Name: Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Impara a purificare fibroblasti e cellule di Schwann da nervi sensoriali e motori in vitro. Questo metodo rapido e affidabile supporta la ricerca sulla rigenerazione nervosa e sulle malattie del sistema nervoso.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo studio è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), dalla National Natural Foundation of China (Grant n. 31500927).

Questo studio è stato effettuato in conformità con le Linee guida istituzionali per la cura degli animali dell'Università di Nantong. Tutte le procedure, compresi i soggetti animali, sono state approvate eticamente dal Comitato di Amministrazione degli Animali Sperimentali, provincia di Jiangsu, Cina.
1. Isolamento e coltura di fibroblasti nervosi motori e sensoriali e SC
<ol><li>Usa i ratti Sprague-Dawley (SD) di sette giorni forniti dal Centro Sperimentale degli Animali della Nantong University of China. Mettere i ratti in un serbatoio contenente il 5% di isoflurane per 2-3 minuti, permettere agli animali di respirare lentamente e non hanno alcuna attività indipendente, e quindi sanificare utilizzando il 75% di etanolo prima della decapitazione.</li>
	<li>Utilizzare le forbici per tagliare la pelle posteriore per circa 3 cm e rimuovere la colonna vertebrale. Aprire accuratamente il canale vertebrale per esporre il midollo spinale.</li>
	<li>Mantenere il midollo spinale in una piastra Petri da 60 mm con 2-3 mL di soluzione di sale bilanciato di D-Hanks ghiacciato (HBSS).</li>
	<li>Sulla base della struttura anatomica, accise la radice ventrale (nervo motore) e poi la radice dorsale (nervo sensoriale) sotto un microscopio dissetante. Successivamente, metterli in una soluzione di sale equilibrato di D-Hanks ghiacciato (HBSS).</li>
	<li>Dopo aver rimosso l'HBSS, affettare i nervi in pezzi da 3-5 mm con le forbici e digerire con 1 mL dello 0,25% (w/v) trypsin a 37 gradi centigradi per 18-20 min. Successivamente, integrare con 3-4 mL di DMEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS) per fermare la digestione.</li>
	<li>Pipette il composto su e giù delicatamente circa 10 volte e centrifugare a 800 x g per 5 min. Dopo di che, scartare il supernatore e sospendere il precipitato in 2-3 mL di DMEM integrato con 10% FBS.</li>
	<li>Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro a 400 maglie, quindi inoculare le cellule in parabola Petri da 60 mm e coltura a 37 gradi centigradi in presenza del 5% di CO2. Dopo 4-5 giorni di coltura, isolare il passaggio 0 (p0) fibroblasti e SC dopo aver raggiunto il 90% di confluenza.</li>
	<li>Isolamento e cultura degli SCs (Figura 1)<ol>
<li>Lavare le cellule una volta utilizzando 1x PBS. Aggiungere 1 mL di 0,25% (w/v) di metapsina (37 gradi centigradi) per la piastra Petri a 60 mm per digerire le cellule per 8-10 s a temperatura ambiente. Dopo di che, aggiungere 3 mL di DMEM integrato con 10% FBS per fermare la digestione.</li>
		<li>Soffiare delicatamente la miscela per staccare le SC con una pipetta. Quindi raccogliere e centrifugare le SC a 800 x g per 5 min.</li>
		<li>Scartare il supernatante e sospendere il precipitato in 3 mL di DMEM con 10% FBS, 1% penicillina / streptomicina, 2 forskolin e 10 ng/mL HRG, quindi inoculare le cellule in piatto Petri non rivestito da 60 mm. Dopo la coltura a 37 o 45 min, i fibroblasti (alcuni dei fibroblasti vengono digeriti con SCs) si attaccano sul fondo del piatto.</li>
		<li>Trasferire il supernatante (comprese le SC) in un altro piatto medio rivestito di poli-L (PLL) e cultura a 37 gradi centigradi per 2 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento e coltura di fibroblasti (Figura 1)<ol>
<li>Dopo aver rimosso i SC (come mostrato al punto 1.8), lavare i fibroblasti rimanenti nei piatti con 1x PBS e quindi aggiungere 1 mL di 0,25% (w/v) trypsin per digerire i fibroblasti per 2 min a 37 .</li>
		<li>Aggiungere DMEM integrato con 10% FBS per terminare la digestione. Soffiare i fibroblasti con una pipetta, quindi raccoglierli e centrifugarli a 800 x g per 5 min.</li>
		<li>Scartare il supernatante, sospendere il precipitato con 2 mL di DMEM contenente il 10% di FBS, quindi inoculare le cellule nella parabola Petri da 60 mm non rivestita. I fibroblasti dopo la coltura per 30-45 min a 37 gradi centigradi si attaccano al fondo del piatto. Scartare il super-attante (compresi alcuni numeri di SC). Quindi aggiungere 3 mL di DMEM integrato con 10% FBS nel piatto fibroblasts e la coltura a 37 gradi centigradi per 2 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passare le cellule p1 fino a raggiungere 90% confluenza. Poi purificarli con la digestione differenziale e l'aderenza differenziale di nuovo come descritto nelle sezioni 1.8 e 1.9.</li>
	<li>Digerire i fibroblasti p2 e le SC dopo la coltura per 2 giorni, quindi raccogliere le cellule, contare e inoculare in 1 x 105 numeri / bene su diapositive Rivestite di PLL per l'immunocitochimica (ICC).</li>
</ol>2. ICC per l'identificazione della purezza cellulare
<ol><li>Coltura le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi ed eseguire la colorazione ICC dopo la digestione differenziale e l'aderenza differenziale dei fibroblasti motori e sensoriali e degli SC.</li>
	<li>Lavare i fibroblasti motori e sensoriali e le SC con 1x PBS e fissarli in 200 gradi centigradi di paraformaldeide del 4% (pH 7,4) per 18 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Bloccare le SC campione con buffer di blocco (0,1% Triton X-100 in 0,01 M PBS contenente il siero di capra 5%) e bloccare i fibroblasti del campione con buffer di blocco (0,01 M PBS contenente 5% siero di capra) per 45 min a 37 gradi centigradi dopo averli lavati con PBS trecento.</li>
	<li>Rimuovere il buffer di blocco e incubare con i seguenti anticorpi primari: anticorpo monoclonale anti-CD90 del topo (un marcatore specifico per i fibroblasti) (1:1000) per i fibroblasti e gli anticorpi anti-S100 del topo (un marcatore specifico per sCs) (1:400) per le SC a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Eliminare gli anticorpi primari, lavare con PBS tre volte, e incubare con i seguenti anticorpi secondari: Alexa Fluor 594 capra anti-topo IgG (1:400) per fibroblasti e 488-coniugato capra anti-topo IgG (1:400) per SCs a temperatura ambiente per 1.5 h.</li>
	<li>Lavare i campioni tre volte con PBS, e macchiare i nuclei con 5 g/mL Hoechst 33342 coloranti per 10 min a temperatura ambiente. Lavare il campione con 1x PBS tre volte e montarli utilizzando il supporto di montaggio (20 gradi centigradi/scorrimento) sul vetrino di vetro.</li>
	<li>Prendere le fotografie delle cellule con microscopio a scansione laser confocale in tre campi casuali per ogni pozzo. Valutare il numero totale di nuclei e cellule CD90-positive, cellule S100-positive e quindi calcolare la percentuale di cellule CD90-positivo e S100-positivo, rispettivamente. Eseguire la colorazione in triplice copia.</li>
</ol>3. Analisi della citometria di flusso (FCA) per l'identificazione della purezza cellulare
<ol><li>Valutare la purezza dei fibroblasti motori e sensoriali e delle SC come descritto in precedenza da FCA16. In breve, digerire il motore p2 e i fibroblasti sensoriali e le SC con 0,25% (w/v) trypsin, risospendere i pellet cellulari e incubarli nel mezzo di fissazione a temperatura ambiente per 15 min.</li>
	<li>Incubare le cellule con mezzo di permeabilizzazione e sonda utilizzando anticorpi monoclonali del topo (0,1 g/106 cellule, 200 l) per fibrolanti e topo anti-S100 anticorpi (1:400, 200 - L) per SCs a temperatura ambiente per 30 min, rispettivamente.</li>
	<li>Incubare le cellule con 488 capre con coniugata IgG per 30 min.</li>
	<li>Incubare le cellule solo con 488-coniugato capra anti-toro IgG (fibroblasts Group) e topo IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Controllo isotipo (gruppo SCs), che serve come controllo negativo.</li>
</ol>4. Analisi statistica
<ol><li>Presentare tutti i dati come mezzi - SEM. Valutare le differenze statistiche nei dati tramite test tnon accoppiato utilizzando GraphPad Prism 6.0. Impostare la significatività statistica su p<0.05. Esegui tutti i saggi in triplice copia.</li>
</ol>

<ol><li>Stierli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+homeostasis+and+regeneration+of+peripheral+nerve+is+distinct+from+the+CNS+and+independent+of+a+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28The+Company+of+Biologists%29%22%5BJournal%5D)">The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population.</a> Development (The Company of Biologists). , (2018).</li>
<li>Schubert, T., Friede, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoneurial+fibroblasts+in+myelin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).</li>
<li>Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibroblast+impact+on+Schwann+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).</li>
<li>Lavdas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+engineered+to+express+the+cell+adhesion+molecule+L1+accelerate+myelination+and+motor+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).</li>
<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143 (1), 145-155 (2010).</li>
<li>Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Controls+the+Long-Term+Survival+and+Phenotype+of+Repair+Schwann+Cells+during+Nerve+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration.</a> Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).</li>
<li>Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+neuron-glial+cell+interaction+and+pathogenesis+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).</li>
<li>Hoke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+express+motor+and+sensory+phenotypes+that+regulate+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).</li>
<li>Brushart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+phenotype+is+regulated+by+axon+modality+and+central-peripheral+location%2C+and+persists+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experiment+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro.</a> Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Gene+Expression+in+Primary+Cultured+Sensory+and+Motor+Nerve+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 1016(2018).</li>
<li>Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeinstein%2C+DE+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. , (2001).</li>
<li>Palomo Irigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Purification+of+Primary+Rodent+Schwann+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).</li>
<li>Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+promotes+Schwann+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation.</a> Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).</li>
<li>Pannunzio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+selecting+Schwann+cells+from+adult+mouse+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve.</a> Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).</li>
<li>Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+Schwann+cells+based+on+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting.</a> Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).</li>
<li>He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+in+the+biological+characteristics+between+primary+cultured+sensory+and+motor+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells.</a> Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).</li>
<li>Weiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+transcriptomics+of+peripheral+nerve+tissue+and+cells+unravel+new+aspects+of+the+human+Schwann+cell+repair+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype.</a> Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le due principali popolazioni cellulari di nervi periferici includevano SC e fibroblasti. I fibroblasti e le SC coltivati principalmente possono aiutare con precisione a modellare la fisiologia di fibroblasti e SC durante lo sviluppo e la rigenerazione dei nervi periferici. Lo studio ha mostrato che le cellule nervose sciatiche di ratti P7 contenevano circa l'85% degli SC S100 positivi, il 13% dei fibroblasti positivi a OX7 e solo l'1,5% dei macrofagi oX42 positivi13. Anche se il numero di fibrobl...

Nel sistema nervoso periferico, le fibre nervose sono costituite principalmente da assoni, cellule di Schwann (SC) e fibroblasti, e contiene anche un piccolo numero di macrofagi, cellule endoteliali microvascolari e cellule immunitarie1. Le SC avvolgono gli assoni in un rapporto 1:1 e sono racchiuse da uno strato di tessuto connettivo chiamato endoneurium. Gli assoni vengono poi raggruppati insieme per formare gruppi chiamati fascicle, e ogni fascicolo è avvolto in uno strato di tessuto connettivo noto come perineurium. Infine, l'intera fibra nervosa è avvolta in uno strato di tessuto connettivo, che è chiamato l'epineurium. Nell'endoneurium, l'intera popolazione cellulare è composta da 48% SC, e una parte sostanziale delle cellule rimanenti coinvolge fibroblasti2. Inoltre, i fibroblasti sono componenti importanti di tutti i compartimenti nervosi, tra cui l'epineurium, il perineurium e l'endoneurium3. Molti studi hanno indicato che SC e fibroblasti svolgono un ruolo cruciale nel processo di rigenerazione dopo le lesioni nervose periferiche4,5,6. Dopo la transezione del nervo periferico, i fibroblasti perineuriali regolano lo smistamento delle cellule attraverso il percorso di segnalazione ephrin-B/EphB2 tra SC e fibroblasti, guidando ulteriormente la ricrescita assonale attraverso le ferite5 . I fibroblasti nervosi periferici secernono la proteina tenascina-C e migliorano la migrazione delle SC durante la rigenerazione dei nervi attraverso il percorso di segnalazione dell'integrazione diz1 7. Tuttavia, le SC e i fibroblasti utilizzati negli studi di cui sopra sono stati derivati dal nervo sciatico, che include nervi sensoriali e motori.
Nel sistema nervoso periferico, i nervi sensoriali (nervi afferenti) conducono segnali sensoriali dai recettori al sistema nervoso centrale (SNC), mentre i nervi motori (nervi efferenti) conducono segnali dal SNC ai muscoli. Studi precedenti hanno indicato che le Ccs esprimono fenotipi motori e sensoriali distinti e secernono fattori neurotrofici per sostenere la rigenerazione del nervo periferico8,9. Secondo un recente studio, i fibroblasti esprimono anche diversi fenotipi motori e sensoriali e influenzano la migrazione delle SC10. Pertanto, l'esplorazione delle differenze tra fibroblasti nervosi motori e sensoriali/SC ci permette di studiare i complicati meccanismi molecolari sottostanti della rigenerazione specifica del nervo periferico.
Attualmente, ci sono molti modi per purificare Le SC e i fibroblasti, tra cui l'applicazione di agenti antimitotici, citolisi mediata da anticorpi11,12, immunopanning sequenziale13 e substrato di laminina14. Tuttavia, tutti i metodi di cui sopra rimuovono i fibroblasti e conservano solo le SCs. SCs altamente purificate e i fibroblasti possono essere ottenuti con la tecnologia di selezione della citometria di flusso15, ma è una tecnica che richiede tempo e denaro. Quindi, in questo studio, è stata sviluppata una semplice digestione differenziale e un metodo di aderenza differenziale per purificare e isolare i fibroblasti nervosi sensoriali e motori e le SC al fine di ottenere un gran numero di fibroblasti e SC più rapidamente.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 Capra Anti-Topo IgG(H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11005</td><td>Diluizione: 1:400</td></tr><tr><td>CoraLite488-coniugato Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)</td><td>Proteintech</td><td>SA00013-1</td><td>Diluizione: 1:400</td></tr><tr><td>Microscopio a scansione laser confocale</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Software Cell Quest</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di D-Hank</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Olympus</td><td>SZ2-ILST</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099-141C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield Mounting Medium</td><td>Abcam</td><td>ab104135</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di fissazione/Mezzo di permeabilizzazione</td><td>Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD</td><td>GAS005</td><td></td></tr><tr><td>Citometria a flusso</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Controllo isotipo</td><td>Abcam</td><td>ab106163</td><td>Diluizione: 1:400</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo anti-CD90</td><td>Abcam</td><td>ab225</td><td>Diluizione: 1:1000 per ICC, 0,1 &micro; g per cellule 106 per Flow Cyt</td></tr><tr><td>Mouse anticorpo anti-S100</td><td>Abcam</td><td>ab212816</td><td>Diluizione: 1:400</td></tr><tr><td>Polilisina (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Proteina del dominio EGF ricombinante NRG1-beta 1/HRG1-beta 1</td><td> D Systems</td><td>396-HB-050</td><td></td></tr><tr><td>0,25% (con v) tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr></tbody></table>

purificazione dei fibroblasti e delle cellule di schwann dai nervi sensoriali e motori in vitro

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Le cellule principali del sistema nervoso periferico sono le cellule di Schwann (SC) e i fibroblasti. Entrambe queste cellule esprimono distintamente i fenotipi sensoriali e motori coinvolti in diversi modelli di espressione genica del fattore neurotrofico e altri processi biologici, che influenzano la rigenerazione dei nervi. Il presente studio ha stabilito un protocollo per ottenere più rapidamente SC e fibroblasti di ratti altamente purificati e motori. La radice ventrale (nervo motore) e la radice dorsale (nervo sensoriale) dei ratti neo-cicliali (7 giorni) sono state dissociate e le cellule sono state coltivate per 4-5 giorni, seguite dall'isolamento dei fibroblasti sensoriali e motori e delle SC combinando in sequenza metodi differenziali di digestione e aderenza differenziale. I risultati delle analisi di immunocitochimica e citometria di flusso hanno mostrato che la purezza delle SC e dei fibroblasti sensoriali e motori era >90%. Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere un gran numero di fibroblasti/SC sensoriali e motori, contribuendo all'esplorazione della rigenerazione del nervo sensoriale e motorio.

Osservazione microscopica leggera Le SC e i fibroblasti sono le due principali popolazioni di cellule ottenute nella coltura cellulare primaria dai tessuti nervosi. Dopo l'inoculazione per 1 h, la maggior parte delle cellule ha aderito al fondo del piatto e la morfologia cellulare è cambiata da rotonda a ovale. Dopo la coltura per 24 h, le SCs hanno esibito una morfologia bipolare o tripolare e la lunghezza di questi variava da 100 a 200 m. Dopo 48 h, si è verificata l...

Qui, presentiamo un metodo per purificare i fibroblasti e le cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in vitro.

Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere un gran numero di sensori e le cellule fibroblasto motore e Schwann rapidamente. Le cellule ottenute attraverso questo messaggio possono essere utilizzate nello studio della rigenerazione nervosa e delle malattie del sistema nervoso. Mostriamo che la dimostrazione può rappresentare lo sperimentale per controllare meglio il tempo del passo digestivo differenziale e rendere i passaggi sperimentali più facili da capire.Per scoppiare utilizzare le forbici per fare un'incisione di tre centimetri, nella pelle della schiena. Rimuovere la colonna vertebrale. Aprire con cura il canale vertebrale per esporre il midollo spinale.Allagare il midollo spinale in una piastra di Petri di 60 millimetri, con da tre a quattro millilitri di soluzione salina bilanciata D Hanks ghiacciata al microscopio sezionato, asportare la radice ventrale e la radice dorsale. Mettili nella soluzione salina bilanciata D Hanks ghiacciata. Dopo aver rimosso l'HBSS, tagliare i nervi in pezzi da tre a cinque millimetri, con le forbici.Aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside e trasferire i pezzi nervosi in cinque tubi di centrifuga millilitro. Incubare a 37 grad

purification-fibroblasts-schwann-cells-from-sensory-motor-nerves

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo video mostra una procedura per isolare i neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG) da embrioni di ratto e co-coltivarli con i precursori delle cellule di Schwann per generare cellule di Schwann mature. I DRG isolati vengono elaborati per isolare i neuroni e le cellule gliali. Le cellule isolate vengono coltivate per purificare i neuroni, che vengono poi co-coltivati con cellule simili a cellule di Schwann (SCLC) in un terreno di co-coltura. L'interazione con i neuroni DRG porta alla...

Isolamento di neuroni DRG e cocoltura con precursori cellulari di Schwann per generare cellule di Schwann

Questo video dimostra un protocollo per isolare e coltivare cellule di Schwann da tessuti dermici umani. Il derma umano contiene vari tipi di cellule, tra cui fibroblasti e cellule di Schwann. Dopo l'isolamento, le cellule vengono trattate con un agente antimitotico per eliminare i fibroblasti proliferanti, ottenendo una coltura pura di cellule di Schwann.

Isolamento e coltura di cellule primarie di Schwann da un derma umano

Questo video descrive l'isolamento e la coltura delle cellule di Schwann dalle radici spinali dei topi. Le cellule isolate vengono quindi coltivate in terreni specifici. Le cellule di Schwann vengono isolate tramite digestione differenziale e aderenza. Successivamente vengono trasferiti su vetrini coprioggetti rivestiti di matrice extracellulare per l'attaccamento e la proliferazione.

Isolamento delle cellule di Schwann dalle radici spinali del topo

Questo video mostra il modello di cocoltura di un espiante di ganglio della radice dorsale e cellule di Schwann. In condizioni di cocoltura, l'acido ascorbico promuove la differenziazione delle cellule di Schwann in forme mielinizzanti. Le cellule mielinizzanti di Schwann avvolgono gli assoni più volte per creare una guaina mielinica, essenziale per la funzione nervosa.

Co-coltura di un espiante di ganglio della radice dorsale con cellule di Schwann per la mielinizzazione dei neuroni

Questo video mostra un metodo per isolare le cellule di Schwann dalle fibre del nervo sciatico di topo.

Separazione magnetica delle cellule di Schwann dai nervi sciatici di topo

Fonte: Han, J., et.al. Regolazione della crescita delle cellule di Schwann mediante campo elettrico pulsato al nanosecondo per la rigenerazione dei nervi periferici in vitro. J. Vis. Exp. (2024)Questo video mostra l'applicazione della tecnica del campo elettrico pulsato a nanosecondi (nsPEF) per modulare la crescita delle cellule di Schwann (SC). I rapidi impulsi elettrici inducono nanopori transitori nelle membrane SC, facilitando l'afflusso di calcio che attiva le vie di segnalazione che...

Regolazione della crescita delle cellule di Schwann in vitro utilizzando la tecnica del campo elettrico pulsato a nanosecondi

Questo articolo descrive un sistema di coltura neuronale che può essere utilizzato per ottenere grandi quantità di campioni assonali puri per analisi biochimiche e immunocitochimiche. Questa tecnica consentirà una migliore comprensione della normale fisiologia assonale e delle vie di segnalazione che portano alla neurodegenerazione.

Produzione e isolamento degli assoni dai neuroni sensoriali per l&#39;analisi biochimica Uso dei filtri porosi

Le cellule stromali del midollo (MSC) con potenziale neurale esistono all'interno del midollo osseo. Il nostro protocollo arricchisce questa popolazione di cellule attraverso precondizionamento ipossico e poi li indirizza a diventare cellule Schwann mature.

Precondizionamento ipossico delle cellule progenitori derivate dal midollo osseo come fonte per la generazione di cellule Schwann mature

Lo studio della guarigione delle ferite associata a lesioni muscoloscheletriche richiede spesso la valutazione delle interazioni in vitro tra cellule di Schwann (SC), cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo descrive l'isolamento, la coltura e la caratterizzazione di queste cellule primarie dal prepuzio umano.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano

Nel sistema di cocoltura dei gangli della radice dorsale e delle cellule di Schwann, può essere studiata la mielinizzazione del sistema nervoso periferico. Questo modello offre opportunità sperimentali per osservare e quantificare la mielinizzazione periferica e per studiare gli effetti dei composti di interesse sulla guaina mielinica.

Mielinizzazione in vitro di assoni periferici in una cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale di ratto e cellule di Schwann

Qui, presentiamo un protocollo per l'applicazione del campo elettrico a impulsi di nanosecondi (nsPEF) per stimolare le cellule di Schwann in vitro. La sintesi e la capacità di secrezione di fattori rilevanti e i cambiamenti del comportamento cellulare hanno convalidato il successo della stimolazione con nsPEF. Lo studio fornisce una visione positiva del metodo di rigenerazione dei nervi periferici.

Regolazione della crescita delle cellule di Schwann mediante campo elettrico pulsato a nanosecondi per la rigenerazione dei nervi periferici in vitro

Impara a purificare fibroblasti e cellule di Schwann da nervi sensoriali e motori in vitro. Questo metodo rapido e affidabile supporta la ricerca sulla rigenerazione nervosa e sulle malattie del sistema nervoso.

Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro

Esplora altri video