Analisi dei difetti cardiaci congeniti negli embrioni dei topi utilizzando metodi istologici qualitativi e quantitativi

Questo protocollo standardizza nuove tecniche di analisi tissutale in modo che possano essere più ampiamente utilizzate da altri gruppi che studiano anche difetti cardiaci congeniti. Poiché le tecniche di analisi sia qualitative che quantitative hanno i loro pro e contro, questa metodologia utilizza sia per affrontare la più ampia gamma di domande sperimentali. Queste tecniche possono avere un impatto positivo sui metodi diagnostici di cardiologia.

Ad esempio, i patologi potrebbero applicare le nostre microscopiche tecniche di analisi dei tessuti cardiaci per diagnosticare le malattie cardiache umane da campioni di biopsia. Questo protocollo può essere utilizzato per la cardiologia dello sviluppo o la ricerca cardiologica generale. Tuttavia, questi metodi forniscono anche varie tecniche utili che possono essere applicate a qualsiasi analisi tissutale.

Per raccogliere il giorno embrionale da 15 a 15,5 cuori, fissare gli arti di una diga incinta e iniziare intorno all'uretra fino allo sterno, fare con cura un'incisione a forma di I lungo il busto. Usando le forcep in un movimento di scooping, sollevare delicatamente l'utero dalla cavità addominale afferrando i tessuti superficiali dell'utero se necessario con forcelle fini per aiutare nell'estrazione. Usa le forbici per rilasciare l'utero dall'addome.

Dopo aver immerso l'utero in PBS ghiacciato, inchiodare l'organo in un piatto di dissezione. Usando le forbici, tagliare l'utero in singole sezioni ognuna contenente un embrione separato. Utilizzando due paia di forcelle fini, sbucciare delicatamente gli embrioni dal tessuto uterino e metterli in una nuova piastra di Petri contenente quattro gradi Celsius PBS-EDTA.

Per raccogliere i cuori, posizionare il piatto al microscopio di sezionamento e utilizzare due paia di forcep fini per posizionare l'embrione nella posizione supina. Dopo aver stabilizzato l'accesso al torace, utilizzare il punto acuto di una seconda coppia di forcelle fini per fare un'incisione lungo lo sterno dell'embrione che si estende tra le claviole fino all'ombelico. Facendo incisioni molto fini e superficiali mentre si lavora gradualmente verso l'interno della cavità toracica, aprire l'addome dell'embrione.

Quando il cuore diventa visibile, usa un paio di forcep per spremere il busto leggermente coccolato nella gabbia toracica per sbucciare le costole. Usando i lati di una coppia di forcelle, afferrare delicatamente i vasi sanguigni polmonari senza separare il tessuto e estrarre il cuore dalla cavità. Pulire il cuore in PBS-EDTA fresco per uno o due minuti prima di fissare il tessuto in paraformaldeide al 4% per 45-60 minuti.

Quindi, lavare il cuore tre volte per 5-10 minuti per lavaggio in PBS integrato con glicina. Prima di conservare i cuori in PBS a quattro gradi Celsius. Per preparare il cuore alla criosezione, posizionare i campioni in un tubo del 30% di saccarosio e PBS a quattro gradi Celsius per 24-40 ore.

Quando i cuori sono affondati sul fondo del tubo, utilizzare una pipetta Pasteur con una punta modificata per trasferire con cura ogni cuore in un pezzo di salvietta priva di pelucchi. Dopo una breve asciugatura ad aria, posizionare ogni campione in singoli stampi di temperatura di taglio ottimali negli orientamenti desiderati per il sezionamento. Immergere i tessuti in un mezzo di temperatura di taglio ottimale senza bolle.

Quindi, conservare gli stampi a 20 gradi Celsius per un massimo di pochi giorni prima di congelare i tessuti a 80 gradi Celsius per almeno 24 ore prima della criosezione. Per ottenere sezioni criostatiche dei campioni, utilizzare un nuovo mezzo di taglio ottimale della temperatura per attaccare il blocco tissutale di interesse al mandrino del criostato e lasciare congelare il mezzo fino a quando non è bianco opaco. Inserire una nuova lama e regolare la distanza tra il blocco tissutale e la lama per consentire di ottenere sezioni.

Tagliare il blocco in 10 fette di micrometro fino a raggiungere il punto di interesse. Quando il tessuto può essere osservato, utilizzare un piccolo pennello piatto per tirare delicatamente la fetta contro il supporto in un movimento di taglio continuo. Una volta che il tessuto è stato completamente tagliato, utilizzare il pennello di dettaglio per accarezzare la fetta piatta contro il palco.

Tenere la sezione in posizione per circa 20-30 secondi prima di rimuovere il pennello dettagliato e finire la fetta. Utilizzare entrambi i pennelli per appiattire delicatamente la fetta contro il palco impedendo qualsiasi rotolamento e tenere la sezione del tessuto contro lo stadio. Dopo 20-30 secondi, capovolgere la sezione e appiattirla nuovamente contro il palco prima di posizionare una diapositiva caricata elettrostaticamente abbastanza vicino da poter attrarre la fetta e aderire alla diapositiva senza dover toccare la diapositiva sul palco.

Per valutare le sezioni del tessuto cardiaco per la presenza di comuni difetti cardiaci, utilizzando un microscopio dotato di una fotocamera, ottenere immagini a ingrandimento da 5 a 10X e 40X. Per l'analisi della compattazione muscolare cardiaca, aprire un tessuto di interesse in un programma software di analisi delle immagini appropriato e impostare l'immagine su 8 bit. Per impostare la soglia dell'immagine, fare clic su Immagine, Regola e Soglia e spostare la barra superiore per regolare la soglia fino a selezionare solo i pixel per lo sfondo.

Utilizzare quindi lo strumento selezione poligonale per disegnare una regione di interesse attorno al tessuto, quindi fare clic su Analizza, Imposta misure, Area e Limite alla soglia. Fate clic su Analizza (Analyze) e misura (Measure) per misurare l'area dei pixel evidenziati per ottenere il valore dell'area dello spazio negativo. Per misurare l'area dell'intera area di interesse, fare clic su Analizza, Imposta misurazioni e deselezionare Limita alla soglia.

Quindi, selezionare Analizza e misura per misurare l'intera area dell'area di interesse selezionata. Per calcolare l'area del tessuto muscolare, sottrarre l'area dello spazio negativo dall'area della regione di interesse. Quindi dividere l'area del tessuto muscolare per l'area della regione di interesse per calcolare la compattazione muscolare e X.La colorazione delle fette di tessuto dai cuori embrionali raccolti, fornisce un contrasto sufficiente per capire i bordi del tessuto, ma non è così scura da rendere le caratteristiche cellulari indistinguibili.

In questa analisi rappresentativa, la compattazione muscolare è stata osservata essere significativamente ridotta nei cuori sperimentali rispetto agli embrioni che si sono sviluppati in condizioni non sperimentali. Questi campioni sono preziosi e richiedono molto tempo per essere creati. Durante le necroscopia e il sessamento del criostato in particolare, assicurati di essere intenzionale su ogni azione che esegui.

La conservazione dei tessuti in Paraformaldeide mantiene l'attività antigene che consente di utilizzare i campioni per prove come la colorazione dell'amminofluoresceina che aiutano a identificare le cause patologiche riscontrate durante la valutazione morfologica. Nel nostro laboratorio, abbiamo ottenuto la rappresentazione quantitativa di trattamenti sperimentali che possono aiutarci a identificare il grado in cui i diversi trattamenti influenzano i nostri campioni. La paraformaldeide può riparare qualsiasi tessuto che tocca.

Fare attenzione a indossare sempre guanti per ridurre al minimo la pelle esposta e lavorare in una cappa da film ogni volta che si lavora con questa sostanza chimica.