Generazione di Oligodendrociti e Mezzo Condizionato oligodendrocito per Esperimenti Co-Culture

Descriviamo un metodo efficiente di purificazione e coltura delle cellule di lignaggio oligodendrogliale. Ciò consente di affrontare i meccanismi molecolari che controllano la differenziazione degli oligodendrociti e le loro interazioni con i neuroni durante il processo di mielinizzazione. Questa tecnica di scuotimento non è costosa ed è ottimale per ottenere un'alta quantità di oligodendrociti.

Tali colture consentono la produzione di mezzi condizionati con oligodendrociti e co-colture di oligodendrociti con neuroni. La sclerosi multipla è una malattia causata dalla demielinizzazione focale nel sistema nervoso centrale, secondaria alla perdita di oligodendrociti. La cultura degli oligodendrociti fornisce uno strumento per comprendere meglio come promuovere la ri-mielinazione.

Solo la coltura cellulare oligodendrogliale poteva fornire informazioni sui meccanismi intrinseci che regolavano gli sviluppi e la biologia degli oligodendrociti. Le co-culture con i neuroni consentono di comprendere i loro impatti sulla fisiologia neuronale. Per iniziare, utilizzare forcep curve per mantenere la testa dell'animale a livello degli occhi.

Usa piccole forbici chirurgiche per fare una piccola incisione alla base del cranio e tagliare il cranio seguendo la linea mediana cerebrale. Utilizzare le forcep per staccare delicatamente le due parti del cranio dalla linea mediana. Utilizzare un piccolo cucchiaio chirurgico per rimuovere il cervello dalla cavità della testa.

Metti il cervello in una piastra di Petri di 60 millimetri contenente glucosio PBS ghiacciato sul ghiaccio. Guardando al microscopio stereo, usa le forcep fini per rimuovere il cervelletto, il tronco encefalico e i bulbi olfattivi dagli emisferi cerebrali. Usa le forcep fini per separare i due emisferi cerebrali.

Usa le forcep fini per staccare le meningi. Metti le cortici cerebrali in una piastra di Petri di 60 millimetri sul ghiaccio. In un cappuccio a flusso laminare, utilizzare un bisturi affilato per tagliare finemente i cortici cerebrali.

Trasferire il tessuto tritato in un tubo da 50 millilitri contenente mezzo di digestione enzimatica. Incubare per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Successivamente, utilizzare una pipetta per rimuovere delicatamente il mezzo di digestione enzimatico assicurandosi che il tessuto corticale rimanga nella parte inferiore del tubo.

Utilizzare una micropipetta P1000 per aggiungere un millilitro di siero di vitello fetale DMEM al 10% e triturare delicatamente il tessuto. Utilizzare un filtro da 70 micron e il pistone di una siringa da un millilitro per filtrare il tessuto corticale in un tubo da 50 millilitri. Risciacquare più volte il tessuto residuo sulla parete della camera d'aria del tubo da 50 millilitri con siero di vitello fetale DMEM al 10%.

Riempire il tubo da 50 millilitri con siero per vitelli fetali DMEM al 10%. Centrifuga a 423 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con due millilitri di siero di vitello fetale DMEM al 10%.

Triturare delicatamente il pellet cellulare con la micropipetta P1000 e quindi, con la micropipetta P200. Diluire la sospensione cellulare con il volume appropriato di siero per vitelli fetali DMEM al 10%. Piastra cinque millilitri della sospensione cellulare su un pallone T-150 ad una densità di una volta 10 alla quinta cella per centimetro quadrato.

Aggiungere 20 millilitri di siero caldo dmem al polpaccio 10% fetale a ogni pallone T-150. Incubare in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Dopo aver agitato il campione durante la notte a 250 giri/min e 37 gradi Celsius, raccogliere il supernatante nel pallone contenente principalmente cellule di lignaggio oligodendrocita, ma anche alcune cellule microgliali, e placcarlo su piastre di Petri non rivestite da 100 millimetri.

Incubare le piastre di Petri per 15 minuti in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Ciò consente la rimozione delle cellule microgliali attraverso l'adesione rapida differenziale sulla superficie del piatto. Nel frattempo, riempire ogni pallone T-150 con 25 millilitri di terreno di coltura caldo e preparato al momento e incubare in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica fino al secondo scuotimento.

Successivamente, trasferire il supernatante dalle piastre di Petri in nuove piastre di Petri non rivestite da 100 millimetri per consentire l'adesione di cellule microgliali residue. Incubare le piastre di Petri per 15 minuti in un incubatore umidificato a 37 Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Rimuovere il supernatante da ogni due piastre di Petri, che contengono cellule di lignaggio oligodendrocite non aderenti, e trasferirlo in un tubo da 50 millilitri.

Scartare le piastre di Petri placcate con microglia. Centrifugare i tubi per cinque minuti a 423 volte g. Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con un millilitro di mezzo Bottenstein-Sato.

Mettere in comune tutti i pellet in un comune tubo da 50 millilitri e regolare il volume a 20 o 30 millilitri a seconda della densità cellulare con il mezzo Bottenstein-Sato. Piatto due o tre piastre di Petri prerivestite da 100 millimetri con 10 millilitri della sospensione cellulare. Incubare in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica.

Due ore dopo, sgombrate i detriti dalle piastre di Petri rinfrescando tutto il mezzo Bottenstein-Sato. Incubare per due giorni nel mezzo in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Dopo due giorni, esaminare la coltura al microscopio.

In una cappa a flusso laminare, in condizioni sterili, rinnovare il mezzo di coltura con 10 millilitri di mezzo basso MPB-27 caldo. Incubare per due giorni in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Per raccogliere l'OCM, raccogliere il supernatante contenente oligodendrociti fattori secreti.

Filtrare sterilizzare l'OCM utilizzando un filtro da 0,22 micron. In questo protocollo, le cellule di lignaggio degli oligodendrociti venivano purificate dalle colture gliali scrollandosi di dosso astrociti e microglia. L'analisi dell'espressione di marcatori diversi ha indicato che le colture di oligodendrociti erano per lo più pre-oligodendrociti con 90 più o meno il 4% delle cellule positive O4, 85 più o meno 7%NG2 cellule positive e 4,7 più o meno il 2,1% delle cellule positive PLP, mentre il 7,2 più o meno il 2,5% delle cellule erano astrociti positivi GFAP.

L'OCM prodotto da tali colture è stato aggiunto in tre giorni in vitro alle colture di neuroni ippocampali purificati. Questo trattamento promuove il raggruppamento di proteine notal. La mielinazione dei neuroni ippocampali è stata studiata attraverso l'aggiunta di oligodendroctyes a 14 giorni in vitro.

Da 20 a 24 giorni in vitro, la colorazione immuno dei marcatori mielina, come la proteina di base mielina, ha permesso la visualizzazione dei segmenti e dei nodi mielina di Ranvier. Core PBS è importante per la rimozione delle meningi. La radura a rischio è fondamentale per la vitalità degli oligodendroctyes e per la realizzazione dei punti di forza del flusso applicato con la pipetta.

Il mezzo condizionato da oligodendrociti può essere aggiunto alle colture neuronali per ottenere informazioni sull'impatto degli oligodendroctyes secernoti fattori sulla fisiologia neuronale. Co-colture di oligodendroctyes con neuroni possono anche essere eseguite per studiare il processo di mielinizzazione.