Name: Analisi dei difetti cardiaci congeniti negli embrioni dei topi utilizzando metodi istologici qualitativi e quantitativi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Scopri tecniche standardizzate di analisi tissutale qualitativa e quantitativa per lo studio dei difetti cardiaci congeniti nei topi. Questo metodo migliora la ricerca in cardiologia e la diagnosi delle malattie cardiache.

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L'Aguirre Lab è supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health sotto il numero di premio K01HL135464 e dall'American Heart Association sotto il premio numero 19IPLOI34660342.

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Gli autori non hanno alcuna divulgazione da segnalare.

Questo protocollo esplora le tecniche coinvolte nell'analisi dello sviluppo cardiaco nei cuori embrionali. Alcune limitazioni di questo metodo sono la destrezza fisica richiesta per le tecniche preparatorie, che possono richiedere pratica, e abilità con l'imaging al microscopio. Se le fette ottenute al criostato sono disordinate, la colorazione ematossialina ed eosina non sarà chiara, o se le immagini scattate al microscopio hanno scarsa illuminazione, il metodo utilizzato con ImageJ non funzionerà. Una limitazione della...

Le CHD sono il tipo più comune di difetto alla nascita nell'uomo e sono la principale causa di decessi correlati ai difetti alla nascita1,2,3,4,5,6. Anche se circa il 90% dei neonati sopravvive alla CHD, è spesso associata a una significativa morbilità e interventi medici nel corso degli anni, imponendo un pesante onere alla vita dei pazienti e al sistema sanitario7,8,9,10. Al di fuori di fattori puramente genetici, le cause della CHD sono poco comprese4. Le cause non identificate rappresentano il 56-66% di tutti i casi di CHD secondo l'American Heart Association e altre fonti2,3,4,11. I fattori ben noti includono mutazioni genetiche, CNV, varianti a singolo nucleotide de novo e aneuploidia. Si sospetta che anche i fattori ambientali e dietetici siano fonti importanti che contribuiscono alla CHD, come suggerito da studi epidemiologici che collegano lo stile di vita materno2,12, privazione economica e razza13,e dalla ricerca su fattori come l'acido folico11,14 e l'acido retinoico lipidico bioattivo15,16. Lo studio dei meccanismi e delle cause della CHD e di altri difetti cardiovascolari è importante sviluppare strategie preventive e nuove opzioni terapeutiche1,4,17,18,19.
Il topo in via di sviluppo è un modello fondamentale per studiare la CHD nei mammiferi. Tuttavia, alcuni dei metodi e delle analisi impiegati, come le dissezioni che preservano la morfologia del cuore, l'analisi delle fasi di sviluppo e l'identificazione dei difetti associati alla CHD, possono essere scoraggianti per gli scienziati che sono nuovi all'analisi dei cuori murini. L'obiettivo dei metodi descritti in questo protocollo è quello di offrire linee guida qualitative e quantitative per questi processi. Così, in questo protocollo spieghiamo come eseguire accoppiamenti a tempo per produrre embrioni dello stadio gestazionale desiderato, sezionare le femmine incinte per il recupero del cuore intatto (compresi i tessuti associati come il tratto di deflusso), la fissazione del cuore e la preparazione per criostatista, metodi di istologia di base, analisi quantitative dei difetti cardiaci comuni e analisi qualitativa della compattazione del muscolo cardiaco, un fenomeno precursore comune ad alcuni tipi di CHD.

<table><tbody><tr><td>Provette coniche da 15 mLFisher</td> <td>Scientific</td><td># 1495970C</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Topi</td><td>Jackson Labs</td><td>C57BL/6J - stock 000664</td><td></td></tr><tr><td>Barattoli per colorazione Coplin (x6)</td><td>VWR Scientific</td><td># 25457-006</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 24X50MM #1.5</td><td>VWR Scientific</td><td># 48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Criostato - Leica CM3050S</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td> <td>Scientific</td><td># 50930381</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinze fini (x2)</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td># 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y Solution</td><td>Millipore Sigma</td><td># HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico (puro, 200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td># BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td># E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Millipore Sigma</td> <td># 03989-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>Strumenti di scienza</td> <td>fine # 14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio fluorescente Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Millipore Sigma</td> <td># 410225-250G</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forcipe</td><td>Strumenti di scienza fine</td> <td># 11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 8 Software</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td># 06666A</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ematossilina di Mayer</td><td>Millipore Sigma</td><td># MHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Puntale/i per micropipette - p200</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02707448</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>VWR Scientific</td><td># 102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CkX53 Microscopio</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pennelli (almeno 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>VWR Scientific</td><td># 0215014601</td><td>Trasformare in soluzione al 4% (disciolto in PBS)</td></tr><tr><td>Pipetta/e PasteurFisher</td> <td>Scientific</td><td># 13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 70011044</td><td>Diluire da 10x a 1x prima di utilizzare</td></tr><tr><td>Scale</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS1602TS</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS105</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Handle #3</td><td>VWR Scientific</td><td># 10161-918</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi</td><td>VWR Scientific</td> <td># 21909-612</td><td></td></tr><tr><td>Stampo quadrato</td><td>VWR Scientific</td> <td># 100500-224</td><td>Per stampi OCT</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Millipore Sigma</td> <td># S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td> <td># 1255015</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Fine Science Tools</td> <td># 14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Lame per microtomo monouso Tissue-Tek Accu-Edge</td><td>VWR Scientific</td><td># 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia da viaggio</td><td>Acculab</td><td>VIC 5101</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Millipore Sigma</td><td>214736-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi dei difetti cardiaci congeniti negli embrioni dei topi utilizzando metodi istologici qualitativi e quantitativi

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

I difetti cardiaci congeniti (CHD) sono il tipo più comune di difetto alla nascita nell'uomo, che colpisce fino all'1% di tutte le nascite vive. Tuttavia, le cause alla base della CHD sono ancora poco conosciute. Il topo in via di sviluppo costituisce un modello prezioso per lo studio della CHD, perché i programmi di sviluppo cardiaco tra topi e esseri umani sono altamente conservati. Il protocollo descrive in dettaglio come produrre embrioni di topo dello stadio gestazionale desiderato, metodi per isolare e preservare il cuore per l'elaborazione a valle, metodi quantitativi per identificare i tipi comuni di CHD mediante istologia (ad esempio, setto ventricolare difetti, difetti del setto atriale, dotto brevettato arteriosus) e metodi di storitomorfometria quantitativa per misurare i fenotipi comuni della compattazione muscolare. Questi metodi articolano tutti i passaggi coinvolti nella preparazione, raccolta e analisi dei campioni, consentendo agli scienziati di misurare correttamente e riproducibilmente la CHD.

L'indice di compattazione muscolare è stato confrontato tra cuori che si sviluppano in due ambienti diversi, un controllo e un gruppo sperimentale. Questi protocolli sono stati utilizzati per analizzare quantitativamente la compattazione del tessuto muscolare, che ha permesso l'analisi statistica. La compattazione muscolare ha dimostrato di essere significativamente ridotta nei cuori sperimentali rispetto agli embrioni che si sono sviluppati in condizioni non sperimentali.
<p class="j...

In questo protocollo, descriviamo le procedure per analizzare qualitativamente e quantitativamente i fenotipi dello sviluppo nei topi associati a difetti cardiaci congeniti.

Analisi dei difetti cardiaci congeniti negli embrioni dei topi utilizzando metodi istologici qualitativi e quantitativi

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Questo protocollo standardizza nuove tecniche di analisi tissutale in modo che possano essere più ampiamente utilizzate da altri gruppi che studiano anche difetti cardiaci congeniti. Poiché le tecniche di analisi sia qualitative che quantitative hanno i loro pro e contro, questa metodologia utilizza sia per affrontare la più ampia gamma di domande sperimentali. Queste tecniche possono avere un impatto positivo sui metodi diagnostici di cardiologia.Ad esempio, i patologi potrebbero applicare le nostre microscopiche tecniche di analisi dei tessuti cardiaci per diagnosticare le malattie cardiache umane da campioni di biopsia. Questo protocollo può essere utilizzato per la cardiologia dello sviluppo o la ricerca cardiologica generale. Tuttavia, questi metodi forniscono anche varie tecniche utili che possono essere applicate a qualsiasi analisi tissutale.Per raccogliere il giorno embrionale da 15 a 15,5 cuori, fissare gli arti di una diga incinta e iniziare intorno all'uretra fino allo sterno, fare con cura un'incisione a forma di I lungo il busto. Usando le forcep in un movimento di scooping, sollevare delicatamente l'utero dalla cavità addominale afferrando i tessuti superficiali dell'utero se necessario con forcelle fini per aiutare nell'estrazione. Usa le forbici per rilasciare l'utero dall'addome.Dopo aver immerso l'utero in PBS ghiacciato, inchiodare l'organo in un piatto di dissezione. Usando le forbici, tagliare l'utero in singole sezioni ognuna contenente un embrione separato. Utilizzando due paia di forcelle fini, sbucciare delicatamente gli embrioni dal tessuto uterino e metterli in una nuova piastra di Petri contenente quattro gradi Celsius PBS-EDTA.Per raccogliere i cuori, posizionare il piatto al microscopio di sezionamento e utilizzare due paia di forcep fini per posizionare l'embrione nella posizione supina. Dopo aver stabilizzato l'accesso al torace, utilizzare il punto acuto di una seconda coppia di forcelle fini per fare un'incisione lungo lo sterno dell'embrione che si estende tra le claviole fino all'ombelico. Facendo incisioni molto fini e superficiali mentre si lavora gradualmente verso l'interno della cavità toracica, aprire l'addome dell'embrione.Quando il cuore diventa visibile, usa un paio di forcep per spremere il busto leggermente coccolato nella gabbia toracica per sbucciare le costole. Usando i lati di una coppia di forcelle, afferrare delicatamente i vasi sanguigni polmonari senza separare il tessuto e estrarre il cuore dalla cavità. Pulire il cuore in PBS-EDTA fresco per uno o due minuti prima di fissare il tessuto in paraformaldeide al 4% per 45-60 minuti.Quindi, lavare il cuore tre volte per 5-10 minuti per lavaggio in PBS integrato con glicina. Prima di conservare i cuori in PBS a quattro gradi Celsius. Per preparare il cuore alla criosezione, posizionare i campioni in un tubo del 30% di saccarosio e PBS a quattro gradi Celsius per 24-40 ore.Quando i cuori sono affondati sul fondo del tubo, utilizzare una pipetta Pasteur con una punta modificata per trasferire con cura ogni cuore in un pezzo di salvietta priva di pelucchi. Dopo una breve asciugatura ad aria, posizionare ogni campione in singoli stampi di temperatura di taglio ottimali negli orientamenti desiderati per il sezionamento. Immergere i tessuti in un mezzo di temperatura di taglio ottimale senza bolle.Quindi, conservare gli stampi a 20 gradi Celsius per un massimo di pochi giorni prima di congelare i tessuti a 80 gradi Celsius per almeno 24 ore prima della criosezione. Per ottenere sezioni criostatiche dei campioni, utilizzare un nuovo mezzo di taglio ottimale della temperatura per attaccare il blocco tissutale di interesse al mandrino del criostato e lasciare congelare il mezzo fino a quando non è bianco opaco. Inserire una nuova lama e regolare la distanza tra il blocco tissutale e la lama per consentire di ottenere sezioni.Tagliare il blocco in 10 fette di micrometro fino a raggiungere il punto di interesse. Quando il tessuto può essere osservato, utilizzare un piccolo pennello piatto per tirare delicatamente la fetta contro il supporto in un movimento di taglio continuo. Una volta che il tessuto è stato completamente tagliato, utilizzare il pennello di dettaglio per accarezzare la fetta piatta contro il palco.Tenere la sezione in posizione per circa 20-30 secondi prima di rimuovere il pennello dettagliato e finire la fetta. Utilizzare entrambi i pennelli per appiattire delicatamente la fetta contro il palco impedendo qualsiasi rotolamento e tenere la sezione del tessuto contro lo stadio. Dopo 20-30 secondi, capovolgere la sezione e appiattirla nuovamente contro il palco prima di posizionare una diapositiva caricata elettrostaticamente abbastanza vicino da poter attrarre la fetta e aderire alla diapositiva senza dover toccare la diapositiva sul palco.Per valutare le sezioni del tessuto cardiaco per la presenza di comuni difetti cardiaci, utilizzando un microscopio dotato di una fotocamera, ottenere immagini a ingrandimento da 5 a 10X e 40X. Per l'analisi della compattazione muscolare cardiaca, aprire un tessuto di interesse in un programma software di analisi delle immagini appropriato e impostare l'immagine su 8 bit. Per impostare la soglia dell'immagine, fare clic su Immagine, Regola e Soglia e spostare la barra superiore per regolare la soglia fino a selezionare solo i pixel per lo sfondo.Utilizzare quindi lo strumento selezione poligonale per disegnare una regione di interesse attorno al tessuto, quindi fare clic su Analizza, Imposta misure, Area e Limite alla soglia. Fate clic su Analizza (Analyze) e misura (Measure) per misurare l'area dei pixel evidenziati per ottenere il valore dell'area dello spazio negativo. Per misurare l'area dell'intera area di interesse, fare clic su Analizza, Imposta misurazioni e deselezionare Limita alla soglia.Quindi, selezionare Analizza e misura per misurare l'intera area dell'area di interesse selezionata. Per calcolare l'area del tessuto muscolare, sottrarre l'area dello spazio negativo dall'area della regione di interesse. Quindi dividere l'area del tessuto muscolare per l'area della regione di interesse per calcolare la compattazione muscolare e X.La colorazione delle fette di tessuto dai cuori embrionali raccolti, fornisce un contrasto sufficiente per capire i bordi del tessuto, ma non è così scura da rendere le caratteristiche cellulari indistinguibili.In questa analisi rappresentativa, la compattazione muscolare è stata osservata essere significativamente ridotta nei cuori sperimentali rispetto agli embrioni che si sono sviluppati in condizioni non sperimentali. Questi campioni sono preziosi e richiedono molto tempo per essere creati. Durante le necroscopia e il sessamento del criostato in particolare, assicurati di essere intenzionale su ogni azione che esegui.La conservazione dei tessuti in Paraformaldeide mantiene l'attività antigene che consente di utilizzare i campioni per prove come la colorazione dell'amminofluoresceina che aiutano a identificare le cause patologiche riscontrate durante la valutazione morfologica. Nel nostro laboratorio, abbiamo ottenuto la rappresentazione quantitativa di trattamenti sperimentali che possono aiutarci a identificare il grado in cui i diversi trattamenti influenzano i nostri campioni. La paraformaldeide può riparare qualsiasi tessuto che tocca.Fare attenzione a indossare sempre guanti per ridurre al minimo la pelle esposta e lavorare in una cappa da film ogni volta che si lavora con questa sostanza chimica.

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Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Morte fetale e perinatale è una caratteristica comune quando si studiano le alterazioni genetiche che influenzano lo sviluppo cardiaco. Alta frequenza ecografia ha migliorato 2-D risoluzione e può fornire informazioni excellent precoce sviluppo cardiaco ed è un metodo ideale per rilevare l'impatto sulla struttura e funzione cardiaca prima della morte.

Murine ecocardiografia fetale

Ultra-ultrasuoni ad alta frequenza è un potente strumento di imaging dal vivo per esaminare anomalie cardiache nei piccoli animali. La sua invasività consente di mantenere lo stato fisiologico di embrioni. Qui, vi mostriamo l'uso di M-mode ultrasuoni per misurare le frequenze cardiache di embrioni a E18.5 in utero.

In utero Misurazione della frequenza cardiaca in mouse da non invasiva ecocardiografia M-mode

Le mutazioni che portano a difetti cardiaci congeniti beneficiano dell'indagine in vivo della struttura cardiaca durante lo sviluppo, ma gli studi strutturali ad alta risoluzione nel cuore embrionale di topo sono tecnicamente impegnativi. Qui presentiamo un robusto metodo di immunofluorescenza e analisi delle immagini per valutare le strutture specifiche dei cardiomiociti nel cuore del topo in via di sviluppo.

Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

L'esame ecocardiografico è frequente nei topi. Sono stati sviluppati dispositivi costosi ultrasuono ad alta definizione per questo scopo. Questo protocollo descrive una procedura ecocardiografica conveniente combinata con analisi morfometriche istologico per determinare la morfologia cardiaca.

Esame ecocardiografico ed istologico della morfologia cardiaca nel topo

Qui, descriviamo un protocollo per immunofluorescenza intero supporto e basate su immagine quantitativa analisi volumetrica degli embrioni del mouse in fase precoce. Presentiamo questa tecnica come un potente approccio qualitativamente e quantitativamente valutare strutture cardiache durante lo sviluppo e proponiamo che possa essere ampiamente adattabile ad altri sistemi dell'organo.

Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo

Formazione immagine di ultrasuono ad alta frequenza del mouse fetale ha migliorato imaging ad alta risoluzione e può fornire precisa caratterizzazione non invasiva di sviluppo cardiaco e difetti strutturali. Il protocollo descritto nel presente documento è stato progettato per eseguire ecocardiografia fetale in tempo reale di topi in vivo.

Fetali del Mouse cardiovascolari Imaging mediante un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza (30 / 45MHZ)

Vi presentiamo i protocolli per esaminare lo sviluppo del cuore del mouse usando la microscopia intero Monte epifluorescente su embrioni di topo sezionati da ventricolare specifico MLC-2v-tdTomato reporter topi knock-in. Questo metodo permette di visualizzare direttamente ogni fase della formazione ventricolare durante lo sviluppo del cuore del mouse senza laboriosi metodi istochimici.

Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

Questo articolo descrive in dettaglio i metodi diagnostici di cardiopatia congenita murina (CHD) utilizzando l'ecocardiografia fetale, la necroscopia e l'acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) utilizzando la microscopia confocale episcopica (ECM) seguita da ricostruzione tridimensionale (3D).

Una pipeline per caratterizzare i difetti cardiaci strutturali nel topo fetale

Qui segnaliamo la doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale e dei vasi sanguigni utilizzando l'innesto intraspecie del tubo neuraleGFP del pulcino combinato con l'iniezione di DiI intra-vascolare. Questa tecnica sperimentale ci permette di visualizzare e studiare contemporaneamente lo sviluppo del sistema nervoso derivato dall'NCC (enterico) e del sistema vascolare, durante l'organogenesi.

Doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale e dei vasi sanguigni all'interno degli embrioni di pollo utilizzando l'innesto del tubo neuraleGFP del pulcino e l'iniezione di colorante carbocianina

Qui, vi presentiamo un protocollo per iniettare mezzi di contrasto ecografici microbolle in vita, isolata tardo-gestazione di embrioni murini stage. Questo metodo consente lo studio dei parametri di perfusione e di marcatori molecolari vascolari all'interno dell'embrione con mdc alta frequenza ecografica.

Contrast Imaging in embrioni di topo Utilizzo ad alta frequenza Ultrasound

Scopri tecniche standardizzate di analisi tissutale qualitativa e quantitativa per lo studio dei difetti cardiaci congeniti nei topi. Questo metodo migliora la ricerca in cardiologia e la diagnosi delle malattie cardiache.

Analisi dei difetti cardiaci congeniti negli embrioni dei topi utilizzando metodi istologici qualitativi e quantitativi

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