Identificazione sul campo della camomillia Matricaria utilizzando un sistema qPCR portatile

La pratica di utilizzare le botaniche per migliorare la salute risale a migliaia di anni fa. Recentemente, l'aumento della domanda, unito a pratiche di raccolta insostenibili e ai cambiamenti climatici, ha posto l'accento sulla catena di approvvigionamento. Per questo motivo, l'adulterazione botanica sta diventando una preoccupazione crescente, rendendo l'identificazione botanica una parte sempre più essenziale del controllo di qualità.

Idealmente, l'identificazione viene eseguita il più vicino possibile alla fonte, in modo che le risorse possano essere allocate in modo efficiente al materiale di corretta identità. Ci sono una serie di approcci per l'identificazione botanica. Tradizionalmente, l'identificazione botanica viene eseguita attraverso la valutazione morfologica e metodi analitici chimici.

L'identificazione morfologica si basa sulle differenze nelle caratteristiche macroscopiche e microscopiche dei materiali vegetali. Tuttavia, richiede un botanico ben addestrato e la sua applicazione ai materiali botanici in polvere è limitata. I metodi di analisi chimica sono ampiamente utilizzati nelle farmacopee e nei laboratori, ma non sono ideali per i test sul campo a causa delle dimensioni degli strumenti e dei requisiti ambientali.

Recentemente, i metodi genomici sono emersi come tecnica alternativa per l'identificazione delle specie botaniche a causa dell'alta fedeltà e specificità delle informazioni genomiche nei materiali vegetali. Con strumenti diagnostici molecolari ora disponibili sotto forma di dispositivi portatili, questo approccio diventa possibile per l'applicazione sul campo. L'obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre un metodo per l'identificazione botanica in situazioni in cui l'accesso alle attrezzature e alle competenze di laboratorio è limitato, come l'azienda agricola che fornisce il materiale botanico, utilizzando un sistema qPCR portatile.

La camomilla matricaria, comunemente nota come camomilla tedesca, è stata utilizzata come farmaco a base di erbe per promuovere la salute per secoli. Per dimostrare la specificità del metodo attuale, la differenziazione della camomilla tedesca da un altro fiore di camomilla comunemente usato, noto come camomilla romana, è inclusa per il confronto. La procedura di identificazione sul campo è dimostrata nel mezzo di una fattoria di camomilla tedesca.

Impostare un'area di test sul campo con una superficie piana e orizzontale. Identificare una pianta rappresentativa che rifletta le caratteristiche della maggior parte delle piante nel campo dei fiori di camomilla. Scegli una testa di fiore dalla pianta rappresentativa usando guanti sterili.

Posizionare il campione in un tubo di raccolta da 2,0 millilitri. Ripetere e raccogliere un foglio illustrativo lungo circa 0,5-0,7 centimetri dalla stessa pianta. Preriscaldare l'incubatore di bagni secchi a 95 gradi Celsius.

Ad ogni tubo di raccolta aggiungere 100 microlitri della soluzione di estrazione dal kit di estrazione del DNA vegetale. Per una migliore efficienza di estrazione del DNA, macinare il campione utilizzando un pestello tissutale. Chiudi il tubo.

Assicurarsi che il tessuto botanico sia coperto dalla soluzione di estrazione durante tutto il processo di estrazione. Posizionare i tubi di raccolta in un incubatore di bagno secco preriscaldato e incubare i tubi di raccolta a 95 gradi Celsius per 10 minuti Dopo 10 minuti, eserti i tubi dall'incubatrice del bagno asciutto. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di diluizione dal kit di estrazione del DNA e mescolare la soluzione tubazione su e giù più volte.

Ripetere lo stesso passaggio per l'estrazione del foglio illustrativo. Agitare per mescolare ulteriormente la soluzione. Il problema della pianta di solito non sembra essere degradato dopo questo trattamento.

Il colore liquido può cambiare e diventare torbido. Configurare le condizioni di termociclismo dello strumento qPCR in base alla tabella uno, che inizia con un passo di temperatura costante per la denaturazione iniziale, seguito da 25 cicli di amplificazione e termina con la rampa di temperatura per ottenere una curva di fusione ad alta risoluzione. Scongelare il mix principale qPCR e i primer elencati nella tabella due a temperatura ambiente prima dell'uso.

Pianificare la reazione che verrà caricata in ogni pozzo. Pozzi contenenti controlli positivi con le specie bersaglio, controlli positivi con specie non bersaglio, campioni e controlli negativi. In questo esempio vengono utilizzati 10 pozzi, cinque per il test di identificazione della camomilla tedesca e altri cinque per il test di identificazione della camomilla romana.

Per ogni tipo di test di identificazione delle specie, un pozzo contiene un controllo positivo con DNA estratto dal materiale di riferimento della specie bersaglio, un pozzo contiene un controllo positivo con DNA estratto da materiale di riferimento di specie non bersaglio, due pozzi sono riempiti con campioni di DNA di fiori e foglie estratti dal campo e un pozzo è assegnato per un controllo negativo. La tabella tre descrive ogni tipo di pozzo. Preparare un mix di maestri di reazione secondo la tabella quattro per ogni test di identificazione delle specie botaniche.

Un tipico mix di master di reazione contiene un mix di master qPCR universale, due volte, primer specifici per specie in avanti e in retromarcia e acqua priva di nucleasi. Mescolare accuratamente la miscela del master di reazione pipettando prima dell'uso. Posizionare la cartuccia di reazione PCR a faccia in su su una superficie piatta e stabile.

Caricare 18 microlitri del mix di master di reazione configurato nel passaggio precedente nei pozzi della cartuccia in base ai pozzi qui definiti. Per questa dimostrazione, aggiungere il mix di master di reazione del test di identificazione della camomilla tedesca in pozzi etichettati per il test GC, GCT nei pozzi uno, tre, cinque, sette, nove e il mix di master di reazione del test di identificazione della camomilla romana in pozzi etichettati per il test RC, RCT nei pozzi due, quattro, sei, otto, 10. Trasferire due microlitri di DNA campione dal supernatante dei tubi di estrazione del DNA e controlli positivi del DNA pre-estratti in pozzi di cartuccia precaricati con mix master qPCR.

Dopo aver aggiunto ogni modello di DNA al mix master qPCR, mescolare delicatamente la soluzione pipettando. Sigillare con cura la cartuccia con pellicola adesiva. Caricare la cartuccia sulla camera di termociclismo e chiuderla.

Impostare lo strumento qPCR per l'esecuzione. Nel protocollo attuale, il colorante intercalante viene utilizzato per misurare l'amplificazione dei frammenti bersaglio in tempo reale. Il valore Ct è definito come il numero di cicli necessari affinché il segnale fluorescente attraversi la soglia predefinita.

Un valore Ct inferiore a 25 cicli è stato considerato come amplificazione positiva. In questa figura, il controllo positivo romano è stato amplificato solo nel test di identificazione della camomilla romana, ma non nel test di identificazione della camomilla tedesca. Il controllo positivo della camomilla tedesca e i campioni di campo sono stati amplificati solo nel test di identificazione della camomilla tedesca, ma non nel test di identificazione della camomilla romana.

Il controllo negativo non è stato amplificato in nessuno dei due test. Per confermare ulteriormente l'amplificazione specifica nei controlli positivi e nei campioni, le frazioni di PCR e i prodotti di ciascun pozzo sono stati eseguiti su gel di agarosio al 2% in laboratorio. Tutti i pozzi con un valore Ct inferiore a 25 producono ampliconi alle loro dimensioni previste, che differiscono tra camomilla tedesca e camomilla romana.

Il resto delle corsie non ha mostrato alcun prodotto di amplificazione specifico, in accordo con l'assenza di segnale fluorescente per questi pozzi osservata nelle prove sul campo. A seguito dell'amplificazione PCR, è stata eseguita un'analisi della curva di fusione utilizzando lo stesso software utilizzato per monitorare il segnale fluorescente. Con l'aumento della temperatura, gli ampliconi a doppio filamento iniziano a dissociarsi, con conseguente diminuzione dell'intensità della fluorescenza.

I cambiamenti di intensità della fluorescenza furono ulteriormente convertiti in curve di picco di fusione per un'ulteriore differenziazione della camomilla tedesca dalla camomilla romana per i loro caratteristici picchi di fusione. In questa figura, il picco di fusione del controllo positivo della camomilla tedesca è di 85,6 gradi Celsius ed è distinto dal picco di fusione del controllo positivo della camomilla romana. Gli ampli PCR provenienti da campioni di campo producono picchi di fusione vicini al controllo positivo della camomilla tedesca.

L'identità del campione di campo è determinata in base all'amplificazione specifica e alla temperatura di fusione caratteristica che corrisponde ai controlli. In questo esempio, sia il fiore che la foglia raccolti nel campo sono identificati come Matricaria chamomilla, camomilla tedesca. I risultati dei test di camomilla romana per questi due campioni sono negativi.

Il protocollo dimostra l'identificazione della camomilla tedesca sul campo utilizzando un sistema qPCR portatile. Metodi simili possiamo sviluppare per espandere il portafoglio di botaniche che possono essere testate. Speriamo che questo video fornisca preziosi materiali di formazione per scienziati, anche non esperti per eseguire l'identificazione botanica sul campo o in un ambiente con attrezzature di laboratorio limitate.

I test di identificazione sul campo basati sul DNA non solo producono risultati altamente accurati che corrispondono all'analisi di laboratorio, ma riducono anche i tempi e i costi associati ai metodi tradizionali eseguiti in laboratorio.