Name: Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Impara un metodo efficiente per purificare oligodendrociti e produrre mezzo condizionato per esperimenti di co-coltura con neuroni. Questa tecnica facilita lo studio dei meccanismi molecolari della mielinazione.

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Gli autori desiderano ringraziare Rémi Ronzano per i suoi saggi consigli nel montaggio di manoscritti. Questo lavoro è stato finanziato da ICM, INSERM, sovvenzione della fondazione ARSEP per NSF e Bouvet-Labruyère price.

La cura e l'uso dei ratti in questo esperimento sono conformi alle politiche e agli orientamenti istituzionali (UPMC, INSERM e alla direttiva 86/609/CEE del Consiglio della Comunità europea). Il seguente protocollo è stabilito per una lettiera standard di 12 cuccioli.
1. Preparazione dei flaconi (5 min)
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi il giorno prima della dissezione in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
<ol><li>Rivestire i flaconi 150 cm2 (T150) con tappo filtrante (1 flacone per 2 cuccioli) utilizzando 5 mL di polietilenimina (PEI, 100 mg/L, vedere protocollo nel file supplementare 1).</li>
	<li>Conservare i flaconi a 4 gradi durante la notte.</li>
	<li>Risciacquare i flaconi rivestiti 3 volte con acqua distillata sterile il giorno della dissezione.</li>
</ol>2. Preparazione dei supporti (10 min)
NOTA: Eseguire i passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
<ol><li>Preparare 500 mL di mezzo di coltura, costituito dal mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% del siero di vitello fetale (FCS) e penicillina-streptomycin (100 IU/mL).</li>
	<li>Preparare 20,6 mL del mezzo di digestione enzimatica in un tubo da 50 mL, composto da 20 mL di DMEM, 200 l di DNase (50 g/mL), 200 lofe di papaina (30 U/mL) e 200 l di L-cisteine (0,24 mg/mL).</li>
	<li>Filtrare-sterilizzare il supporto utilizzando un filtro 0,22 m.</li>
	<li>Tenere il supporto nella cappa del flusso laminare a temperatura ambiente (RT) fino alla dissezione.</li>
</ol>3. Preparazione per la dissezione (10 min)
NOTA: Eseguire i passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
<ol><li>Preparare 100 mL di salina tampone di fosfato senza calcio e magnesio (PBS; 1x). Filtra-sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m.</li>
	<li>Preparare 50 mL di soluzione 1x PBS ghiacciata integrata con 750 - L del 45% di glucosio. Filtra-sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m.</li>
	<li>Riempire un piatto Petri da 100 mm con 1x PBS per strumenti di pulizia e tre piatti Petri da 60 mm con PBS-glucosio ghiacciato per la raccolta dei tessuti. Mettere i piatti di Petri sul ghiaccio fino alla dissezione.</li>
</ol>4. Dissezione
NOTA: La dissezione viene eseguita da cuccioli di ratto Wistar maschi e femmine al giorno postnatale (P) 2.
<ol><li>Al fine di fornire un ambiente sterile, assicurarsi di pulire il banco con 100% etanolo. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con 100% etanolo.</li>
	<li>Spruzzare delicatamente il collo del cucciolo con il 70% di etanolo.</li>
	<li>Utilizzare grandi forbici chirurgiche per decapitare l'animale e posizionare la testa in una parabola Petri da 100 mm contenente PBS-glucosio ghiacciato.</li>
	<li>Utilizzare pinze curve per mantenere la testa dell'animale a livello degli occhi. Utilizzare piccole forbici chirurgiche per fare una piccola incisione alla base del cranio e tagliare il cranio seguendo la linea mediana del cervello.</li>
	<li>Utilizzare pinze per staccare delicatamente le due parti del cranio dalla linea mediana.</li>
	<li>Utilizzare un piccolo cucchiaio chirurgico per rimuovere il cervello dalla cavità della testa. Mettere il cervello in una teglia Petri da 60 mm contenente PBS-glucosio ghiacciato sul ghiaccio.</li>
	<li>Osservando sotto uno steromicroscopio, utilizzare pinze sottili per rimuovere il cervelletto, il tronco encefalico e bulbi olfattivi dagli emisferi cerebrali.</li>
	<li>Utilizzare le pinze sottili per separare i due emisferi cerebrali. Utilizzare le pinze sottili per staccare le meningi. Mettere le cortice cerebrali in una piastra di petri da 60 mm sul ghiaccio. NOTA: PBS ghiacciato è fondamentale per la corretta rimozione delle meningi.</li>
</ol>5. Dissociazione dei tessuti
NOTA: Eseguire i passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
<ol><li>Utilizzare un bisturi affilato per tritare finemente le cortice cerebrali. Trasferire il tessuto macinato in un tubo da 50 mL contenente un mezzo di digestione enzimatica.</li>
	<li>Incubare per 30 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Utilizzare una micropipetta p1000 per rimuovere delicatamente il mezzo di digestione enzimatica assicurandosi che il tessuto corticale rimanga nella parte inferiore del tubo da 50 mL.</li>
	<li>Utilizzare una micropipetta p1000 per aggiungere 1 mL di DMEM-10% FCS e triturare delicatamente il tessuto.</li>
	<li>Utilizzare un filtro da 70 m e un pistone di una siringa da 1 mL per filtrare il tessuto corticale in un tubo da 50 mL. NOTA: Si può risciacquare il tessuto residuo sulla parete della camera d'aria più volte con DMEM-10% FCS.</li>
	<li>Riempire il tubo da 50 mL con DMEM-10%FCS. Centrifuga a 423 x g per 5 min a RT. Rimuovere con attenzione il pellet cellulare supernatante e resospendere cellulare con 2 mL di DMEM-10%FCS.</li>
	<li>Triturare delicatamente il pellet cellulare con una micropipetta p1000 e poi con una micropipetta p200. Diluire la sospensione cellulare con il volume appropriato di DMEM-10%FCS. NOTA: Due cervelli: un T150 e 5 mL di DMEM-10%FCS.</li>
	<li>Piastra 5 mL della sospensione cellulare su un T150 ad una densità di 1 x 105 celle / cm2. Aggiungere 20 mL di dMEM-10%FCS caldo a ogni T150. Incubare in un'incubatrice umidificata a 37 gradi sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Rinnovare metà del mezzo di coltura dopo 6 giorni in vitro (DIV) con caldo DMEM-10%FCS.</li>
</ol>6. Preparazione agitazione
<ol><li>Eseguire la preparazione agitazione il giorno prima di agitare in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.</li>
	<li>Rinnovare metà del mezzo di coltura aggiungendo fresco mezzo di coltura calda nel pallone e incubare a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.</li>
</ol>7. Scuotere
<ol><li>Cappotto tre piatti Petri da 100 mm con PEI. Conservarli a 4 gradi durante la notte.</li>
	<li>Coprire il tappo delle fiasche con pellicola paraffina e mettere i flaconi in un sacchetto di plastica. Agitare flaconi contenenti cellule gliali durante la notte a 250 giri/min a 37 gradi centigradi. NOTA: La prima agitazione viene eseguita a 8 DIV e si può eseguire fino a tre diversi agitazioni (vedere Figura 1 per la temporizzazione).</li>
</ol>8. Raccolta e coltura di cellule di lignaggio OL
NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
<ol><li>Il giorno dopo aver tremato, preparare Bottenstein-Sato (BS) medio secondo la tabella 1.</li>
	<li>Risciacquare i piatti Petri rivestiti 3 volte con acqua distillata sterile.</li>
	<li>Il supernatante dei flaconi di raccolta contiene principalmente cellule di lignaggio OL, ma anche alcune cellule microgliali e la piastra su piatti Petri da 100 mm non rivestiti. NOTA: Questa fase consente la rimozione delle cellule microgliali attraverso l'adesione rapida differenziale sulla superficie del piatto.</li>
	<li>Incubare i piatti Petri per 15 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Riempire ogni pallone T150 con 25 mL di mezzo di coltura calda appena preparato e incubare in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 fino al secondo scuotimento.</li>
	<li>Trasferire il supernatante dai piatti Petri in nuovi piatti Petri non rivestiti da 100 mm per consentire l'adesione delle cellule microgliali residue.</li>
	<li>Incubare i piatti Petri per 15 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante, che contiene celle di lignaggio OL non aderenti, e trasferirlo in tubi da 50 mL (supernatante da 2 piatti Petri per un tubo da 50 mL). Scartare piatti Petri placcati con microglia.</li>
	<li>Centrifugare il supernatante per 5 min a 423 x g. Rimuovere con attenzione il pellet cellulare supernatante e resospendere il pellet cellulare con 1 mL di mezzo BS. Mettere in comune tutti i pellet in un tubo comune da 50 mL e regolare il volume a 10 mL con mezzo BS.</li>
	<li>Determinare le cellule di conteggio della densità delle cellule al microscopio. NOTA: È necessario ottenere una densità di cella compresa tra 3 x 105/mL e 5 x 105/mL.</li>
	<li>Aggiungere 20 mL di BS se la densità cellulare è maggiore o uguale a 4 x 105/mL per ottenere un volume finale di 30 mL, oppure aggiungere solo 10 mL di BS se la densità cellulare è minore di 4 x 105/mL per ottenere un volume finale di 20 mL.</li>
	<li>Piatto due o tre pre-rivestito 100 mm Petri piatti con 10 mL di sospensione cellulare. Incubare in un'incubatrice umidificata a 37 gradi sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Eliminare i detriti dai piatti Petri rinfrescando tutto il BS medio 2 h più tardi. NOTA: Esaminare la coltura al microscopio prima e dopo la compensazione per verificare la densità cellulare e l'efficienza della rimozione dei detriti.</li>
	<li>Incubare per 2 giorni in mezzo BS in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2. NOTA: Esaminare la coltura al microscopio. La confluenza dovrebbe essere dal 70% all'80%.</li>
</ol>9. Produzione OCM
NOTA: Eseguire questi passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
<ol><li>Preparare NB-B27basso medio secondo la tabella 2.</li>
	<li>Renew coltur medium con 10 mL di medio caldo NB-B27low. Incubare per 2 giorni in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Raccogliere l'OCM, cioè, supernatali contenenti fattori secreti OL. Filtra-sterilizzare OCM utilizzando un filtro da 0,22 m. NOTA: Conservare OCM a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 mesi.</li>
</ol>10. Aggiunta OCM
NOTA: I passi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili. L'OCM può essere aggiunto alle colture neuronali ippocampali purificate preparate secondo il seguente protocollo14e ottenute aggiungendo, 24 h dopo l'isolamento, gli agenti anti-mitotici uridina e 5- fluorodeoxyuridina (5 M) per 36 h.
<ol><li>A 3 DIV, rimuovere tutto il mezzo di coltura del neurone contenente agenti anti-mitotici e aggiungere 500 - L di OCM caldo fresco.</li>
	<li>Rinnovare metà del mezzo ogni 3 giorni con NB-B27 caldo appena fatto. NOTA: Tali impostazioni cultura possono essere mantenute fino a 21 DIV.</li>
</ol>11. Aggiunta di OL alla coltura neuronaca ippocampale purificata
NOTA: eseguire i seguenti passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili. Gli OL possono essere aggiunti alle colture ippocampali purificate ottenute nello stesso modo descritto in precedenza.
<ol><li>Preparare il mezzo di cocoltura secondo la tabella 3.</li>
	<li>Recuperare la cultura OL a 70% a 80% confluenza. Risciacquare con 2 mL di caldo 1x PBS.</li>
	<li>Per staccare le cellule, aggiungere 2 mL di 0,25% di prova in un piatto Petri da 100 mm.</li>
	<li>Incubare per 5 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di DMEM-10% FCS per bloccare la reazione enzimatica. Raccogliere il super-atali contenente cellule di lignaggio OL.</li>
	<li>Centrifuga a 423 x g per 5 min a RT. Rimuovere con attenzione il supernatante e riattendere il pellet cellulare in mezzo di co-coltura caldo per ottenere una concentrazione di 1,25 x 105 cellule / mL.</li>
	<li>Aggiungere OL alla coltura di neuroni ippocampali purificati rimuovendo 200 gradi l di coltura neuronale medio e aggiungendo 200 l di sospensione cellulare per pozzo (2,5 x 104 cellule/pozzo) di una piastra di 24 pozzetti.</li>
	<li>Aggiorna metà del mezzo di co-cultura ogni 2-3 giorni. NOTA: le coculture possono essere mantenute fino a 24 DIV.</li>
</ol>

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</ol>

Nessuno degli autori ha interessi contraddittori o interessi contrastanti.

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per ottenere impostazioni cellulari l'oligodendrogliale altamente arricchite da colture gliali miste, adattate da un metodo pubblicato in precedenza16,e la successiva produzione di mezzo condizionato da OL. Questa tecnica di agitazione non è costosa, può essere ripetuta tre volte ed è ottimale per ottenere un'elevata quantità di OL purificati, come le cellule coltivate in Bottenstein-Sato (BS) proliferano PDGF. Le cellule gliali sono preparate utilizzando co...

Gli oligodendrociti (OL) sono cellule gliali del sistema nervoso centrale (SNC) che generano mielina avvolgendo gli assoni. Gli OL provengono da cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) che proliferano all'interno delle zone ventricolari del SNC embrionale e poi migrano e si differenziano in OL completamente maturi (cioè cellule formanti mielina)1. Gli OPC sono abbondanti durante lo sviluppo precoce, ma persistono anche nel cervello adulto dove rappresentano la principale popolazione di cellule proliferanti2. Un singolo OL racchiude più assoni multipli in sezioni non eccitabili (ad esempio, internodi) e il bordo di ogni anello mielina si attacca all'assone formando il dominio paranodale che è cruciale per le proprietà isolanti della mielina1,3. Tra i paranodi ci sono piccole lacune non mielinated chiamate nodi di Ranvier. Questi nodi sono ricchi di canali di sodio legati alla tensione (Nav), permettendo la rigenerazione e la rapida propagazione dei potenziali d'azione attraverso la conduzione saltatoria4. Questa interazione stretta consente anche il supporto energetico assonale attraverso l'assorbimento neuronale di lattato da OLs5,6.
La maturazione delle cellule di lignaggio oligodendrogliale e il processo di mielinazione sono strettamente regolati dalle loro interazioni con i neuroni7. Infatti, OL e OPC, chiamati anche cellule NG2, esprimono una serie di recettori per i neurotrasmettitori, e possono ricevere input da neuroni eccitatori e inibitori, permettendo loro di percepire l'attività neuronale che può innescare la loro proliferazione e/o differenziazione nelle cellule mielinanti2. A sua volta, gli OPC/OL secernono microvescicoli e proteine nello spazio extracellulare che da solo o sinergicamente mediano le funzioni neuromodative e neuroprotettive8,9,10,11,12. Tuttavia, i meccanismi molecolari che controllano le molteplici modalità di interazione tra cellule lignee e neuroni oligodendrocliali devono ancora essere completamente decifrati.
Inoltre, in diverse condizioni patologiche del SNC, gli OL sono principalmente colpiti, disturbando così la loro interazione con i neuroni. Ad esempio, nella sclerosi multipla (MS), la disfunzione neurologica è causata dalla demielinazione focale nel SNC, secondaria alla perdita di OLs che può portare a danni assonali e relativo accumulo di disabilità. La remielinazione può avvenire, anche se in misura insufficiente nella maggior parte dei casi13. I progressi compiuti nell'ultimo decennio, dovuti allo sviluppo di immunoterapie, hanno ridotto il tasso di ricaduta, ma la promozione della remielinazione rimane fino ad oggi un bisogno insoddisfatto. Come tale, una migliore comprensione del ruolo, delle funzioni e delle influenze di OLs è di particolare interesse per lo sviluppo di nuove terapie per un ampio spettro di condizioni del SNC.
Qui, descriviamo i metodi di purificazione e cultura oLs. Ciò consente un esame preciso dei meccanismi intrinseci che regolano il loro sviluppo e la biologia. Inoltre, tali colture OLaltamente arricchite permettono la produzione di un mezzo condizionato dagli oligodendrociti (OCM), che può essere aggiunto alle colture neuronali purificate per ottenere informazioni sull'impatto dei fattori secreti di OL sulla fisiologia e la connettività neuronali. Inoltre, descriviamo come implementare un sistema di cocoltura in vitro in cui gli oligodendrociti purificati e i neuroni sono combinati insieme, permettendo di affrontare i meccanismi che regolano (rielinazione.

<table><tbody><tr><td>Integratore di 5-fluorodesossiuridina</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNasi (desossiribonucleasi I)</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Eagle modificato di Dulbecco Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>etanolo 100% </td><td>Sigma</td><td>32221-M</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 70%</td> <td>VWR Chemicals</td><td>83801.360</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteina</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>A1285601</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI)</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato decaidrato</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>Bottenstein-Sato (BS) media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin umano</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina dicloridrato</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodico)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>T4 ( L-tiroxina)</td><td>Sigma</td><td>T1775</td><td></td></tr><tr><td><forte>Terreni di co-coltura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-transferrina umana</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>B27 integratore</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albumina sierica bovina)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Ceruloplasmina</td><td>Sigma</td><td>239799</td><td></td></tr><tr><td>Eagle modificato di Dulbecco Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteina</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescin</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>CNTF umano ricombinante</td><td>Sigma</td><td>450-13</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3',5-Triiodo-L-tironina sale sodico)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m filtro</td><td>Sartorius</td><td>514-7010</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 1 ml</td><td>Terumo</td><td>1611127</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 100 mm</td><td>Dutscher</td><td>193100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo da 15 ml</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1867</td><td></td></tr><tr><td>Tubo da 50 ml</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1869</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 60 mm</td><td>Dutscher</td><td>067003</td><td></td></tr><tr><td>70 micro; m filtro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio binoculare</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Pinze curve</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per le scienze fini</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche grandi</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Swann-morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piccole forbici chirurgiche</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Cucchiaio chirurgico piccolo</td><td>Bar Naor Ltd</td><td>BN2706</td><td></td></tr><tr><td>T150 cm2 pallone con tappo filtrante</td><td>Dutscher</td><td>190151</td><td></td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Wistar rat</td><td>Janvier</td><td>RjHAn:WI</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di oligodendrociti e mezzo condizionato oligodendrocito per esperimenti co-culture

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Nel sistema nervoso centrale, gli oligodendrociti sono ben noti per il loro ruolo nella mielinazione degli assoni, che accelera la propagazione dei potenziali d'azione attraverso la conduzione saltatoria. Inoltre, un numero crescente di rapporti suggeriscono che gli oligodendrociti interagiscono con neuroni oltre la mielinazione, in particolare attraverso la secrezione di fattori solubili. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che consente la purificazione delle cellule di lignaggio oligodolole da colture cellulari gliali contenenti anche astrociti e cellule microgliali. Il metodo si basa sull'agitazione notturna a 37 gradi centigradi, che consente il distacco selettivo delle cellule oliedendrogliali sovrastanti e delle cellule microgliali e l'eliminazione della microglia mediante adesione differenziale. Descriviamo quindi la cultura degli oligodendrociti e la produzione di mezzi condizionati con oligodendrociti (OCM). Forniamo anche la cinetica del trattamento OCM o oligodendrociti aggiunta ai neuroni ippocampali purificati in esperimenti di co-cultura, studiando le interazioni oligodendrocite-neurone.

In questo protocollo, le cellule di lignaggio OL vengono purificate dalle colture gliali scrollandosi di dosso gli astrociti e microglia. La purezza e l'esame fenotipica delle colture OL possono essere valutati immunostaining con marcatori gliali15. L'analisi dell'espressione di diversi marcatori ha indicato che le colture OL erano per lo più pre-OL con il 90% diO4 - cellule, 85% - 7% NG2, cellule, e 4.7% - 2,1% di PLP- cellule, men...

Qui, esponiamo un metodo efficiente per la purificazione degli oligodendrociti e la produzione di mezzo con condizioni oligodendrocite che possono essere utilizzati per esperimenti di co-cultura.

Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Descriviamo un metodo efficiente di purificazione e coltura delle cellule di lignaggio oligodendrogliale. Ciò consente di affrontare i meccanismi molecolari che controllano la differenziazione degli oligodendrociti e le loro interazioni con i neuroni durante il processo di mielinizzazione. Questa tecnica di scuotimento non è costosa ed è ottimale per ottenere un'alta quantità di oligodendrociti.Tali colture consentono la produzione di mezzi condizionati con oligodendrociti e co-colture di oligodendrociti con neuroni. La sclerosi multipla è una malattia causata dalla demielinizzazione focale nel sistema nervoso centrale, secondaria alla perdita di oligodendrociti. La cultura degli oligodendrociti fornisce uno strumento per comprendere meglio come promuovere la ri-mielinazione.Solo la coltura cellulare oligodendrogliale poteva fornire informazioni sui meccanismi intrinseci che regolavano gli sviluppi e la biologia degli oligodendrociti. Le co-culture con i neuroni consentono di comprendere i loro impatti sulla fisiologia neuronale. Per iniziare, utilizzare forcep curve per mantenere la testa dell'animale a livello degli occhi.Usa piccole forbici chirurgiche per fare una piccola incisione alla base del cranio e tagliare il cranio seguendo la linea mediana cerebrale. Utilizzare le forcep per staccare delicatamente le due parti del cranio dalla linea mediana. Utilizzare un piccolo cucchiaio chirurgico per rimuovere il cervello dalla cavità della testa.Metti il cervello in una piastra di Petri di 60 millimetri contenente glucosio PBS ghiacciato sul ghiaccio. Guardando al microscopio stereo, usa le forcep fini per rimuovere il cervelletto, il tronco encefalico e i bulbi olfattivi dagli emisferi cerebrali. Usa le forcep fini per separare i due emisferi cerebrali.Usa le forcep fini per staccare le meningi. Metti le cortici cerebrali in una piastra di Petri di 60 millimetri sul ghiaccio. In un cappuccio a flusso laminare, utilizzare un bisturi affilato per tagliare finemente i cortici cerebrali.Trasferire il tessuto tritato in un tubo da 50 millilitri contenente mezzo di digestione enzimatica. Incubare per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Successivamente, utilizzare una pipetta per rimuovere delicatamente il mezzo di digestione enzimatico assicurandosi che il tessuto corticale rimanga nella parte inferiore del tubo.Utilizzare una micropipetta P1000 per aggiungere un millilitro di siero di vitello fetale DMEM al 10% e triturare delicatamente il tessuto. Utilizzare un filtro da 70 micron e il pistone di una siringa da un millilitro per filtrare il tessuto corticale in un tubo da 50 millilitri. Risciacquare più volte il tessuto residuo sulla parete della camera d'aria del tubo da 50 millilitri con siero di vitello fetale DMEM al 10%.Riempire il tubo da 50 millilitri con siero per vitelli fetali DMEM al 10%. Centrifuga a 423 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con due millilitri di siero di vitello fetale DMEM al 10%.Triturare delicatamente il pellet cellulare con la micropipetta P1000 e quindi, con la micropipetta P200. Diluire la sospensione cellulare con il volume appropriato di siero per vitelli fetali DMEM al 10%. Piastra cinque millilitri della sospensione cellulare su un pallone T-150 ad una densità di una volta 10 alla quinta cella per centimetro quadrato.Aggiungere 20 millilitri di siero caldo dmem al polpaccio 10% fetale a ogni pallone T-150. Incubare in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Dopo aver agitato il campione durante la notte a 250 giri/min e 37 gradi Celsius, raccogliere il supernatante nel pallone contenente principalmente cellule di lignaggio oligodendrocita, ma anche alcune cellule microgliali, e placcarlo su piastre di Petri non rivestite da 100 millimetri.Incubare le piastre di Petri per 15 minuti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Ciò consente la rimozione delle cellule microgliali attraverso l'adesione rapida differenziale sulla superficie del piatto. Nel frattempo, riempire ogni pallone T-150 con 25 millilitri di terreno di coltura caldo e preparato al momento e incubare in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica fino al secondo scuotimento.Successivamente, trasferire il supernatante dalle piastre di Petri in nuove piastre di Petri non rivestite da 100 millimetri per consentire l'adesione di cellule microgliali residue. Incubare le piastre di Petri per 15 minuti in un incubatore umidificato a 37 Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Rimuovere il supernatante da ogni due piastre di Petri, che contengono cellule di lignaggio oligodendrocite non aderenti, e trasferirlo in un tubo da 50 millilitri.Scartare le piastre di Petri placcate con microglia. Centrifugare i tubi per cinque minuti a 423 volte g. Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con un millilitro di mezzo Bottenstein-Sato.Mettere in comune tutti i pellet in un comune tubo da 50 millilitri e regolare il volume a 20 o 30 millilitri a seconda della densità cellulare con il mezzo Bottenstein-Sato. Piatto due o tre piastre di Petri prerivestite da 100 millimetri con 10 millilitri della sospensione cellulare. Incubare in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica.Due ore dopo, sgombrate i detriti dalle piastre di Petri rinfrescando tutto il mezzo Bottenstein-Sato. Incubare per due giorni nel mezzo in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Dopo due giorni, esaminare la coltura al microscopio.In una cappa a flusso laminare, in condizioni sterili, rinnovare il mezzo di coltura con 10 millilitri di mezzo basso MPB-27 caldo. Incubare per due giorni in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Per raccogliere l'OCM, raccogliere il supernatante contenente oligodendrociti fattori secreti.Filtrare sterilizzare l'OCM utilizzando un filtro da 0,22 micron. In questo protocollo, le cellule di lignaggio degli oligodendrociti venivano purificate dalle colture gliali scrollandosi di dosso astrociti e microglia. L'analisi dell'espressione di marcatori diversi ha indicato che le colture di oligodendrociti erano per lo più pre-oligodendrociti con 90 più o meno il 4% delle cellule positive O4, 85 più o meno 7%NG2 cellule positive e 4,7 più o meno il 2,1% delle cellule positive PLP, mentre il 7,2 più o meno il 2,5% delle cellule erano astrociti positivi GFAP.L'OCM prodotto da tali colture è stato aggiunto in tre giorni in vitro alle colture di neuroni ippocampali purificati. Questo trattamento promuove il raggruppamento di proteine notal. La mielinazione dei neuroni ippocampali è stata studiata attraverso l'aggiunta di oligodendroctyes a 14 giorni in vitro.Da 20 a 24 giorni in vitro, la colorazione immuno dei marcatori mielina, come la proteina di base mielina, ha permesso la visualizzazione dei segmenti e dei nodi mielina di Ranvier. Core PBS è importante per la rimozione delle meningi. La radura a rischio è fondamentale per la vitalità degli oligodendroctyes e per la realizzazione dei punti di forza del flusso applicato con la pipetta.Il mezzo condizionato da oligodendrociti può essere aggiunto alle colture neuronali per ottenere informazioni sull'impatto degli oligodendroctyes secernoti fattori sulla fisiologia neuronale. Co-colture di oligodendroctyes con neuroni possono anche essere eseguite per studiare il processo di mielinizzazione.

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Neuroscienze

Questo articolo descrive i metodi per ricavare le popolazioni murine arricchito di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in colture primarie, che differenziano per produrre oligodendrociti maturi (OLS). Inoltre, questo rapporto descrive le tecniche per produrre murino mielinizzanti co-colture da semina OPC del mouse su un letto neurite dei neuroni dei gangli spinali del mouse (DRGNs).

Derivazione di Arricchito Culture oligodendrociti e degli oligodendrociti / Neuron mielinizzanti co-culture di tessuti murini post-natale

Primaria, umani fetali di derivazione cerebrale, le cellule progenitrici multipotenti...

Progenitore di derivazione Sistema Cultura Oligodendrocyte dal cervello umano fetale

Questo video mostra un protocollo dettagliato per isolare le pareti del ventricolo laterale dal cervello del topo adulto ed eseguire la dissociazione enzimatica del tessuto per ottenere singole cellule. Queste cellule sono poi sottoposte a specifiche condizioni di coltura che aumentano selettivamente la proliferazione delle cellule staminali neurali e ne promuovono la differenziazione in co-colture di oligodendrociti e astrociti.

Ottenimento di una coltura mista di oligodendrociti e astrociti da cellule staminali neurali di topo adulto

Questo video dimostra la creazione di una co-coltura di neuroni indotti umani (iNs) e cellule precursori di oligodendrociti indotti (iOPC). Gli iN vengono mescolati con iOPC in una co-coltura e poi incubati per supportare la maturazione di entrambi gli iN in neuroni e degli iOPC in oligodendrociti. I neuroni formano connessioni sinaptiche con altri neuroni e oligodendrociti, mentre gli oligodendrociti sviluppano guaine mieliniche attorno agli assoni dei neuroni.

Un metodo di co-coltura per modellare le interazioni neurone-oligodendrocita

Il video dimostra un protocollo per differenziare le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in oligodendrociti e indurre la mielinizzazione in una co-coltura con neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG). Gli OPC sono trasdotti con vettori lentivirali che codificano per una proteina di segnalazione che regola la mielinizzazione. Le OPC trasdotte vengono co-coltivate con neuroni DRG per valutare la differenziazione in oligodendrociti e la mielinizzazione indotta dalla proteina di...

Un test di mielinizzazione indotta da trasduzione in vitro per cellule precursori di oligodendrociti

Questo video dimostra la produzione di terreno condizionato con oligodendrociti (OCM) da cellule di lignaggio di oligodendrociti stressandole per migliorare il loro rilascio molecolare nel terreno. Questo terreno, ricco di fattori di crescita, citochine e altre molecole bioattive, può essere aggiunto alle colture di neuroni per ottenere informazioni sull'impatto dei fattori secreti dagli oligodendrociti sulla fisiologia e sulla connettività neuronale.

Un metodo per la generazione di terreno condizionato con oligodendrociti

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Isolamento e coltura di cellule precursori di oligodendrociti dalla corteccia cerebrale del cucciolo di topo

Le cellule globoidi sono una caratteristica patologica distintiva della malattia di Krabbe, una leucodistrofia attualmente priva di una terapia efficace a lungo termine. Abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare per studiare la biologia innata e il potenziale patogenetico delle microglia attivate e la loro trasformazione in cellule globoidi.

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Qui presentiamo protocolli che offrono una base flessibile e strategica per manipolare viralmente le cellule precursori degli oligodendrociti per sovraesprimere proteine di interesse al fine di interrogare specificamente il loro ruolo negli oligodendrociti attraverso il modello in vitro di mielinizzazione del sistema nervoso centrale.

Produzione e l'uso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore In Vitro Saggi mielinizzazione

Le interazioni neurone-glia nella neurodegenerazione non sono ben comprese a causa di strumenti e metodi inadeguati. Qui, descriviamo protocolli ottimizzati per ottenere neuroni indotti, cellule precursori degli oligodendrociti e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti umane e forniamo esempi dei valori di questi metodi nella comprensione dei contributi specifici del tipo di cellula nella malattia di Alzheimer.

Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti

Descriviamo la produzione di colture miste di astrociti e cellule precursori di oligodendrociti derivate da cellule staminali neurali fetali o adulte che si differenziano in oligodendrociti maturi e la modellazione in vitro di stimoli nocivi. L'accoppiamento con una tecnica di screening ad alto contenuto basata su cellule costruisce un sistema di screening dei farmaci affidabile e robusto.

Selezione ad alto contenuto di differenziazione e analisi della maturazione di colture cellulari precursori di oligodendrociti derivati da cellule staminali neurali fetali e adulte

Impara un metodo efficiente per purificare oligodendrociti e produrre mezzo condizionato per esperimenti di co-coltura con neuroni. Questa tecnica facilita lo studio dei meccanismi molecolari della mielinazione.

Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture

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