Name: Imaging a cellule vive di microtubulo citoscheletro e manipolazione micromeccanica del meristem apicale del germoglio di arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Scopri l'imaging a cellule vive del citoscheletro microtubulare nel meristema apicale del germoglio di Arabidopsis. Questo metodo quantitativo rivela le risposte meccaniche dei microtubuli a forze fisiche.

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1. Crescita delle piante
<ol><li>Seminare semi arabidopsis che esprimono il dominio legante del microtubulo fuso con proteine fluorescenti verdi (MBD-GFP)10 sul terreno e conservare in una lunga giornata (16 ore al giorno / 8 h notte), 20 ° C / 6 ° C condizioni per 1 settimana per la germinazione.</li>
	<li>Dopo la germinazione, trasferire le piantine in nuovi vasi con spazio di crescita sufficiente per consentire una robusta crescita vegetativa. Conservare le piante in breve giorno (8 ore al giorno /16 ore notturne), 20 °C/16 °C per 3-5 settimane.</li>
	<li>Trasferire gli impianti in una lunga giornata (16 ore al giorno /8 ore di notte), 20 °C/16 °C e conservare fino a quando le piante non si imbullonono (2-3 settimane). Lasciare crescere l'infiorescenza fino a 2-5 cm di lunghezza.</li>
</ol>2. Preparazione media
<ol><li>Preparare le sezionazioni riempiendo piccole piastre di Petri (larghe circa 5,5 cm, profonde 1,5 cm) a circa la metà della loro profondità con il 2% di agarosio. I piatti di sezionazione potrebbero anche essere utilizzati per l'imaging a punto singolo.</li>
	<li>Preparare il mezzo di crescita.<ol>
<li>Preparare 50 mL di una soluzione di stock vitaminico 1.000x con 5 g di mio-inositolo, 0,05 g di acido nicotinico, 0,05 g di cloridrato di piridossina, 0,5 g di cloridrato di tiammina e 0,1 g di glicina.</li>
		<li>Preparare il mezzo di crescita, composto da 1/2 Murashige e Skoog medium, 1% saccarosio, 1,6% agar, 1x vitamine, pH = 5,8. Autoclave e lasciare raffreddare.</li>
		<li>Su una panca sterile e pulita, sterilizzare scatole di plastica incernierate (circa 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) immergendosi nel 70% di etanolo per 15 minuti.</li>
		<li>Su una panca sterile e pulita, una volta che il mezzo è al calore sopportabile, aggiungere N6-benziladenina a una concentrazione finale di 200 nM e 1/1.000 PPM (miscela conservante vegetale) e mescolare bene. Riempire le scatole sterili a circa la metà della loro profondità con il mezzo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dissezione del MAS
<ol><li>Tagliare l'infiorescenza e rimuovere i boccioli di fiori più vecchi con pinze affilate sbucciando i fiori alla base dei peduncoli fino a quando non è difficile vederli ad occhio nudo.</li>
	<li>Creare una fessura nell'agarosio nel piatto di sezionamento con le forcep e piantare la base di infiorescenza nell'agar spesso. Questo dà un buon supporto solido per un'ulteriore dissezione fine dei fiori più giovani per esporre il MAS.</li>
	<li>Rimuovere i boccioli di fiori rimanenti spingendoli verso il basso con le forcep a partire dal più antico e avanzando sequenzialmente verso gli stadi più giovani sotto un microscopio sezionante fino a quando il MAS non è visibile. Il MAS è solitamente esposto quando i fiori più vecchi fino allo stadio da 6 a 7 vengono rimossi. Una volta esposto il MAS, evitare la disidratazione del campione spostandosi rapidamente al passaggio successivo.</li>
</ol>4. Trasferimento e crescita di MAS coltivate
<ol><li>Piantare il campione appena sezionato come descritto nella sezione 1 nel mezzo di crescita nella scatola rettangolare di coltura incernierata in plastica con il SAM appena esposto sopra la superficie media. Aggiungere alcune gocce di acqua deionizzata sterile ai bordi delle scatole di coltura e chiudere il coperchio per mantenere l'umidità all'interno della scatola. Assicurarsi che l'acqua aggiunta non copra il MAS.</li>
	<li>Chiudere il coperchio e avvolgere la scatola con nastro micropore. Posizionare la scatola di crescita in condizioni di lunga giornata o di giornata continua a 22 °C e crescere per 12-24 ore per consentire al SAM di riprendersi dalla procedura di dissezione e adattarsi alle condizioni di coltura.</li>
</ol>5. Imaging del MAS
<ol><li>Riempire la scatola di coltura contenente il MAS con acqua deionizzata sterile per coprire il campione. Controllare al microscopio di sezionazione e rimuovere eventuali bolle d'aria spruzzando forzatamente acqua diretta al campione con una pipetta da 1 mL.</li>
	<li>Posizionare la scatola delle impostazioni cultura su uno stadio di microscopio confocale verticale. Fare attenzione che la scatola delle impostazioni cultura non contatti gli obiettivi del microscopio. Utilizzare una lente di immersione dell'acqua a lunga distanza 40x o 60x di apertura numerica 0,8-1 ottimale per l'imaging senza vetro di copertura.</li>
	<li>Abbassare l'obiettivo nell'acqua e verificare la presenza di bolle d'aria formate sull'obiettivo anteriore dell'obiettivo. Rimuovere eventuali bolle abbassando lo stadio e pulendo delicatamente l'obiettivo con un tessuto ottico e aggiungendo una piccola quantità di acqua alla lente anteriore dell'obiettivo con una pipetta Pasteur prima della reimmersione nell'acqua.</li>
	<li>Utilizzando il filtro GFP e il modulo di epi-illuminazione del microscopio confocale, regolare il controller XY per localizzare il campione. Regolando la posizione dell'oculare, mettere il MAS direttamente sotto la sorgente luminosa e mettere a fuoco lungo l'asse Z fino a quando l'apice non si trova. NOTA: Non guardare direttamente la luce ultravioletta.</li>
	<li>Una volta trovato il campione, illuminarlo utilizzando un laser in grado di eccitanti GFP (cioè una sorgente laser a 488 nm o 496 nm). Regolare lo zoom ottico del microscopio in modo che l'intero SAM e il primordia floreale di fase 1 siano nel campo visivo. Regolare ulteriormente la potenza delle impostazioni di uscita e guadagno del laser per garantire un rapporto segnale-rumore ottimale. NOTA: L'alta intensità del laser comporterà lo sbiancamento fotografico del campione. La tavolozza sottoesposizione e sovraesposizione contribuisce a garantire una migliore regolazione di queste impostazioni.</li>
	<li>Lasciare depositare il campione per 2-5 minuti. Acquisire pile Z confocali del campione a intervalli di fette 0,25 μm-0,5 μm Z con una risoluzione di circa 0,3 μm di dimensione in pixel. Assicurarsi che il tempo totale di imaging richiesto per l'acquisizione di pile Z per un campione non superi i 10 minuti dal momento in cui il campione viene immerso in acqua fino al completamento dell'acquisizione.</li>
	<li>Rimuovere immediatamente l'acqua e trasferire la scatola di coltura nella camera di crescita. Mantenere i campioni a lungo sott'acqua influenzerà lo stato osmotico delle cellule.</li>
</ol>6. Perturbazione micromeccanica del MAS
<ol><li>Impostare le condizioni di imaging come descritto nella sezione 5 e acquisire pile di immagini di preablazione dell'organizzazione dei microtubuli corticali.</li>
	<li>Decantare l'acqua nel piatto della cultura. Eseguire l'ablazione con un ago pulito per siringhe (0,4 mm x 20 mm).<ol>
<li>Utilizzando un microscopio sezionato, tenere attentamente l'ago e avvicinarsi lentamente al MAS. NOTA: Trattenere il respiro e maneggiare l'ago con una presa rilassata aiuta a evitare di tremare.</li>
		<li>Contattare brevemente la cupola sam con la punta dell'ago per confermare che l'ablazione è fatta. Preferibilmente eseguire l'ablazione alla periferia del MAS, che consente la visualizzazione del comportamento e la transizione di microtubuli corticali non organizzati nella regione centrale della cupola.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Riempire il piatto di coltura con acqua deionizzata sterile e aggiungere propidio idoduro (10 μg/ mL). Oltre a monitorare il segnale microtubulo corticale GFP, visualizzare lo ioduro di propidio usando un canale separato può segnare chiaramente le regioni di cellule ablate. Lo ioduro di propidio viene illuminato utilizzando il 561 nm o qualsiasi altro laser adatto con emissione registrata tra 600-650 nm.</li>
	<li>Acquisire pile di immagini subito dopo l'ablazione (vedere la sezione 6) e ripetere il processo di acquisizione ogni 2 ore per un periodo di 6 ore. Riportare il piatto di coltura insieme al campione nella camera di incubazione dopo ogni punto di tempo. Assicurarsi che sul supporto di coltura sia rimasta dell'acqua e avvolgere il piatto di coltura con nastro micropore per evitare l'essiccazione.</li>
</ol>7. Visualizzazione e quantificazione dei dati
<ol><li>Generare proiezioni di superficie utilizzando software liberamente disponibile come MORPHOGRAPHX11, FIJI12o macro SurfCut13.</li>
	<li>Eseguire l'estrazione di anisotropia microtubuli corticale utilizzando FibrilTool14 macro in FIJI. NOTA: I protocolli dettagliati per l'uso del software possono essere ottenuti dalle rispettive citazioni.</li>
</ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li>
<li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+cellulose+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li>
<li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li>
<li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li>
<li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoGraphX%3A+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864(2015).</li>
<li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li>
<li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516(2010).</li>
<li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis%3A+a+quantitative+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li>
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<li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li>
<li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+SurfCut%3A+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38(2019).</li>
<li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FibrilTool%2C+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li>
<li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967(2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036(2019).</li>
<li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li>
<li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La valutazione degli eventi di trasduzione meccanica del segnale è fondamentale per identificare i regolatori molecolari coinvolti nelle vie meccano-percezione e trasduzione. Il protocollo qui descritto fornisce una visione quantitativa di tali eventi utilizzando la risposta corticale dei microtubuli come lettura per tale processo nei MAS Arabidopsis. La procedura qui descritta viene regolarmente utilizzata in diversi studi in vari tipi ditessuti 16,17,<...

Le cellule vegetali sono circondate da una matrice extracellulare di polisaccaridi e glicoproteine che assomiglia meccanicamente a un materiale composito rinforzato con fibre in grado di cambiare dinamicamente le sue proprietàmeccaniche 1. La crescita delle cellule vegetali è guidata dall'assorbimento di acqua nella cellula, che si traduce in un accumulo concomitante di forze di trazione sulla parete cellulare. In risposta a tali forze, le modifiche allo stato fisico della parete cellulare consentono l'espansione cellulare. Le cellule con pareti primarie sono in grado di subire una rapida crescita rispetto alla parete cellulare secondaria contenente cellule principalmente a causa delle differenze nella composizione chimica dei polisaccaridi all'interno. Le cellule primarie della parete sono composte da cellulosa, emicellulosa e pectina oltre alle glicoproteine e mancano di lignina, un componente presente nella parete cellulare secondaria2. La cellulosa, un polimero del glucosio collegato tramite β-1,4 legami, è il componente principale delle pareti cellulari. È organizzato in strutture fibrillari in grado di resistere ad alte forze di trazione sperimentate durante la crescita cellulare3. Oltre a resistere alle forze di trazione, il rinforzo meccanico lungo una direzione preferenziale si traduce in un'espansione guidata dal turgore lungo un asse perpendicolare all'orientamento netto della microfibrillazione di cellulosa. L'organizzazione delle microfibriche di cellulosa è influenzata dal citoscheletro microtubulo corticale, in quanto guidano il movimento direzionale dei complessi sintetizzati alla cellulosa situati nella membranaplasmatica 4. Pertanto, il monitoraggio dell'organizzazione dei microtubuli corticali utilizzando una proteina associata a microtubuli o una tubulina fusa con una molecola fluorescente serve come proxy per l'osservazione di modelli sovrascritti di cellulosa nelle cellule vegetali.
La modelliatura del citoscheletro microtubulo corticale è sotto il controllo delle forze meccaniche derivate dalla morfologia cellulare e tissutale. L'organizzazione corticale dei microtubuli non ha alcuna organizzazione preferenziale nel tempo nelle cellule situate all'apice del MAS, mentre le cellule della periferia e il confine tra il SAM e l'organo emergente hanno una gamma supracellulare stabile e altamente organizzata di microtubuli corticali5. Sono stati sviluppati diversi approcci per perturbo fisicamente lo stato meccanico delle cellule. Modifiche allo stato osmotico, così come il trattamento con composti farmacologici ed enzimatici che influenzano la rigidità della parete cellulare possono comportare successivi cambiamenti nelle forze di trazione sperimentate dalla cellula6,7. L'uso di aggeggi che consentono il graduale aumento delle forze di compressione sperimentate dai tessuti è un'altraalternativa 8. L'applicazione di forze centrifughe ha anche dimostrato di influenzare le forze meccaniche senza alcun contatto fisico con le cellule9. Tuttavia, i mezzi più utilizzati per cambiare le forze direzionali in un gruppo di cellule sfruttano il fatto che tutte le cellule epidermiche sono sotto tensione e l'ablazione fisica delle cellule eliminerà la pressione del turgore localmente e interromperà l'adesione da cellula a cellula, modificando così le forze di trazione sperimentate dalle cellule vicine. Questo viene eseguito prendendo di mira un laser ultravioletto pulsato ad alta potenza o per mezzo di un ago fine.
Qui elaboriamo il processo di imaging e valutazione del comportamento corticale dei microtubuli per la perturbazione meccanica al SAM.

<table><tbody><tr><td>FibrilTool</td><td></td><td></td><td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td></tr><tr><td>glicina</td><td>Merck</td><td>1.04201.1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>DM6000 CS</td><td></td></tr><tr><td>MAP4-GFP</td><td></td><td></td><td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td></tr><tr><td>nastro microporoso</td><td>Leukopor</td><td>02482-00</td><td></td></tr><tr><td>MorphographX</td><td></td><td></td><td>Strauss, S. et al., Metodi Mol Biol. 2019</td></tr><tr><td>mio-inositolo</td><td>Sigma</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>N6-benziladenina</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>acido nicotinico</td><td>Sigma</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>scatola incernierata in plastica</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>64312</td><td></td></tr><tr><td>PPM (Miscela di conservanti vegetali)</td><td>Tecnologia delle cellule vegetali</td><td>PPM</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>piridossina cloridrato</td><td>Sigma</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>SURFCUT</td><td></td><td></td><td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td></tr><tr><td>cloridrato di tiamina</td><td>Sigma</td><td>T4625</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging a cellule vive di microtubulo citoscheletro e manipolazione micromeccanica del meristem apicale del germoglio di arabidopsis

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Comprendere la regolazione a livello cellulare e tissutale della crescita e della morfogenesi è stato in prima linea nella ricerca biologica per molti decenni. I progressi nelle tecnologie molecolari e di imaging ci hanno permesso di ottenere informazioni su come i segnali biochimici influenzano gli eventi morfogenetici. Tuttavia, è sempre più evidente che oltre ai segnali biochimici, gli spunti meccanici hanno anche un impatto su diversi aspetti della crescita cellulare e tissutale. Il meristem apicale a scatto arabidopsis (SAM) è una struttura a forma di cupola responsabile della generazione di tutti gli organi fuori terra. L'organizzazione del citoscheletro microtubulo corticale che media la deposizione di cellulosa apoplastica nelle cellule vegetali è spazialmente distinta. La visualizzazione e la valutazione quantitativa dei modelli di microtubuli corticali sono necessarie per comprendere la natura biofisica delle cellule nel MAS, poiché la cellulosa è il componente più rigido della parete cellulare della pianta. La forma stereotipata dell'organizzazione dei microtubuli corticali è anche una conseguenza delle forze fisiche a livello tissutale esistenti al SAM. La perturbazione di queste forze fisiche e il successivo monitoraggio dell'organizzazione dei microtubuli corticali consentono l'identificazione delle proteine candidate coinvolte nella mediazione della meccano-percezione e della trasduzione. Qui descriviamo un protocollo che aiuta a indagare tali processi.

La figura 1 mostra le immagini di proiezione tipiche ottenute dalle linee MBD-GFP con celle al centro della cupola contenenti microtubuli corticali disorganizzati e celle alla periferia con distribuzione circonferenziale (Figura 1A,B), mentre le celle del dominio limite contengono microtubuli corticali allineati parallelamente all'asse lungo della cellula. Queste osservazioni mostrano differenze nella distribuzio...

Qui descriviamo un protocollo per l'imaging a cellule vive del citoscheletro microtubulo corticale al meristem apicale shoot e monitoriamo la sua risposta ai cambiamenti nelle forze fisiche.

Imaging a cellule vive di microtubulo citoscheletro e manipolazione micromeccanica del meristem apicale del germoglio di arabidopsis

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Questo protocollo ci aiuta a capire come il comportamento del citoscheletro microtubulo si verifica nelle piante. Allo stesso tempo, ci aiuta anche a capire come questi componenti strutturali che influenzano la forma cellulare e dell'organo, rispondono ai cambiamenti nelle forze meccaniche. Sebbene questo metodo richieda poca raffinatezza, fornisce un read-after robusto e quantitativo, le differenze di risposta meccanica tra diversi genotipi e condizioni.Inizia coltivando semi di arabidopsis che esprimono domini di legame di microtubuli fusi con proteine fluorescenti verdi nel terreno, a 20 e 6 gradi Celsius in condizioni di lunga giornata per una settimana. Dopo la germinazione, trasferire le piantine in nuovi vasi con spazio di crescita sufficiente per consentire una robusta crescita vegetativa e posizionare le piante a 20 e 16 gradi Celsius in condizioni di breve giorno. Dopo tre o cinque settimane, trasferire le piante alle condizioni di lunga giornata alla stessa temperatura fino a quando le piante non si imbullonano, consentendo all'infiorescenza di crescere fino a due o cinque centimetri di lunghezza.Per la dissezione meristem apicale shoot, mettere l'infiorescenza e usare pinze affilate per sbucciare i fiori alla base dei peduncoli, fino a quando non è difficile vedere i peduncoli ad occhio nudo per rimuovere i boccioli di fiori più vecchi. Utilizzare le forcep per creare una fessura negli agro in un piatto di sezionazione e piantare la base di infiorescenza nello spesso Augur. Posizionare il piatto al microscopio di sezionamento.A partire dal bocciolo di fiori più antico, spingere con le flessce per rimuovere il bocciolo di fiori dalla pianta. Il meristem apicico del germoglio è solitamente esposto quando i fiori più vecchi fino allo stadio da sei a sette vengono rimossi. E usa le forcep per spingere ogni bocciolo di fiori verso il basso fino a quando il meristem apicali del germoglio è visibile.Non appena viene esposto il meristem apicico shoot, lasciare che il campione appena sezionato in mezzo di crescita in una scatola di coltura rettangolare incernierata in plastica sterilizzata con etanolo con il meristem apicico di germogli appena esposto sopra la superficie media. Aggiungere alcune gocce di acqua deionizzata sterile ai bordi della scatola di coltura e chiudere il coperchio per mantenere l'umidità all'interno della scatola. Avvolgere la scatola con nastro micropore e posizionare la scatola di crescita in condizioni di giorno lunghe o continue a 22 gradi Celsius per 12-24 ore.Quando l'impianto si è ripreso dalla procedura di dissezione, coprire il campione con acqua deionizzata sterile e verificare la presenza di bolle d'aria al microscopio di sezionamento. Trasferire la scatola delle impostazioni cultura su uno stadio di microscopio confocale verticale e selezionare l'obiettivo di immersione in acqua 40 o 60X. Abbassare l'obiettivo nell'acqua e verificare la presenza di bolle d'aria sull'obiettivo anteriore dell'oggetto.Per rimuovere le bolle, abbassare lo stadio e pulire delicatamente l'obiettivo con un tessuto ottico. Quindi utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere un piccolo volume d'acqua alla lente anteriore dell'obiettivo prima di immergere di nuovo l'obiettivo nell'acqua. Successivamente, utilizzare il filtro GFP e il modulo di epi-illuminazione del microscopio confocale per regolare il controller XY per localizzare il campione.Regolando la posizione dell'oculare, posizionare il meristem apicale di ripresa direttamente sotto la sorgente luminosa e mettere a fuoco lungo l'asse Z fino a quando l'apice non si trova. Utilizzare un laser in grado di eccitanti GFP per illuminare il campione e regolare lo zoom ottico del microscopio, in modo che l'intero meristem apicali di ripresa e il primordia floreale di fase uno siano nel campo visivo. Quindi, regolare la potenza dell'uscita laser e le impostazioni di guadagno per ottenere un rapporto segnale/rumore ottimale.Dopo aver permesso al campione di depositarsi per due o cinque minuti, acquisire pile Z confocali del campione a intervalli di fette Z da 0,25 a 0,5 micrometri, aggiungendo una risoluzione delle dimensioni dei pixel di circa 0,3 micrometri. Al termine dell'acquisizione, rimuovere immediatamente l'acqua e trasferire la scatola di coltura nella camera di crescita. Per micromeccanica Shoot Apical Meristem Perturbation, acquisire pile di immagini di pre-ablazione dell'organizzazione dei microtubuli corticali come appena dimostrato e decompilare l'acqua dalla scatola della coltura in un piatto di coltura.Trasferire il meristem apicico di ripresa al microscopio sezionato e avvicinarsi lentamente al meristem apicico del germoglio con un ago pulito da 0,4 a 20 millimetri. Contattare brevemente la periferia della cupola del meristem apicali del germoglio con la punta dell'ago per confermare che l'ablazione è stata completata. E riempire il piatto di coltura con acqua deionizzata sterile.Quindi aggiungere 10 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio al piatto e acquisire immediatamente pile di immagini come dimostrato ogni due ore per sei ore, restituendo il piatto di coltura all'incubazione tra ogni punto di tempo. Per l'analisi dei dati, generare proiezioni superficiali degli stack di immagini utilizzando un programma software di analisi delle immagini appropriato ed eseguire l'estrazione dell'anisotropia del microtubulo corticale utilizzando fibril tool macro nelle Fiji. Qui, si possono osservare immagini di proiezione tipiche ottenute da linee GFP di dominio di legame microtubulo con cellule al centro della cupola contenenti microtubuli corticali disorganizzati, cellule alla periferia, con distribuzione circonferenziale e cellule di dominio limite contenenti microtubuli corticali allineati parallelamente al lungo asse della cellula.L'imaging time-lapse, mostra l'allineamento corticale dei microtubuli che cambia da un array altamente disordinato a un array più organizzato entro sei ore dall'ablazione. I tensori potrebbero essere sovrapposti alle immagini dei microtubuli corticali, e le informazioni estratte potrebbero essere rappresentate tracciando l'anisotropia media nel tempo. Quando si regolano le impostazioni di potenza e guadagno dell'uscita laser, dovremmo garantire un'osservazione chiara dei filamenti e cercare di evitare la sovraesposizione, poiché segnali saturi potrebbero polarizzarsi la direzione della trazione in analisi successive.La microscopia a forza atomica può anche essere eseguita per valutare come i cambiamenti nelle forze meccaniche influenzino effettivamente lo stato fisico della parete cellulare.

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