Name: Utilizzo di una biopsia chimica per la valutazione della qualità dellinnesto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: Scopri la biopsia chimica per valutare la qualità degli innesti renali prima del trapianto. Questo metodo a bassa invasività utilizza sonde SPME e analisi metabolomiche e lipidomiche per monitorare le modificazioni del tessuto nel tempo.

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Lo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione Opus UMO-2017/27/B/N'5/01013 del National Science Centre. Gli autori vorrebbero riconoscere MilliporeSigma, un'azienda di Merck KGaA, Darmstadt, Germania per la fornitura di dispositivi SPME. Il business delle scienze della vita di Merck opera come MilliporeSigma negli Stati Uniti e in Canada. Inoltre, gli autori vogliono ringraziare Thermo Fisher Scientific per l'accesso allo spettrometro di massa orbitarap Q-Exactive Focus. Gli autori ringraziano la Dott.ssa Aleksandra Woderska-Jasi'ska e il personale del Dipartimento di Trapiantologia e Chirurgia Generale di Bydgoszcz per la loro gentile assistenza nel progetto. BB vuole ringraziare la prof.ssa Janusz Pawliszyn per l'opportunità di raccolta dei campioni al Toronto General Hospital durante il suo soggiorno all'Università di Waterloo.

Tutti gli animali hanno ricevuto cure umane in conformità con i "Principi di cura animale di laboratorio" formulati dalla National Society for Medical Research e dalla "Guida per la cura degli animali da laboratorio" pubblicata dal National Institute of Health, Ontario, Canada. L'Animal Care Committee del Toronto General Research Institute ha approvato tutti gli studi. La ricerca ha coinvolto soggetti umani è stata approvata dal Comitato Bioetico presso Collegium Medicum in Bydgoszcz Nicolaus Copernicus University a Torun.
NOTA: ottenere l'approvazione da comitati etici appropriati. Ricordati di indossare sempre guanti di sicurezza. Non toccare la fase di estrazione delle sonde SPME. L'uso di fiale di vetro disattivate è raccomandato per le analisi lipidomiche.
1. Preparazione delle sonde
<ol><li>Preparare sonde in lega titanio-nickel (lunghezza 40 mm; diametro 0,2 mm) rivestite con sorbente mix-mode da 7 mm. Il numero di probe dipende dai punti di tempo mirati durante l'intera procedura e dal numero di repliche (3 è consigliato per punto di tempo). NOTA: La lunghezza e il tipo di fase di estrazione possono essere regolati in base alla modalità di studio, alla polarità dei metaboliti e alla matrice del campione.</li>
	<li>Preparare una miscela di pulizia composta da 2:1 cloroformio:metanolo (v/v). Pipetta 1,0 mL della soluzione per ogni fiala di vetro da 2,0 mL e posizionare una sonda, precedentemente trafitta attraverso il tappo, in ogni fiala. NOTA: Prima dell'uso, pulire tutte le sonde per rimuovere le particelle contaminanti.</li>
	<li>Mettere le fiale sull'agitatore e impostare la velocità di agitazione a 1.200 giri/min. Dopo 45 minuti, arrestare il dispositivo e risciacquare i rivestimenti con acqua di qualità LC-MS.</li>
	<li>Poiché i rivestimenti devono essere sottoposti a un passaggio di precondizionamento per attivarli, preparare una miscela di precondizionamento composta da 1:1 metanolo:acqua (v/v). Pipetta 1,0 mL della soluzione per ogni fiala di vetro da 2,0 mL e posizionare una sonda, precedentemente trafitta attraverso il tappo, in ogni fiala.</li>
	<li>Mettere le fiale sull'agitatore del vortice e impostare la velocità di agitazione a 1.200 rpm.</li>
	<li>Dopo 60 min, fermare l'agitatore e risciacquare i rivestimenti con acqua di grado LC-MS.</li>
	<li>Sterilizzare le sonde secondo il protocollo di sterilizzazione delle apparecchiature chirurgiche standard.</li>
</ol>2. Estrazione
<ol><li>Aprire il pacchetto sterile subito prima del campionamento per garantire un ambiente sterile.</li>
	<li>Inserire due sonde direttamente nella corteccia renale per 10 min ad ogni punto di tempo. L'intera lunghezza del rivestimento deve essere coperta dalla matrice tissunte; non è richiesto alcun angolo specifico, ma di solito viene utilizzato 90 gradi. NOTA: L'intera procedura medica segue protocolli standard in una determinata istituzione. Non viene presa in considerazione alcuna modifica relativa al campionamento SPME. La procedura prevede i sei seguenti punti di tempo di campionamento: a) prima della resezione renale, in vivo dal donatore; b)-e) dopo 1 h, 3 h, 5 h, 7 h di perfusione renale, ex vivo in camera d'organo; f) dopo la reperfusione, in vivo dal destinatario.</li>
	<li>Ritirare le sonde tirandolo fuori dal tessuto e quindi risciacquare i rivestimenti con acqua di grado LC-MS per eliminare il sangue rimanente dalla superficie di rivestimento. Risciacquare dal sito chirurgico e subito dopo la rimozione delle sonde.</li>
</ol>3. Trasporto e stoccaggio
<ol><li>Posizionare le sonde in fiale separate e chiuderle.</li>
	<li>Mettere le fiale in una scatola di polistirolo riempita di ghiaccio secco o in azoto liquido per il trasporto.</li>
	<li>Conservare i campioni in un congelatore (-80 gradi centigradi) o iniziare immediatamente la fase di deorption.</li>
</ol>4. Desorption
<ol><li>Preparare soluzioni di deorption composte da 80:20 acetonitrile:acqua (v/v) per l'analisi metabolomica e 1:1 isopropanol:metahanol (v/v) per l'analisi lipidomica.</li>
	<li>Pipetto 100 L della soluzione per inserti collocati in fiale etichettate 2,0 mL e posizionare una sonda, precedentemente forata attraverso il tappo, in ogni fiala.</li>
	<li>Mettere le fiale sull'agitatore vortice e impostare la velocità di agitazione a 1.200 giri/min per 120 min.</li>
	<li>Rimuovere le sonde dalle fiale. Gli estratti ottenuti sono ora pronti per l'analisi strumentale.</li>
</ol>5. Analisi LC-MS
<ol><li>Inserire fiale contenenti estratti nell'autosampler del sistema LC-MS. NOTA: per questo studio sono stati utilizzati la cromatografia liquida (RP, HILIC) accoppiata con spettrometria di massa ad alta risoluzione e un analizzatore di massa orbitrap. Per i parametri di analisi metabolomica, andare al passaggio 5.2. Per i parametri di analisi lipidomica, andare al passaggio 5.6.</li>
	<li>Utilizzare una colonna pentafluorofenile (PFP) (2,1 mm x 100 mm, 3 m) per la separazione di fase invertita.<ol>
<li>Impostare la velocità di flusso su 300 L/min e le temperature dell'autocampione e delle colonne rispettivamente a 4 gradi centigradi e a 25 gradi centigradi.</li>
		<li>Preparare le fasi mobili in base alle seguenti proporzioni: fase mobile A: acqua: acido formice (99.9:0.1, v/v) e fase mobile B: acetonitrile:acido formico (99.9:0.1, v/v). Impostare il flusso di fase mobile in base ai seguenti parametri: avvio del flusso di fase mobile (0-3 min): 100% A seguito da un gradiente lineare al 10% A (3-25 min), terminando con un flusso isocratico del 10% A fino a 34 min, seguito da 6 min di tempo di riaquiliquilibrio della colonna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per la separazione HILIC, utilizzare una colonna HILIC (2,0 mm x 100 mm, 3 m, 200A). Impostare la velocità di flusso su 400 L/min.<ol>
<li>Preparare le fasi mobili in base alle seguenti proporzioni: fase mobile A: acetonitrile:buffer di acetato di ammonio (9:1, v/v, concentrazione effettiva di sale 20 mM), fase mobile B: acetonitrile:buffer di acetato di ammonio (1:1, v/v, concentrazione effettiva del sale 20 mM).</li>
		<li>Impostare il flusso di fase mobile in base ai seguenti parametri: avvio del flusso di fase mobile (0-3 min) al 100% A, tenere premuto per 3,0 min e quindi rampa al 100% B entro 5 min. Tenere con 100% B fino a 12 min, seguita da 8 min di tempo di squilibrio della colonna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare l'intervallo di scansione su 85-1000 m/z. Impostare i parametri della sorgente ioni HESI in modalità ionizzazione positiva su: tensione a spruzzo 1.500 V, temperatura capillare 300 gradi centigradi, gas di sheath 40 a.u., aux gas flow rate 15 a.u., temperatura del riscaldatore a sonda 300 gradi centigradi, livello S-Lens RF 55%.</li>
	<li>Eseguire campioni di QC composti da 10 L di ogni campione analizzato (regolarmente, ogni 10-12 campioni) per monitorare le prestazioni dello strumento.</li>
	<li>Per la separazione di fase invertita, utilizzare una colonna C18 (2,1 mm x 75 mm, 3,5 m).<ol>
<li>Impostare la velocità di flusso su 200 L/min e le temperature dell'autocampione e della colonna rispettivamente a 4 gradi centigradi e a 55 gradi centigradi. Preparare le fasi mobili in base alle seguenti proporzioni: fase mobile A: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM di acetato di ammonio e acido acetico da 1 mM; fase mobile B: IPA:MeOH (90:10, v/v), acetato di ammonio da 10 mM e acido acetico da 1 mM.</li>
		<li>Impostare il flusso di fase mobile in base ai seguenti parametri: 0-1 min (20% B), 1-1,5 min (20-50% B), 1,5-7,5 min (50-70% B), 7,5 5-13 min (70-95% B), 13-17 min (95% B), 17-17.1 min (95-20% B), 17.1-23 min (20%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per la separazione HILIC, utilizzare una colonna HILIC (100 x 2,1 mm, 3 m).<ol>
<li>Impostare la velocità di flusso su 400 L/min e le temperature dell'autocampione e delle colonne rispettivamente a 4 gradi centigradi e 40 gradi centigradi.</li>
		<li>Preparare le fasi mobili in base alle seguenti proporzioni: fase mobile A: ACN; fase mobile B: acetato di ammonio da 5 mM in acqua. Impostare il flusso di fase mobile in base ai seguenti parametri: 0-2 min (96% B), 2-15 min (96-80% B), 15-15,1 min (80-96% B), 15,1-21 min (96% B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impostare i parametri della sorgente di ioni HESI in modalità di ionizzazione positiva per spruzzare tensione 3.500 V, temperatura capillare 275 gradi centigradi, gas di sheath 20 a.u., aux gas flow rate 10 a.u., temperatura del riscaldatore sonda 300 gradi centigradi, livello S-Lens RF 55%.</li>
	<li>Eseguire campioni di QC composti da 10 L di ogni campione analizzato (ogni 10-12 campioni) per monitorare le prestazioni dello strumento.</li>
	<li>Eseguire l'acquisizione di dati in software compatibile con lo strumento.</li>
</ol>6. Analisi dei dati
<ol><li>Eseguire l'elaborazione dei dati, l'identificazione putativa e l'analisi statistica con l'uso di software dedicato alla metabolomica non mirata e all'analisi della lippidomica. NOTA: è possibile ottenere grafici di componenti principali (PCA) e box-whisker per visualizzare la struttura dei dati.</li>
</ol>

<ol><li>U.S. Department of Health & Human Services. Organ Procurement and Transplantation Network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://optn.transplant.hrsa.gov">https://optn.transplant.hrsa.gov</a> (2019).</li>
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<li>Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preoperative+assessment+of+the+deceased-donor+kidney%3A+From+macroscopic+appearance+to+molecular+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers.</a> Transplantation. 97, 797-807 (2014).</li>
<li>Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+kidney+organ+quality+and+prediction+of+outcome+at+time+of+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation.</a> Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).</li>
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<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics%3A+The+principles+and+potential+applications+to+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).</li>
<li>Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+metabolomics+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Understanding metabolomics in biomedical research.</a> Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).</li>
<li>Bojko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+microextraction+fills+the+gap+in+tissue+sampling+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols.</a> Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).</li>
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<li>Kaminski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+Consumption+by+Warm+Ischemia-Injured+Porcine+Kidneys+in+Hypothermic+Static+and+Machine+Preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation.</a> Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).</li>
<li>Wijermars, L. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+postreperfusion+metabolic+recovery+directly+associates+with+incident+delayed+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function.</a> Kidney International. 90, 181-191 (2016).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteo-metabolomics+reveals+compensation+between+ischemic+and+non-injured+contralateral+kidneys+after+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion.</a> Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).</li>
<li>Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+phosphatidylcholines+are+produced+in+renal+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury.</a> PLoS One. 13, 1-24 (2018).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+monitoring+kidney+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in monitoring kidney transplants.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).</li>
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<li>Zhang, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+insights+into+chronic+kidney+disease+and+modulatory+effect+of+rhubarb+against+tubulointerstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis.</a> Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).</li>
<li>Looby, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+microextraction+coupled+to+mass+spectrometry%3A+Via+a+microfluidic+open+interface+for+rapid+therapeutic+drug+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring.</a> Analyst. 144, 3721-3728 (2019).</li>
<li>Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated+blade+spray%3A+Shifting+the+paradigm+of+direct+sample+introduction+to+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS.</a> Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).</li>
</ol>

Gli autori vorrebbero riconoscere MilliporeSigma (Merck KGaA, Darmstadt, Germania) per la fornitura di dispositivi SPME e Thermo Fisher Scientific per l'accesso allo spettrometro di massa Q-Exactive Focus Orbitrap.

La valutazione della qualità degli organi rimane una grande sfida per i medici, che devono prendere decisioni rapide e informate in merito alla possibilità di un determinato organo per il trapianto o se debba essere scartato. Fattori multipli, come l'età del donatore, la durata dell'ischemia e le infezioni e i processi infiammatori, possono influenzare l'esito dell'innesto a lungo termine. Mentre sono stati sviluppati metodi diversi fino ad oggi per diagnosticare la funzione dell'allotrapianto renale, l'ispezione istopatologica rimane lo standard d'oro in quellamateria 3,4,12. Anche se la procedura di biopsia può produrre informazioni significative per quanto riguarda la malattia del donatore preesistente e i cambiamenti vascolari, non è esigante di difetti. Gli errori di campionamento associati alla variabilità del server interob e al campionamento di glomeruli insufficienti per informazioni complete sulla funzione degli organi rimangono preoccupazioni tipiche a questo proposito. Inoltre, la preparazione del campione comporta alcune questioni come una valutazione incompleta dell'innesto in caso di sezioni congelate e l'estensione del tempo di procedura per il sezionamento della paraffina. Tuttavia, l'aumento del rischio di emorragia, che può apparire acutamente come ematuria microscopica o grossolana, è la principale complicazione pericolosa per la vita associata alla procedura di biopsia. Per questo motivo, il numero di biopsie abili è strettamente limitato nelle procedure di trapianto, un fattore che ostacola la cattura dei cambiamenti dinamici e delle analisi delle serie a tempo attraverso questometodo 12,13,14. I benefici di un'analisi irologica devono essere confrontati con i rischi associati alla metodologia. Il valore delle scoperte istologiche è indiscutibile, ma non spiegano i meccanismi molecolari delle aberrazioni.
La metabolomica e la lippidomica sono i domini più giovani della famiglia scientifica "-omica". Il set completo di metaboliti e lipidi umani a bassa capacità molecolare (<1,200 Da) collegati all'interno di una rete metabolica è definito come un metaboloma umano. Il genoma rimane relativamente costante per tutta la sua vita, con lievi modifiche causate da mutazioni che si verificano raramente. Il metaboloma è il prodotto dell'espressione genica, che è altamente sensibile ai cambiamenti in tutti i processi biologici e ai fattori ambientali. La natura dinamica di metaboliti e lipidi li rende indicatori perfettidell'attualecondizione dell'organo 7,8,15,16. Il metodo SPME proposto nel suddo metodo consente di rilevare i cambiamenti che si verificano nell'organo durante la sua conservazione, a partire dalla rimozione degli organi dal corpo del donatore fino alla revascolarizzazione presso il destinatario. Il piccolo diametro della sonda (200 m) fornisce una minima invasività e consente diversi campionamenti dallo stesso organo senza causare alcun danno al tessuto. Condurre studi utilizzando il rene, come organo trapiantato più frequentemente, consente una migliore comprensione e un'ulteriore caratterizzazione delle vie metaboliche responsabili del declino della qualità e della funzione degli innesti. La possibilità di monitorare le modifiche nel tempo è certamente un importante vantaggio della tecnica rispetto ai metodi invasivi convenzionali come la biopsia. L'analisi attualmente presentata ha identificato concentrazioni alterate di vari gruppi di lipidi e metaboliti, in particolare di aminoacidi essenziali, purine, nucleosides purina e glicerophospholipids. Questi risultati sono coerenti con i precedenti rapporti di analisidei tessuti 5,6,17,18,19,20. Ad oggi, la maggior parte delle relazioni scientifiche che utilizzano metabolomica o lippidomica per spiegare i processi che inducono complicazioni dopo il trapianto o i fenomeni di lesione ischemia/reperfusione (IRI) si sono limitati all'analisi dei biofluidi21,22,23.
Ogni applicazione clinica richiede l'ottimizzazione del protocollo di campionamento per garantire che le prestazioni del metodo analitico soddisfino i criteri previsti. A questo proposito, il vantaggio dell'utilizzo di SPME è la possibilità di adeguare le condizioni per vari progetti sperimentali. La varietà delle fasi di estrazione accessibili fornisce un ampio spettro di metaboliti estratti con polarità diversificate. Allo stesso tempo, questo potrebbe essere considerato come una limitazione del metodo a causa del fatto che ogni sorbent fornisce selettività verso caratteristiche specifiche e non estrae tutti i composti presenti nella matrice campione. Va notato che i rivestimenti SPME estraggono solo tramite molecole libere e semplicemente non interagiscono con una frazione legata dell'alyte. La biocompatibilità dei rivestimenti non introduce tossicità nel tessuto, limitando al contempo l'estrazione di molecole di grandi dimensioni come le proteine; di conseguenza, i processi enzimatici sono inibiti già nella fase di raccolta dei campioni e la presenza di manufatti è ridotta al minimo, il che è un grande vantaggio rispetto ai metodi di campionamento alternativi. La lunghezza del rivestimento influenza l'efficienza dell'estrazione (cioè, la lunghezza del rivestimento indica la superficie e il volume della fase di estrazione); così, rivestimenti più lunghi producono recuperi più elevati. D'altra parte, i rivestimenti più corti consentono una risoluzione spaziale più elevata. Per risultati affidabili, è fondamentale immergere la sonda alla stessa profondità della corteccia renale. L'inserimento troppo profondo causa il rischio di entrare nella medulla renale. Il tempo di estrazione è anche proporzionale all'efficienza di estrazione. Pertanto, la selezione del tempo di estrazione ottimale è uno dei passaggi più critici nello sviluppo del metodo SPME. L'accuratezza della misurazione del tempo fornisce la massima ripetibilità. Nelle applicazioni biologiche come quella discussa, c'è sempre un compromesso tra la sensibilità e la ripetibilità del protocollo analitico e le restrizioni della procedura medica. Mentre l'estrazione dell'equilibrio fornisce la massima sensibilità, per motivi di sicurezza, le condizioni di pre-equilibrio sono spesso utilizzate in tali applicazioni, poiché il tempo di estrazione non dovrebbe influenzare la durata totale dell'intervento chirurgico. L'efficienza della desorption è determinata dal momento del processo e dalla composizione del solvente di disorption, che dovrebbe essere compatibile con la fase mobile utilizzata per la separazione cromatografica9,10,11.
Uno dei principali requisiti per la strumentazione diagnostica utilizzata per le valutazioni intra-chirurgiche è il tempo di analisi. Si sta cercando di sviluppare uno strumento rapido per l'estrazione SPME in vivo accoppiato direttamente a uno spettrometro di massa tramite microfluidico open interface (MOI)24 o spray a lama rivestita (CBS)25. Tali approcci consentirebbero la divulgazione di risultati analitici in tempo reale o quasi in tempo reale. L'uso di tali metodi per l'analisi pre-intervento dei profili metabolici e lipidomici potrebbe migliorare il processo decisionale durante le procedure di trapianto, consentendo il miglior approccio personalizzato possibile e una risposta rapida in caso di insufficienza d'organo.
Come sintesi, si ipotizza che il protocollo proposto consentirà il raggiungimento di profili metabolici e lippidomici completi degli innesti renali, che a loro volta fornirebbe una valutazione completa della qualità dell'organo e della caratterizzazione dei processi responsabili della lesione ischemia-reperfusione. La novità del progetto include l'utilizzo della microetrazione in fase solida (SPME), che offre un campionamento invasivo basso dei sistemi viventi, in combinazione con una delle tecnologie più innovative disponibili per l'analisi dei metabolomi e dei lipicomi (ad esempio, lo spettrometro di massa ad alta risoluzione Orbitrap). SPME combina la raccolta dei campioni, l'estrazione e l'appiccamento di metaboliti in un unico passaggio, rendendolo quindi uno strumento perfetto per un'analisi rapida. Si prevede che questo protocollo aiuterà a rispondere alle domande relative a quali condizioni pre-trapianto del rene sono responsabili della funzione dell'organo ritardato o delle sue disfunzioni dopo il trapianto, nonché a come il protocollo di conservazione dell'innesto influenza la biochimica dell'organo. Tali conoscenze non solo avrebbero un impatto significativo sulla prevenzione di possibili complicazioni legate al trapianto, ma potrebbero contribuire a migliorare gli attuali protocolli di conservazione dell'innesto, riducendo al minimo la perdita di tessuto da trapianto vitale e la perdita di vite umane. La soluzione proposta aprirà la porta a ulteriori indagini in questo campo, tra cui la convalida di specifici potenziali biomarcatori e il miglioramento degli esiti terapeutici nella trapiantologia.

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The third affiliation was&#160;updated from:
Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun&#34;
to:
Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

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Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Secondo la rete statunitense per l'approvvigionamento e i trapianti di organi, nel 2019 erano 94.756 i pazienti in attesa di trapianto di rene negli Stati Uniti; mentre in Europa nel 2018, tale numero era 10.791. Ogni dieci minuti, qualcuno viene aggiunto alla lista d'attesa nazionale per i trapianti negli Stati Uniti, e si stima che ogni giorno 20 persone muoia in attesa di untrapianto 1,2. Il trapianto di rene è un trattamento salvavita per un gran numero di persone che soffrono di disfunzione renale in fase finale in tutto il mondo. La procedura è associata ad un aumento del tasso di sopravvivenza e a una maggiore qualità della vita rispetto alla dialisi convenzionale.
Tuttavia, il trapianto deve affrontare molti problemi seri, come la carenza di organi o la mancanza di strumenti efficaci per la valutazione della qualità degli organi. I protocolli standard sono limitati all'ispezione macroscopica dell'aspetto o alla biopsia invasiva dei tessuti, che non forniscono informazioni complete sulla qualità dell'innesto. Mentre una valutazione visiva consente l'identificazione dei tumori visibili all'occhio, anomalie anatomiche o danni estesi agli innesti, questo approccio è molto soggettivo, varia nella sua efficacia a seconda dell'esperienza degli osservatori. La biopsia, d'altra parte, può fornire informazioni preziose sui disturbi renali preesistenti, ed è quindi considerata un metodo di valore oggettivo e evidenziato nel determinare i risultati dell'innesto. Tuttavia, la procedura di biopsia non è es free di difetti; c'è il rischio di potenziali complicazioni come sanguinamento ed è necessaria un ulteriore 4-5 ore di preparazione del campione, che prolunga significativamente il tempo ischemico freddo. Pertanto, soprattutto in Europa, l'uso dell'analisi diretta dei tessuti è limitato ai donatori di criteri espansi (ECD) e ai donatori dopo la morte circolatoria (DCD)3,4.
La metabolomica e la lippidomica sono state recentemente riconosciute come approcci promettenti per raggiungere una migliore comprensione dei cambiamenti nei percorsi biochimici che si verificano durante la conservazione degli organi. La profilazione metabolomica e lipidomica consente di monitorare le risposte immediate del sistema a improvvisi cambiamenti ambientali legati alla rimozione degli organi con conseguenze successive: ischemia, stress ossidativo o risposte infiammatorie5,6,7,8. Il rene è un organo che è in gran parte associato con i processi metabolici, quindi le misurazioni delle concentrazioni di metaboliti e lipidi possono consentire l'identificazione di potenziali biomarcatori di qualità dell'organo e consentire migliori previsioni dell'esito dell'innesto.
Date le complicazioni e le limitazioni di cui sopra associate agli attuali metodi di valutazione della qualità degli organi, è necessaria una soluzione diagnostica meno invasiva per una valutazione rapida e complessa della qualità degli organi. La microetrazione di fase solida (SPME) è conforme a questi requisiti come metodo analitico minimamente invasivo che consente la copertura di un ampio spettro di metaboliti e lipidi. La tecnica si basa sull'inserimento di una sonda in lega in titanio-nickel sottile e sottile ricoperta per un breve periodo di tempo con una fase di estrazione selettiva nell'organo esaminato. Va sottolineato che SPME impedisce l'estrazione di proteine, e quindi consente l'inibizione del metabolismo già nella fase di raccolta del campione, che è un vantaggio significativo rispetto ai metodi alternativi. Inoltre, la miniaturizzazione del dispositivo consente l'esecuzione di analisi ripetitive e simultanee di poche strutture dell'organo9,10,11.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico</td><td>Merck</td><td>5330010050</td><td>Additivo in fase mobile</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Alchem</td><td>696-34967-4X2.5L</td><td>Solvente HPLC</td></tr><tr><td>Acetato di ammonio</td><td>Merck</td><td>5330040050</td><td>Additivo in fase mobile</td></tr><tr><td>BENCHMIXER XL VORTEXER MULTITUBO</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BV1010</td><td>Miscelatore a vortice</td></tr><tr><td>Tappi</td><td>Perlan Technologies</td><td>5183-2076</td><td>Cartuccia blu in PTFE/Si spta pre-fessurata,</td></tr><tr><td>cloroformio</td><td>100PK Merck</td><td>1024441000</td><td></td></tr><tr><td>cartuccia Discovery HS F5 Supelguard, 3 &; m, L &volte; D.I. 2 cm & Colonna</td><td>di protezione HPLC</td><td>Merck</td><td>567570-U</td> da 2,1 mm</tr><tr><td>Discovery HS F5, 2,1 mm x 100 mm, 3 &mu; m</td><td>Merck</td><td>567502-U Colonna</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Alchem</td><td>497-94318-50ML</td><td>Additivo per fase mobile</td></tr><tr><td>Fiale di vetro</td><td>Perlan Technologies</td><td>5182-0714</td><td></td></tr><tr><td>HILIC Luna 3 &mu; m, 200A, 100 x 2,0 mm</td> Colonna <td>HPLC</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-00D-4449-B0</td></tr><tr><td>Cartuccia HILIC SecurityGuard, 3 &; m, 4 x 2,0 mm</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-AJ0-8328</td><td>Colonna di protezione HPLC</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Alchem</td><td>231-AL03262500</td><td>Solvente HPLC</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Alchem</td><td>696-34966-4X2,5L</td><td>Solvente HPLC</td></tr><tr><td>Acqua nanopura</td><td>Merck</td><td>1037281002</td><td>Solvente HPLC</td></tr><tr><td>Q Exactive Focus ibrido quadrupolo-Orbitrap MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive Focus</td><td>Mass Spettrometro</td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-cHILIC 3&micro; m,100&Aring; Colonna HPLC Merck 1506570001 100 x 2,1 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di protezione ZIC-HILIC SeQuant 20 x 2,1 mm</td><td>Colonna di protezione HPLC</td><td>Merck</td><td>1504360001</td></tr><tr><td>Sonde in fibra LC SPME, fibre</td> prototipo <td>Supelco</td> in modalità mista <td>Sistemi</td><td></td></tr><tr><td>HPLC UltiMate 3000</td> Sistema <td>HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>UltiMate 3000</td></tr><tr><td>Inserti per fiale (disattivato)</td><td>Perlan Technologies</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 3,5&mu; m 2,1x75mm</td><td>Colonna</td><td>HPLC</td>Waters <td>186005644</td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 VanGuard Cartuccia 3,5&mu; m, 2,1x5 mm</td><td>Waters</td><td>186007811</td><td>colonna di protezione HPLC</td></tr></tbody></table>

utilizzo di una biopsia chimica per la valutazione della qualità dell'innesto

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Il trapianto di rene è un trattamento salvavita per un gran numero di persone con disfunzione renale in fase finale in tutto il mondo. La procedura è associata ad un aumento del tasso di sopravvivenza e a una maggiore qualità della vita del paziente rispetto alla dialisi convenzionale. Purtroppo, la trapiantologia soffre di una mancanza di metodi affidabili per la valutazione della qualità degli organi. Le tecniche diagnostiche standard sono limitate all'ispezione macroscopica dell'aspetto o alla biopsia dei tessuti invasiva, che non forniscono informazioni complete sull'innesto. Il protocollo proposto mira a introdurre la microestrazione a fase solida (SPME) come metodo analitico ideale per metabolomica completa e analisi lipidomica di tutti i composti molecolari bassi presenti nei reni allocati per il trapianto. Le piccole dimensioni della sonda SPME consentono le prestazioni di una biopsia chimica, che consente l'estrazione di metaboliti direttamente dall'organo senza alcuna raccolta di tessuti. La minima invasività del metodo consente l'esecuzione di più analisi nel tempo: direttamente dopo la raccolta degli organi, durante la sua conservazione, e subito dopo la revascolazione nel corpo del destinatario. Si ipotizza che la combinazione di questo nuovo metodo di campionamento con uno spettrometro di massa ad alta risoluzione consentirà la discriminazione di una serie di composti caratteristici che potrebbero servire come marcatori biologici della qualità dell'innesto e indicatori di possibile sviluppo della disfunzione dell'organo.

La raccolta dei campioni è stata eseguita secondo il metodo SPME descritto in precedenza, utilizzando sonde rivestite con una fase di estrazione in modalità mista di 7 mm. Il campionamento è stato effettuato direttamente dal tessuto di innesto (in vivo prima del trapianto), ex vivo in camera renale dopo 1 h, 3 h, 5 h e 7 h di perfusione, e in vivo dopo la revascolarizzazione nel ricevente. Le analisi metabolomiche e lipidomiche non mirate sono state effettuate con l'uso di cromatografia liquida (RP, HILIC) accoppiata con spettrometria di massa ad alta risoluzione, con l'analizzatore di massa impostato in modalità di ionizzazione positiva. Per valutare la qualità dei dati e ottenere informazioni generali sui risultati, i dati sono stati sottoposti all'analisi dei componenti principali (PCA). Come illustrato nella Figura 1, i campioni QC hanno formato un cluster ristretto, confermando la qualità delle analisi. I gruppi studiati presentano una separazione relativamente buona, consentendo la visualizzazione delle differenze nei profili metabolici e lipidomici prima e dopo il trapianto, nonché durante la perfusione di organi (Figura 2). Il campionamento SPME consente la profilazione metabolica dell'organo nel tempo. I grafici a mano di mano di metaboliti selezionati servono a esemplificare le alterazioni nei livelli dei metaboliti durante l'esperimento (Figura 3). L'ampio spettro di feature estratte separate su entrambe le colonne RP e HILIC è illustrato nella Figura 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig01.jpg"> Figura 1: Analisi principale dei componenti che mostra il raggruppamento di campioni di controllo qualità per le analisi in fase invertita metabolomica (A), HILIC (B) e lipidomica in fase invertita (C), HILIC (D). Il controllo di qualità è necessario nell'analisi non mirata per monitorare eventuali cambiamenti indotti dall'instabilità strumentale. Un gruppo ristretto di campioni di QC garantisce che tutti i cambiamenti osservati siano di origine biologica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig1v2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig02.jpg"> Figura 2: Analisi dei componenti principali che mostra le differenze metabolomiche (A) e lipicomiche (B) tra particolari punti di campionamento. La profilazione non mirata del rene con SPME-LC-HRMS consente di osservare le differenze biochimiche negli organi nelle fasi successive della loro conservazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig2v2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig03.jpg"> Figura 3: grafici a mano di composti selezionati che mostrano alterazioni nei metaboliti (A, B) e lipidi (C, D) durante il periodo del peritransplant. Dopo la selezione e l'identificazione di trame discriminanti di composti box-whisker permette di monitorare i cambiamenti nei livelli di questi composti nelle fasi successive del protocollo e confrontare i livelli dei metaboliti negli organi sottoposti a diversi protocolli di conservazione o raccolti da diversi donatori, ad esempio donatori o donatori di battito cardiaco dopo la morte cardiaca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig3v2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig04.jpg"> Figura 4: mappa Ion (m/z rispetto al tempo di conservazione) delle feature ottenute dall'analisi LC-MS con (A) fase invertita e (B) separazione HILIC. La trama consente di stimare il numero complessivo di caratteristiche ottenute con il protocollo proposto (dall'estrazione al rilevamento) e di valutare la copertura dell'alyte in base alla polarità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig4v2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Il protocollo presenta l'utilizzo dell'approccio chimico biopsia seguito da un'analisi metabolomica e lippidomica completa per la valutazione della qualità degli innesti renali assegnati per il trapianto.

Utilizzo di una biopsia chimica per la valutazione della qualità dell'innesto

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

La biopsia chimica è una nuova soluzione diagnostica nel trapianto di organi per una valutazione rapida e complessa della qualità dell'innesto. Attualmente, non sono disponibili altri metodi a bassa invasività che consentano tale analisi. Il principale vantaggio di questa tecnica è la possibilità di monitorare le modifiche del tessuto di innesto nel tempo di conservazione grazie alla semplicità e alla bassa invasività delle sonde SPME.Il piccolo diametro della sonda e una grande varietà di rivestimenti biocompatibili rendono questo metodo adatto per l'analisi degli organi trapiantati e applicabile nella ricerca medica come l'analisi del tumore. Quando si tenta questa tecnica per la prima volta, prestare attenzione ai dettagli e alla tempistica di particolari passaggi perché piccoli errori possono influenzare pesantemente i risultati. Il protocollo è semplice, ma è più facile da capire ed eseguire dopo la dimostrazione visiva.Iniziare preparando una miscela di precondizione composta da un metanolo e acqua uno a uno. Pipettare un millilitro della soluzione in ogni flaconcino di vetro a due millilitri e posizionare una sonda in ogni flaconcino. Agitare le fiale su un agitatore a vortice a 1200 giri/min per un'ora.Quindi sciacquare le sonde con acqua di grado LCMS e sterilizzarle secondo il protocollo di sterilizzazione chirurgica standard o nel reparto di lavorazione sterile. Quando è pronto per estrarre il campione, aprire l'imballaggio sterile e inserire due sonde direttamente nella corteccia renale per 10 minuti per tempo, assicurandosi che l'intera lunghezza del rivestimento sia coperta dalla matrice tissutale. Assicurarsi di tenere traccia del tempo di campionamento per ogni sonda.Ritrarre la sonda estraerla dal tessuto e sciacquare immediatamente il rivestimento con acqua di grado LCMS per rimuovere il sangue rimanente assicurandosi di risciacquare dal sito chirurgico. Per trasportare le sonde, posizionarle in fiale separate e chiuderle. Quindi posizionare le fiale in una scatola piena di ghiaccio secco o azoto liquido.Conservare i campioni a -80 gradi Celsius o procedere immediatamente con il desorbimento. Preparare una soluzione di desorbimento composta da acetonitrile e acqua per l'analisi metabolomica e un'altra composta da isopropanolo e metanolo per l'analisi lipidomica. Aggiungere 100 microlitri della soluzione agli inserti nei due flaconcini etichettati millilitro e posizionare una sonda in ogni flaconcino agitare i flaconcini a 1200 giri/min per due ore, quindi rimuovere le sonde dai flaconcini e procedere con l'analisi LCMS.La cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa ad alta risoluzione è stata utilizzata per effettuare analisi metabolomiche e lipidomiche non mirate. I dati sono stati sottoposti ad analisi dei componenti principali per valutare la qualità intrattenere informazioni generali sui risultati. I campioni di controllo qualità formavano un cluster stretto che confermava la qualità dell'analisi.I gruppi studiati hanno mostrato una separazione relativamente buona, consentendo la visualizzazione delle differenze nei profili metabolici e lipidomici prima e dopo il trapianto e durante la perfusione di organi. Un ampio spettro di caratteristiche estratte è stato separato sia sulla fase invertita che sulle colonne di cromatografia liquida. Alterazioni e livelli di metaboliti durante l'esperimento sono stati dimostrati con appezzamenti di baffi a scatola dei metaboliti selezionati.Quando si esegue questa procedura, tenere presente l'eterogeneità degli organi. Posizionare la sonda nella posizione desiderata mantenere il tempo di campionamento identico in tutti i punti di tempo e fissare correttamente la fibra dopo il campionamento. I biomarcatori scoperti con SPME possono essere quantificati utilizzando questo metodo di estrazione accoppiato a MSMS, LCMS o altra strumentazione analitica.Inoltre, poiché non viene consumato alcun campione, è possibile eseguire analisi di routine come la biopsia. Il metodo può essere adattato per altre metabolomiche tissutali e analisi lipidomiche senza necessità di pretrattamento del campione. Per metaboliti specifici.Altri rivestimenti possono essere utilizzati per aumentare la selettività e la sensibilità del saggio.

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