Name: Utilizzo di Bioinchiostro idrogel multistrato nella biostampa tridimensionale per la distribuzione omogenea delle cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Scopri la biostampa 3D con bioinchiostro multistrato a base di gelatin metacrilato per prevenire la sedimentazione cellulare. Questo metodo garantisce una distribuzione omogenea delle cellule per applicazioni in medicina rigenerativa.

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Gli autori riconoscono sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81771971, 81970442, 81703470 e 81570422), National Key R&D Program of China (2018YFC1005002), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (17JC1400200), Shanghai City Science and Technology Project (17JC1400200), Shanghai City Project (Major Grant. (Programma di innovazione 2017-01-07-00-07-E00027).

1. Preparazione di SF-GelMA carico di cellule
<ol><li>Sterilizzare tutti i materiali utilizzando unità filtranti per siringhe 0,22 m. Eseguire tutte le fasi in un armadietto di sicurezza biologica.</li>
	<li>Scaldare 1x PBS a 50 gradi centigradi, e sciogliere la gelatina nel 1x PBS riscaldato mescolando. La concentrazione finale di gelatina in PBS dovrebbe essere del 10% (w/v).</li>
	<li>Aggiungere l'anidride methacrlica nella soluzione di gelatina (rapporto di peso dell'idordride methacritil a gelatina da 0,6 a 1) lentamente mescolando, e mescolare il complesso per almeno 1 h (50 ) . Tipicamente, preparare 200 mL di 10% soluzione di gelatina con 12 g di anurdride methacritil; il volume dipende dalle esigenze dello studio.</li>
	<li>Trasferire la soluzione mista contenente gelatina e anidride methacrlica in un tubo sterile da 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione mista a 3.500 x g. Di solito ci vogliono 3-5 min per ottenere due strati. Raccogliere lo strato superiore (GelMA) e scartare lo strato inferiore (anduride methacrlicnonnon non reagita).</li>
	<li>Diluire la soluzione di strato superiore ottenuta al punto 1.5 con due volumi di acqua deionizzata (40-50 gradi centigradi).</li>
	<li>Dialisi la soluzione ottenuta al punto 1.6 con una membrana di dialisi tagliata a peso molecolare da 12-14 kDa contro l'acqua deionizzata per 5-7 giorni. Cambiare l'acqua due volte al giorno.</li>
	<li>Raccogliere e congelare la soluzione GelMA a 80 gradi centigradi durante la notte.</li>
	<li>Lyophilize la soluzione GelMA per 3/5 giorni in un'asciugatrice congelata con la temperatura impostata a -45 gradi centigradi e la pressione impostata su 0,2 mbar.</li>
	<li>Sciogliere il GelMA lofilfato (grado di sostituzione di circa il 75%) in 1x PBS contenente 10% FBS (siero bovino fetale, v/v), 25 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulfonic acid), e fotoinitiator (0,5%, w/v) per ottenere la preparazione del bioink GelMA. NOTA: Il grado di sostituzione di GelMA può essere calcolato con un saggio ninhydrin3.</li>
	<li>Mescolare la soluzione GelMA (10%, w/v) con diversi volumi di soluzione SF iniziale (5%, w/v) e diversi volumi di 1x PBS per ottenere bioink SF-GelMA con diverse concentrazioni di SF. La proporzione per 1 mL di soluzione GelMA e SF nei diversi bioinks è presentata nella Tabella 1. NOTA: tutti i bioink devono contenere una concentrazione finale del 5% (w/v) GelMA, ma la concentrazione di SF varia: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 e 1,5% (w/v) nei diversi bioink SF-GelMA. Utilizzare SF-M-Layered-GelMA per terminificare il bioink GelMA modificato con SF in modo strato per strato. Utilizzare SF-X-GelMA per ripartire GelMA modificati con SF in modo omogeneo (ad esempio, GelMA con modifica dell'1% SF è stato definito SF-1-GelMA).</li>
	<li>Sonicare tutti i bioinks per 10-20 min.</li>
	<li>Coltivare celle NIH3T3 utilizzando il DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) contenente il 10% Di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina in un'incubatrice (37 gradi centigradi con 5% di CO2). Passare le celle a un rapporto di 1:3 quando la densità raggiunge 80%.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione delle cellule NIH3T3 a 1500 giri/mm per 5 min. Rimuovere il supernatante con aspirazione e risospendere il pellet cellulare con soluzione bioinchiostro fresco in un tubo sterile da 15 ml. NOTA: la concentrazione delle cellule incapsulate nel bioink deve essere di 1 x 106 cellule/mL e la concentrazione deve essere calcolata con un citometro.</li>
	<li>Utilizzare 2 mL di diversi bioinks SF-GelMA per sospendere i pellet cellulari per ottenere vari bioinks carichi di cellule.</li>
</ol>2. Caricamento, riscaldamento e biostampa della SF-M-Layered-GelMA
<ol><li>Caricare 0,4 mL di SF-0.5-GelMA carico di cellule nello strato inferiore della siringa. NOTA: Utilizzare una siringa da 2 mL come serbatoio di bioinchiostro in questo studio. Caricare diversi bioinks SF-GelMA nella siringa in modo strato per strato.</li>
	<li>Collocare la siringa nel bagno d'acqua ghiacciata (0 gradi centigradi) per 5 min per far sì che il bioinchiostro dello strato inferiore si trasformi in uno stato gel.</li>
	<li>Caricare 0,4 mL di bioinchiostro SF-0.75-GelMA carico di cellule sopra lo strato inferiore.</li>
	<li>Posizionare la siringa con i due strati di bioinks in un bagno d'acqua ghiacciata (0 gradi centigradi) per 5 min per causare la trasformazione dei due strati di bioinks in uno stato gel.</li>
	<li>Scorrere le fasi di carico e raffreddamento altre 3 volte con i restanti 3 tipi di bioinks (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) per ottenere un sistema di bioink multistrato con diverse concentrazioni di SF nei diversi strati. Il volume utilizzato per il caricamento di tutti i bioinks deve essere di 0,4 mL.</li>
	<li>Riscaldare il bioinchiostro multistrato mettendo la siringa in un'incubatrice (37 gradi centigradi) per 30 minuti prima della biostampa.</li>
	<li>Utilizzare una siringa da 2 mL come serbatoio di bioinchiostro con un ugello di stampa da 27 G. Impostare la velocità di flusso a 50 gradi/min, la velocità di movimento dell'ugello a 2 mm/s e l'altezza dell'ugello a 1 mm. Eseguire la procedura di biostampa a temperatura ambiente (circa 20 gradi centigradi).<ol>
<li>Stampare il costrutto di tessuto in modo estrusivo utilizzando un biostampante su misura sotto i parametri adattati dai nostri studi precedenti11,12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare la luce ultravioletta (365 nm, 800 mW) per 40 s per incrociare il costrutto di tessuto biostampato.</li>
	<li>Cultura del costrutto di tessuto incrociato in DMEM (mezzo Aquila modificato di Dulbecco) contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomica in un'incubatrice (37 gradi centigradi con 5% di CO2). Il mezzo è stato cambiato ogni 8 h durante i primi 2 giorni e ogni 2-3 giorni successivi.</li>
</ol>

<ol><li>Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">A decade of progress in tissue engineering.</a> Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).</li>
<li>Heinrich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting%3A+from+benches+to+translational+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting: from benches to translational applications.</a> Small. , 1805510(2019).</li>
<li>Daniela, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalization%2C+preparation+and+use+of+cell-laden+gelatin+methacryloyl-based+hydrogels+as+modular+tissue+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms.</a> Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).</li>
<li>Pedde, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+biofabrication+strategies+for+engineering+complex+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs.</a> Advanced Materials. 29 (19), (2017).</li>
<li>Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioink+properties+before%2C+during+and+after+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Bioink properties before, during and after 3D bioprinting.</a> Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).</li>
<li>Guillotin, B., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+patterning+technologies+for+organotypic+tissue+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication.</a> Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).</li>
<li>Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-stage+crosslinking+of+a+gel-phase+bioink+improves+cell+viability+and+homogeneity+for+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).</li>
<li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable%2C+cell-compatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li>
<li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li>
<li>Chen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+bioink+with+multilayered+interfaces+improves+dispersibility+of+encapsulated+cells+in+extrusion+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).</li>
<li>Zhu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+extrusion+bioprinting+of+bio-macromolecular+bioinks+through+alginate-templated+dual-stage+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking.</a> Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127(2018).</li>
<li>Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+insulin-like+growth+factor-I+and+ribonuclease+through+fibrin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels.</a> Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La stabilità del sistema a più livelli è un punto chiave per eseguire correttamente questo protocollo. Abbiamo teoricamente calcolato la diffusione delle molecole SF nella soluzione GelMA sulla base dello studio di Nauman13. Si è scoperto che la diffusione delle proteine in soluzione era correlata al loro peso molecolare. Il peso molecolare medio (MW) dell'albumina del siero bovino (BSA) è di 66,5 kDa, e il suo coefficiente di diffusione è 64-72 m2/s. L'MW medio di fibrinogeno è di 339,...

La biostampa tridimensionale (3D) è stato un metodo promettente per produrre complesse repliche architettoniche e funzionali dei tessuti nativi nella biofabbricazione e nella medicina rigenerativa1,2,3. Le strategie comuni di biostampa, tra cui la stampa a getto d'inchiostro, estrusione e stereolitografia, hanno pro e contro da diverse prospettive4. Tra queste tecniche, la procedura di estrusione è più comunemente utilizzata a causa della sua efficacia in termini di costi. Bioink svolge un ruolo chiave nella stabilità del processo di biostampa dell'estrusione. Il bioink carico di cellule ideale non deve essere solo biocompatibile, ma anche adatto per le proprietà meccaniche5. I bioink con bassa viscosità sono tipicamente presentati come uno stato liquido. Questi bioinks possono essere facilmente e rapidamente depositati ed evitare danni alla membrana cellulare indotti da un alto stress da taglio durante l'estrusione. Tuttavia, in casi complessi che richiedono periodi di stampa a lungo termine, la bassa viscosità spesso dà origine all'inevitabile sedimentazione delle cellule incapsulate nel serbatoio di bioinchiostro, che di solito è guidato dalla gravità e porta ad una dispersione cellulare inomogenea nel bioink6,7. Di conseguenza, un bioink con dispersione cellulare inomogenea ostacola la biostampa in vitro di un costrutto di tessuto funzionale.
Diversi studi recenti incentrati sui bioinks hanno segnalato la promozione della dispersione omogenea delle cellule incapsulate. Un bioinchiostro algerato modificato basato sul crosslinking a due stadi è stato utilizzato per la biostampa dell'estrusione8. Un polimero algerato è stato modificato con peptidi e proteine in questo studio. Le cellule presentavano una distribuzione più omogenea in questo alginato modificato rispetto all'alginato comunemente usato a causa dei siti di fissaggio forniti dai peptidi e dalle proteine. In alternativa, i bioink miscelati sono stati utilizzati per risolvere la sedimentazione delle cellule nel bioink. Un bioinchiostro miscelato contenente glicole di polietilene (PEG) e methacryloyl gelatina o gelatina (GelMA) con una maggiore robustezza meccanica è stato utilizzato in un altro studio9. Le cellule incapsulate presentavano una distribuzione omogenea principalmente perché la viscosità del bioinchiostro miscelato era migliorata. In generale, ci sono diversi fattori che influenzano la dispersione delle cellule incapsulate nel bioink, come la viscosità del bioink, la gravità delle cellule, la densità delle cellule e la durata del periodo di lavoro. Tra questi fattori, la gravità delle cellule svolge un ruolo fondamentale nel promuovere la sedimentazione. La galleggiabilità e l'attrito forniti dal bioink viscoso sono stati studiati come le principali forze contro la gravità fino ad oggi10.
In questo contesto, abbiamo sviluppato una nuova strategia per promuovere la dispersione omogenea delle cellule incapsulate nel bioink manipolando più interfacce liquide nel serbatoio di bioink. Queste interfacce liquide create dalla modifica multistrato del bioink possono non solo fornire ritenzione interfacciale, che ritarda la sedimentazione delle cellule, ma mantiene anche una compatibilità adeguata e il comportamento reologico del bioink. In pratica, abbiamo modificato la soluzione GelMA acquosa (5%, w/v) con fibroina di seta (SF) in modo multistrato per produrre longitudinalmente quattro interfacce, fornendo tensioni interfacciali nel bioink miscelato. Di conseguenza, il carico di gravità sulle cellule è stato compensato dalla tensione interfacciale artificiale, e una dispersione quasi omogenea delle cellule incapsulate nel bioink è stata ottenuta a causa di una minore sedimentazione attraverso gli strati adiacenti di cellule. Finora non è stato riportato alcun protocollo simile per rallentare la sedimentazione delle cellule incapsulate manipolando la ritenzione interfacciale nei bioinks liquidi. Vi presentiamo il nostro protocollo qui per dimostrare un nuovo modo di risolvere la sedimentazione cellulare in biostampa.

<table><tbody><tr><td>acido 2-idrossi-4&prime;-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone (PI2959)</td><td>TCI</td><td>M64BK-QD</td><td></td></tr><tr><td>acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10091</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900863MSDS</td><td></td></tr><tr><td>Anidride metacrilica (MA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685MSDS</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina... antibiotici della streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>fibroina della seta</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5154</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzo di bioinchiostro idrogel multistrato nella biostampa tridimensionale per la distribuzione omogenea delle cellule

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

Durante il processo di biostampa tridimensionale basato sull'estrusione, bioink simili a liquidi con bassa viscosità possono proteggere le cellule dai danni alla membrana indotti dallo stress da taglio e migliorare la sopravvivenza delle cellule incapsulate. Tuttavia, la rapida sedimentazione cellulare guidata dalla gravità nel serbatoio potrebbe portare a una distribuzione cellulare inomogenea in strutture biostampate e quindi ostacolare l'applicazione di bioinchi a forma di liquido. Qui, abbiamo sviluppato una nuova strategia modificata multistrato per bioinks simili a liquidi (ad esempio, la gelatina methacryloyl con bassa viscosità) per prevenire la sedimentazione di cellule incapsulate. Più interfacce liquide sono state manipolate nel bioink multistrato per fornire ritenzione interfacciale. Di conseguenza, l'azione di sedimentazione cellulare che attraversa strati adiacenti nel sistema multistrato è stata ritardata nel serbatoio del bioink. Si è scoperto che la ritenzione interfacciale era molto superiore all'attrazione sedimentale delle cellule, dimostrando un ruolo critico della ritenzione interfacciale nella prevenzione della sedimentazione cellulare e nel promuovere una dispersione più omogenea delle cellule nel bioink multistrato.

Uno schema della preparazione di bioinks carichi di cellule è illustrato nella Figura 1. Dopo la preparazione dei diversi bioinks, il carico, il riscaldamento e la biostampa sono stati eseguiti (Figura 2). Per valutare la distribuzione delle cellule incapsulate nel serbatoio di bioink, è stata eseguita una procedura di biostampa utilizzando tre diversi bioink carichi di cellule in tre piastre di 96 pozze(Figura 3A). Due gruppi di co...

Qui, abbiamo sviluppato una nuova strategia modificata multistrato per bioinks a forma di liquido (gelatina methacryloyl con bassa viscosità) per prevenire la sedimentazione di cellule incapsulate.

Utilizzo di Bioinchiostro idrogel multistrato nella biostampa tridimensionale per la distribuzione omogenea delle cellule

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

Utilizzando il nostro protocollo, la multistrato delle diluizioni bioink liquide non solo promuove una dispersione omogenea delle cellule incapsulate, ma mantiene anche un ambiente bioink adatto alle cellule. Utilizziamo la tensione interfacciale per fermare la sedimentazione delle cellule incapsulate all'interno del serbatoio del bioink, evitando l'elevato carico di sollecitazione di taglio alle cellule durante la stampa di estrusione. Utilizzando questa tecnologia, possiamo generare costrutti di tessuti 3D con una distribuzione cellulare omogenea, fornendo uno stampo funzionale in vitro per tessuti da utilizzare negli studi di medicina di screening e rigenerazione dei farmaci.Quando si prepara il bioink, è importante prestare attenzione alla temperatura sperimentale e alla procedura di caricamento dell'hygrogel, poiché questi fattori possono influire sulla qualità dell'inchiostro. Prima di iniziare la preparazione, utilizzare unità filtranti per siringhe da 0,22 micrometri per sterilizzare tutti i materiali e sciogliere la gelatina a una concentrazione finale del 10% in PBS a 50 gradi Celsius in un armadietto di sicurezza biologico. Aggiungere l'anidride metacrilica alla soluzione di gelatina con un rapporto di peso di 0,6 a uno con agitazione lenta per almeno un'ora a 50 gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione, trasferire la soluzione mista in un tubo sterile da 50 millilitri e separare la soluzione in strati mediante centrifugazione. Raccogliere lo strato superiore gelMA e diluire la soluzione raccolta con due volumi di acqua deionizzata da 40 a 50 gradi Celsius. Dializzare la soluzione GelMA con una membrana di dialisi di taglio del peso molecolare da 12 a 14 kilodalton contro l'acqua deionizzata per cinque-sette giorni a 40-50 gradi Celsius, cambiando l'acqua due volte al giorno.Alla fine della dialisi, congelare la soluzione GelMA a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Successivamente liofilizzare la soluzione GelMA per tre o cinque giorni in un essiccatore a congelamento a meno 45 gradi Celsius e 0,2 millibar di pressione. Quindi sciogliere il GelMA liofilizzato in PBS integrato con siero bovino fetale al 10%, HEPES 25 millimolare e fotoiniziatore allo 0,5%.Per ottenere i bioinchiostri GelMA fibroina di seta, mescolare la soluzione GelMA con diversi volumi di soluzione iniziale di fibroina di seta e diversi volumi di PBS come suggerito nella tabella. Quando tutti i bioinchiostri sono stati preparati, sonicare la soluzione per 10-20 minuti. Mentre gli inchiostri sono sonicanti, raccogliere le cellule da una coltura cellulare NIH/3T3 confluente all'80% in un tubo conico da 15 millilitri per soluzione di bioink e pelletare le cellule mediante centrifugazione.Quindi aspirare con cura i supernaganti e rimodulare le cellule in ogni tubo con due millilitri di bioilnk a una volta per 10 alle sei cellule per millilitro di concentrazione di soluzione di bioink. Per caricare il bioink per la stampa, aggiungere aspirati 400 microlitri di fibroina di seta carica di cellule 0,5 GelMA allo strato inferiore di una siringa da due millilitri. Mettere la siringa in un bagno d'acqua ghiacciata a zero gradi Celsius per cinque minuti per trasformare il bioink dello strato inferiore in uno stato gel prima di caricare 400 microlitri di fibroina di seta carica di cellule 0,75 Bioink GelMA sullo strato di fibroina di seta 0,5 GelMA.Quindi riportare la siringa al bagno di ghiaccio per cinque minuti, continuando ad aggiungere ogni concentrazione aggiuntiva di bioink carico di cellule alla siringa nello stesso modo. Quando è stato raggiunto un sistema di bioink multistrato con diverse concentrazioni di fibroina di seta all'interno dei diversi strati, surriscaldare il bioink in un incubatore di 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, caricare un ugello di stampa calibro 27 sulla siringa e impostare la velocità di flusso su 50 microlitri al minuto, la velocità di movimento dell'ugello a due millilitri al secondo e l'altezza dell'ugello a un millimetro.Successivamente stampare il costrutto di tessuto in modo estrusivo utilizzando un biostampatore su misura a temperatura ambiente e collegare il costrutto di tessuto biostampato con 365 nanometri di luce ultravioletta per 40 secondi a 800 milliwatt. Quindi coltura il costrutto di tessuto retitico in DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% e 1%penicillina-streptomicina in un incubatore di coltura cellulare, cambiando il mezzo ogni otto ore durante i primi due giorni e ogni due o tre giorni dopo. In questa analisi rappresentativa, man mano che la procedura di biostamgrafia progrediva, la densità delle cellule nei pozzi bersaglio è diminuita in tutti i gruppi.Nel gruppo GelMA zero fibroina di seta, circa il 70% delle cellule sono state depositate nello strato inferiore. Nella fibroina di seta un gruppo GelMA, circa il 40% delle cellule sono state depositate nello strato inferiore e circa il 5% delle cellule sono state depositate nello strato superiore. Nel gruppo GelMA multistrato di fibroina di seta, la deposizione di cellule incapsulate era più omogenea di quella dei gruppi di controllo.La parte più critica di questo protocollo è il caricamento dei multistrati bioink SF-GelMA. Questo protocollo può essere applicato ad altre analisi di biostamce di estrusione che utilizzano bioinchiostri liquidi.

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Presentato qui è un metodo per la biostampa 3D di gelatina methacryloyl.

Protocolli di biostampa 3D di Gelatin Abasecryloyl Hydrogel Based Bioinks

Questo protocollo evidenzia un metodo per valutare rapidamente la biocompatibilità di un inchiostro biomateriale idrogel composito di nanocellulosa cristallina (CNC)/agarosio con mastociti derivati dal midollo osseo di topo in termini di vitalità cellulare ed espressione fenotipica dei recettori della superficie cellulare, Kit (CD117) e recettore IgE ad alta affinità (FcεRI).

Fabbricazione di un inchiostro biomateriale di agarosio incorporato in nanocellulosa cristallina per la coltura di mastociti derivati dal midollo osseo

Questo articolo descrive come biostampare in 3D idrogel fototabili per studiare l'irrigidimento della matrice extracellulare e l'attivazione dei fibroblasti.

Idrogel fotoregistrabili in bioprinting 3D per studiare l'attivazione dei fibroblasti

Questo studio introduce un nuovo bagno di sospensione sub-microgel di κ-carragenina, che mostra notevoli proprietà di transizione reversibile di inceppamento-sbloccaggio. Questi attributi contribuiscono alla costruzione di tessuti e organi biomimetici nel bioprinting 3D incorporato. La stampa di successo di tessuti simili al cuore/all'esofago con alta risoluzione e crescita cellulare dimostra applicazioni di bioprinting e ingegneria tissutale di alta qualità.

Bioprinting incorporato di strutture simili a tessuti utilizzando il terreno sub-microgel di κ-carragenina

Scopri la biostampa 3D con bioinchiostro multistrato a base di gelatin metacrilato per prevenire la sedimentazione cellulare. Questo metodo garantisce una distribuzione omogenea delle cellule per applicazioni in medicina rigenerativa.

Utilizzo di Bioinchiostro idrogel multistrato nella biostampa tridimensionale per la distribuzione omogenea delle cellule

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