<li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Fibrosis%3A+The+Fibroblast+Awakens%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts%3A+implications+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li>
<li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+fibroblasts+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li>
<li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li>
<li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li>
<li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+fibroblast%3A+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li>
<li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts%3A+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I fibroblasti sono un gruppo eterogeneo di cellule, identificato da diversi indicatori. I marcatori proteici che sono stati utilizzati per identificare i fibroblasti sono il recettore del dominio discoidina 2 (DDR2), la fibronectina, la vimentina, il collagene I e III e Thy115,16,17,18,19,20. Mentre la vimentina è stata utili...

I fibroblasti cardiaci, cellule di origine mesenchymica, svolgono un ruolo significativo nel mantenimento della conduzione elettrica e delle forze meccaniche nel cuore oltre al mantenimento dell'architettura cardiaca durante l'omeostasi1. A seguito di lesioni, queste cellule vengono attivate, espanse e producono proteine a matrice extracellulare (ECM)2. Molti studi preclinici hanno rivelato i fibroblasti come regolatori cellulari critici che mantengono l'integrità strutturale di un cuore ferito3 così come le principali cellule efanti responsabili della produzione incontrollata e della deposizione delle proteine ECM, con conseguente formazione rigida di cicatrici e insufficienza cardiaca4. I fibroblasti sono un gruppo eterogeneo di cellule, il che rende difficile sezionare la loro funzione riparativa da proprietà maladattive pro-fibrotiche. Recentemente, è stata definita l'eterogeneità funzionale di due distinti sottotipi fibroblasti a seguito di lesioni miocardiche, indicando la possibilità di isolare diversi sottotipi di fibrolazione e studiare il loro ruolo nella guarigione delle ferite5.
Ottenere una popolazione fibroblasta pura è fondamentale per delineare il loro ruolo funzionale nella riparazione e nella fibrosi. Tuttavia, la presenza di più marcatori fibroblasti che riconoscono altri tipi di cellule rendono difficile isolare una popolazione fibroblasta sostanzialmente pura6. Diversi studi eleganti hanno escogitato modi intelligenti per isolare i fibroblasti cardiaci dal miocardio illeso e ferito. Il metodo più popolare e consolidato per arricchire i fibroblasti è attraverso l'adesione selettiva dopo la digestione del tessuto enzimatico7.
Inoltre, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) di fibroblasti basati su antigeni della superficie cellulare è stato descritto con successo8. Nello studio, a seguito della digestione ezimatica, le cellule mesenchymal sono state ordinate come lignaggio-negativo (Lin: Ter119-CD45-CD41)e gp38-positivo (gp38)dal cuore del mouse. Lecellule gp38 sono state confermate come fibroblaste basate sulla loro co-espressione di col1-1 e di altri marcatori mesenchymici. Anche se la maggior parte della digestione tissutale è completata dopo aver sezionato il ventricolo in un piatto di Petri, un recente studio ha studiato l'uso di una perfusione diretta dell'enzima dell'ago sinistro del ventricolo sinistro per isolare i miociti e i non miociti che includono fibroblasti9. I fibroblasti sono stati poi isolati per adesione selettiva in questo caso.
Questo protocollo descrive l'isolamento e l'arricchimento dei fibroblasti utilizzando tre metodi. Il primo è un metodo già stabilito che prevede l'adesione selettiva dei fibroblasti a seguito della digestione enzimatica. Il secondo metodo viene utilizzato per isolare principalmente il muscolo alfa liscio indotto da lesioni che esprime miofibroblasti. Il terzo metodo prevede l'esaurimento magnetico sequenziale di una sospensione cellulare cardiaca di ematopoietiche ed endoteliale. In seguito all'esaurimento, i fibroblasti/miofibroblasti sono isolati in base alla presenza dell'antigene MEFSK4 utilizzando perline magnetiche. Recentemente, MEFSK4 è stato descritto come un antigene presente sui fibroblasti quiescenti e attivati, rendendolo un marcatore adatto per l'identificazione e l'isolamento del fibroblasto. Naturalmente, tutti i metodi qui descritti hanno limitazioni uniche. Si raccomanda quindi di verificare la purezza della popolazione di cellule isolate mediante analisi del flusso, immunostaining e PCR semi-quantitativo in tempo reale. Tuttavia, queste metodologie possono essere ampliate, e ulteriori marcatori possono essere aggiunti al fine di escludere altre popolazioni contaminate prima di utilizzare le popolazioni di fibroblasti e miofibromi per esperimenti cruciali.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antimicotico (Amfotericina B-solubilizzata; Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>A9528</td><td></td></tr><tr><td>Albumina di siero bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro</td><td></td><td></td><td></td>di calcio</tr><tr><td>Citrato Tampone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miscela di collagenasi (Liberase Blendzyme 3 TH)</td><td>Roche Applied Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDI acqua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Acqua <td></td><td></td><td></td><td>deionizzata</td></tr><tr><td>DMEM-F12 con L-Glutammina e tecnologie HEPES</td><td>Life</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I(20U/mL)</td><td>BioRad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (dPBS) di Dulbecco senza Ca2+ e Mg2+</td><td>Gibco</td><td>13190-144</td><td></td></tr><tr><td>70% Bloccante FC dell'etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(purificato anti-topo CD16/CD32)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>10% di siero</td><td></td><td></td><td></td>di capra</tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con Ca2+ e Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-Ci</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Henseleit Polvere tampone</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Mycoplasma profilattico (Plasmocin)</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific 15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x tampone per lisi dei globuli rossi</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Mezzi</td><td></td> <td>di montaggio a lenta dissolvenza</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato</td><td></td><td></td><td></td>di sodio</tr><tr><td>TGF&beta;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tipo 1 Collagene</td><td></td><td></td><td></td> di Ratto</tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7AAD (stock: soluzione da 1 mg/mL in DMSO)</td><td>Sonde molecolari</td><td>A1310</td><td>diluizione = 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>CD45-APC</td><td>BD Bioscience</td><td>559864</td><td>diluizione = 1:200; RRID = AB_398672</td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>BD Bioscience</td><td>553373</td><td>diluizione = 1:200; RRID = AB_394819</td></tr><tr><td>diluizione CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>= 1:250; RRID = AB_394816</td></tr><tr><td>diluizione 553076 CD45</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>= 1:250; RRID = AB_394606</td></tr><tr><td>COL 1&alfa; 1</td><td>MD Bioproducts</td><td>203002</td><td>diluizione = 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>Colorante fantasma viola 510 (Formulazione: 1 uL/test in DMSO)</td><td>Diluizione Tonbo Biosciences</td><td>13-0870</td><td>= 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>Capra anti-topo Alexa Fluor 488</td><td>Sonde molecolari</td><td>A11029</td><td>diluizione = 1:200; RRID = AB_138404</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio-Cy3</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>diluizione = 1:200; RRID = AB_2795952</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio-FITC</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td><td>711-165-152</td><td>diluizione = 1:200; RRID = AB_2307443</td></tr><tr><td>Capra anti-ratto Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11006</td><td>diluizione = 1:200; RRID = AB_2534074</td></tr><tr><td>Capra anti-ratto Alexa Fluor 647</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A21247</td><td>diluizione = 1:200; RRID = AB_141778</td></tr><tr><td>Periostina</td><td>Santa Cruz</td><td>SC67233</td><td>diluizione = 1:100; RRID = AB_2166650</td></tr><tr><td>diluizione Vimentin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2258</td><td>= 1:200; RRID = AB_261856</td></tr><tr><td>&alfa;-actina muscolare liscia (&alfa;SMA)</td><td>Diluizione Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td>= 1:1000; RRID = AB_476701</td></tr><tr><td>Proteina specifica dei fibroblasti 1 (FSP1)</td><td>Millipore 07-2274</td><td>07-2274</td><td>diluizione = 1:100; RRID = AB_10807552</td></tr><tr><td>CD45 Perle magnetiche</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Perle magnetiche</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-087-418</td><td></td></tr><tr><td>Celle anti-alimentatore-APC (MEFSK4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-900</td><td>diluizione = 1:100; RRID = AB_2660619</td></tr><tr><td>perline anti-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-103-034</td><td>diluizione = 1:100; RRID = AB_2661598</td></tr><tr><td>Donkey anti-rat Alexa Fluor405</td><td>Abcam</td><td>ab175670</td><td>diluizione = 1:100</td></tr><tr><td>anti-AN2/NG2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-455</td><td>diluizione = 1:11; RRID = AB_2651235</td></tr><tr><td><forte>Altri materiali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari da 10 cm2</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Filtro cellulare</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Provette per citometria a flusso</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Forcipe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lama a lama singola</td><td>PAL</td><td>62-0177</td><td></td></tr><tr>Forbici <td></td><td></td><td></td><td>chirurgiche</td></tr><tr><td>GFP-&alpha; SMA Reporter Topi Separatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS Campo</td><td></td><td></td><td></td>magnetico</tr><tr><td>MACS Colonna di</td><td></td><td></td><td></td>separazione</tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td><td>Qaigen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento totale micro acquoso Ambion RN1931</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Piastra</td><td></td><td></td><td></td>a 48 pozzetti</tr><tr><td>30G Ago</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 Macchina per citometria a flusso laser (BD LSRFortessa)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 Flusso laser Macchina per citometria (BD FACSAria III)</td><td>BD Biosciences Software per l'acquisizione dei dati di</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flusso (BD FACSDiva Software v8.0a)</td><td>BD Biosciences Software per l'analisi dei dati di</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flusso (FlowJo Software)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

La fibrosi cardiaca in risposta a lesioni è una risposta fisiologica alla guarigione delle ferite. Sono stati compiuti sforzi per studiare e colpire i sottotipi di fibroblasti che mitigano la fibrosi. Tuttavia, la ricerca sul fibroblasto è stata ostacolata a causa della mancanza di marcatori fibroblasti universalmente accettabili per identificare i fibroblasti quiescenti e attivati. I fibroblasti sono una popolazione cellulare eterogenea, che li rende difficili da isolare e caratterizzare. Il protocollo presentato descrive tre diversi metodi per arricchire i fibroblasti e i miofibroblasti dai cuori dei topi illesi e feriti. L'utilizzo di un protocollo standard e affidabile per isolare i fibroblasti consentirà lo studio dei loro ruoli nell'omeostasi e nella modulazione della fibrosi.

Schema di gating di flusso che dimostra l'isolamento del miofibroblasto usando i topi dei reporter sMA-GFP I cuori illesi non mostravano gFP rilevabili: cellule nel modello di topo del reporter SMA-GFP; quindi, sono stati utilizzati per stabilire un cancello per il segnale di fondo del canale GFP post-compensazione (Figura 2). Lecellule sono state ordinate in base alla presenza di espressione GFP dal ventricolo sinistro ferito 10 giorni dopo l'MI. Un...

Ottenere una popolazione pura di fibroblasti è fondamentale per studiare il loro ruolo nella riparazione delle ferite e nella fibrosi. Descritto qui è un metodo dettagliato per isolare i fibroblasti e i miofibroblasti da cuori di topo feriti e feriti, seguiti dalla caratterizzazione della loro purezza e funzionalità da immunofluorescence, RTPCR, smistamento delle cellule assistite dalla fluorescenza, e contrazione del gel di collagene.

Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Questo protocollo ci consente di isolare le popolazioni di fibroblasti attivati sia quiescenti che indotte da lesioni con purezza significativa. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua flessibilità per l'improvvisazione. Per il flusso, così come l'isolamento basato sulle perline, si possono incorporare anticorpi contro le cellule contaminanti per escluderle dalle cellule bersaglio isolate.Questa tecnica viene utilizzata principalmente per l'isolamento dei fibroblasti cardiaci. Tuttavia, può essere utilizzato per isolare i fibroblasti da altri tessuti. A dimostrare questa procedura saranno Meiling Melzer, uno stagista universitario, e David Beier, un assistente di ricerca del mio laboratorio.Per preparare una piastra di sei porvili per conservare sei cuori durante la dissezione, erogare due millilitri di KHB freddo in ogni pozzo e posizionare il piatto sul ghiaccio. Spruzzare il corpo con il 70% di etanolo. Orientalo in modo che il lato ventrale sia rivolto verso lo sperimentatore.Aggiungere le appendici per evitare interferenze. Senza perforare il fegato, aprire la pelle addominale e il muscolo. Tagliare verticalmente verso lo sterno, aprendo con cura il torace senza perforare il cuore.Successivamente, continua a tagliare la gabbia toracica per esporre il cuore. Usando le forcelle, sollevare delicatamente il cuore dal torace, tagliando via qualsiasi polmone o tessuto in eccesso attaccato all'esterno del cuore. Separare il ventricolo sinistro.Per ogni dissezione, posizionare il ventricolo in un pozzo separato della piastra a sei pozzi. In primo luogo, utilizzare le forcep per spremere e agitare ripetutamente il ventricolo nel KHB per rimuovere il sangue in eccesso. Trasferire il ventricolo su una piastra pulita, sterile, quadrata di 10 centimetri.Successivamente, utilizzando una lama a taglio singolo, tritare rapidamente il ventricolo in piccoli pezzi. Aggiungere un millilitro di cocktail di digestione della collagenasi e continuare a tritare. Quando i pezzi sono abbastanza piccoli da essere trasferimento con una micropipetta da un millilitro, trasferirli in un tubo conico da 50 millilitri.Lavare il piatto due volte con due millilitri di cocktail e trasferire il lavaggio sul tubo. Incubare il tubo per 30 minuti e rimorsi le cellule come descritto nel manoscritto usando una pipetta da cinque millilitri. Dopo la resuspensione iniziale, incubare le cellule per 15 minuti e rimorsi di nuovo usando una pipetta da 10 millilitri.Quindi, posizionare un colino a celle di 40 micrometri sopra un nuovo tubo conico da 50 millilitri e innescare il colino bagnarlo con uno o due millilitri di KHB. Aggiungere 25 millilitri di KHB alla sospensione della digestione e rimorsi. Filtrare la sospensione attraverso il filtro, sostituendo il filtro in base alle esigenze.Centrifugare il filtrato a 400 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 1 tampone di lisi RBC utilizzando cinque millilitri di tampone per cuore. Dopo aver incubato la sospensione per due minuti a temperatura ambiente, centrifugare la sospensione a 400 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente.Rimuovere il supernatante, quindi rimescolare il pellet in un millilitro di KHB. Quindi, aggiungere nove millilitri di KHB alla sospensione. Filtrare la sospensione attraverso un colino a celle primed da 40 micrometri in un nuovo tubo conico da 50 millilitri.Centrifugare il tubo conico a 400 volte g per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di mezzi fibroblasti o PBS. Una volta determinato il numero di cellule, i fibroblasti possono essere isolati dalla sospensione con tre diversi metodi descritti nel manoscritto.Per iniziare l'isolamento mediante placcatura differenziale, preparare una piastra a sei porsi aggiungendo due millilitri di mezzi fibroblasti ad ogni pozzo. Ruotare il piatto per coprire i fondi del pozzo. Se le cellule cardiache del topo sono sospese in PBS, centrifugarle e rimostrarle in un millilitro di mezzi fibroblasti per cuore.Aggiungere un millilitro di sospensione cellulare, l'equivalente di un cuore, ad ogni pozzo. Ruotare la piastra per distribuire uniformemente le cellule. Aggiungere uno o due millilitri aggiuntivi di mezzi fibroblasti per pozzo per un volume totale fino a quattro millilitri per pozzo.Incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore. Poiché i fibroblasti aderirono selettivamente ai pozzi, possono essere isolati rimuovendo e scartando il supporto. Lavare le restanti cellule attaccate con due millilitri di PBS, quindi aggiungere da due a quattro millilitri di mezzi fibroblasti sterili per pozzo.Incubare a 37 gradi fino a confluire, cambiando il supporto ogni due o quattro giorni. Per iniziare l'etichettatura magnetica e la separazione delle cellule ematopoietiche positive al CD45, centrifugare una sospensione delle cellule cardiache del topo a 500 volte g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un millilitro di tampone di equilibrazione.Contare le cellule usando un emocitometro. Dopo aver centrifugato di nuovo le cellule, rimorsi il pellet cellulare nel tampone di equilibrazione. Aggiungere perline magnetiche positive per CD45 e mescolare bene.Incubare per almeno 15 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule aggiungendo tampone di equilibrazione e centrifugando a 500 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il supernatante e contare le cellule usando un emocitometro.Resospendare il pellet in tampone di equilibrazione. Passare la sospensione attraverso un filtro da 40 micrometri per evitare che le aggregazioni cellulari intasano la colonna di separazione. Quindi, posizionare una colonna di separazione nel campo magnetico di un separatore adatto ed equilibrare la colonna con almeno tre millilitri di PBS.Versare la sospensione cellulare attraverso la colonna e raccogliere il flusso-through, che conterrà le celle senza etichetta, in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone di equilibrazione e combinare i lavaggi con il flusso passante. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionare la colonna su un tubo conico da 15 millilitri.Per elutare le celle cd45 positive etichettate, pipettare cinque millilitri di buffer di equilibrazione nella colonna e immergere saldamente la colonna. Centrifugare il tubo di eluente e il tubo di flusso a 500 volte g. Contare le cellule usando un emocitometro.Per completare l'isolamento, seguire i protocolli nel manoscritto per le cellule endoteliali positive cd31 e i fibroblasti positivi mefsk4, che sono simili al protocollo per le cellule cd45-positive. Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza è stato eseguito su singole cellule isolate dai cuori del mouse alfa-SMA-GFP a seguito dell'infarto del miocardio. Uno schema di gating rappresentativo dimostra cellule positive alla GFP che co-esprimono CD31, CD45 o AN2.Nei cuori di topo feriti, una piccola percentuale di cellule endoteliali e cellule ematopoietiche esprimeva GFP. Tuttavia, le cellule GFP-positive/CD31-negative/CD45-negative non esprimevano AN2, un marcatore pericito. Cellule positive alla GFP espresse alfa-SMA, collagene uno alfa, periostina e vimentina.I fibroblasti illesi isolati per adesione selettiva hanno espresso vimentina ma non hanno dimostrato l'espressione di alfa-SMA, periostina o collagene uno alfa. Sia i fibroblasti illesi che quelli attivati hanno espresso l'antigene MEFSK4. Sia i fibroblasti illesi, isolati per adesione selettiva, sia i miofibroblasti, isolati e ordinati dai topi alfa-SMA-GFP, hanno dimostrato la capacità di contrarre collagene.È importante tritare accuratamente il tessuto prima dell'incubazione. Prima della separazione basata su perline, è importante passare la sospensione attraverso un filtro da 40 micrometri per evitare aggregazioni cellulari. Le cellule purificate con questo metodo potrebbero essere ulteriormente purificate usando perline magnetiche associate ad anticorpi specifici periciti per garantire un alto livello di purezza.Con la disponibilità di nuovi anticorpi coniugati con perline, così come topi transgenici reporter, si possono utilizzare queste tecniche per isolare e studiare popolazioni cellulari distinte, non solo fibroblasti.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Adulti miociti cardiaci sono cellule primarie che possono essere isolati da cuori animali e coltivate per diversi giorni. In questo periodo la cultura trasferimento genico adenovirali possono essere usate per esprimere biosensori geneticamente codificato (GEBS) o proteine ​​di fusione fluorescenti. Entrambi gli approcci consentono indagini cellulari mediante microscopia confocale.

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Qui si descrive l'isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l'espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

I principali tipi di cellule aderenti derivati dal muscolo umano sono le cellule miogeniche e i fibroblasti. Qui, le popolazioni cellulari vengono arricchite utilizzando lo smistamento cellulare attivato magneticamente basato sull'antigene CD56. La successiva immunomarcatura con anticorpi specifici e l'uso di tecniche di analisi delle immagini consentono la quantificazione delle caratteristiche citoplasmatiche e nucleari nelle singole cellule.

Isolamento e quantitativa immunocitochimica caratterizzazione di cellule miogeniche primarie e fibroblasti da muscolo scheletrico umano

Presentiamo un protocollo per generare colture primarie di cellule stromali esofagee murine e umane con un fenotipo di miofibroblasto. Le cellule in coltura hanno una morfologia a forma di fuso, esprimono α-SMA e vimentina e mancano di marcatori di superficie delle cellule epiteliali, ematopoietiche ed endoteliali. Le cellule stromali caratterizzate possono essere utilizzate negli studi funzionali delle interazioni epitelio-stromale.

Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano

Il comportamento dei fibroblasti è alla base di uno spettro di entità cliniche, ma rimangono scarsamente caratterizzate, in gran parte a causa della loro intrinseca eterogeneità. La ricerca tradizionale sui fibroblasti si basa sulla manipolazione in vitro, mascherando il comportamento dei fibroblasti in vivo. Descriviamo un protocollo basato su FACS per l'isolamento di fibroblasti cutanei di topo che non richiede colture cellulari.

Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

Sono stati sviluppati e descritti diversi protocolli per l'isolamento di diversi tipi di cellule cardiache da un cuore del topo. Qui viene descritto un protocollo ottimizzato che consente l'isolamento di tipi di cellule cardiache di elevata qualità (cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti) da una singola preparazione, riducendo i costi sperimentali.

Isolamento simultaneo di cardiomiociti di alta qualità, cellule endoteliali e fibroblasti da un cuore di ratto adulto

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC). ARVC isolata può essere utilizzato per la coltivazione di breve e lungo termine. L'isolamento e la coltura di ARVC possono giocare un ruolo chiave nello sviluppo di nuovi regimi di trattamento per malattie cardiache.

Isolamento e coltura dei cardiomiociti di ratto adulto.

Qui, descriviamo una procedura basata su Langendorff, ottimizzata per l'isolamento di singole cellule cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione. Una regolazione manuale della pressione intraluminale delle cavità cardiache è implementata per rendere funzionalmente intatto miociti adatto per studi di accoppiamento eccitazione-contrazione.

Isolamento dei cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione

Presentiamo un protocollo per isolare i fibroblasti adulti primari in modo semplice, veloce e affidabile, performabile dai principianti (ad esempio, gli studenti). La procedura combina la digestione del tessuto enzimatico e l'agitazione meccanica con onde ultrasoniche per ottenere fibroblasti primari. Il protocollo può essere facilmente adattato a specifiche esigenze sperimentali (ad esempio, tessuto umano).

Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni

Un metodo è descritto per l'isolamento simultaneo di miociti e non miociti sia dagli atri che dai ventricoli di un singolo cuore adulto di topo. Questo protocollo si traduce in rese costanti di miociti cardiaci altamente vitali e non miociti e descrive in dettaglio le condizioni ottimali di coltura specifica delle cellule per la fenotipizzazione e l'analisi in vitro.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

Un metodo raffinato di compensazione dei tessuti è stato sviluppato e applicato al cuore adulto del topo. Questo metodo è stato progettato per cancellare il tessuto cardiaco denso e autofluorescente, pur mantenendo la fluorescenza dei fibroblasti etichettata attribuita a una strategia genetica reporter.

Raffinata compensazione dei tessuti basata su CLARITY per l'organizzazione tridimensionale dei fibroblasti nei cuori di topo sani e feriti

Scopri l'isolamento di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti da cuori di topo per studiare la riparazione tissutale e la fibrosi. Questo metodo garantisce elevata purezza e flessibilità per caratterizzazioni funzionali.

Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti

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