Name: Identificazione dei contatti Enhancer-Promoter nei corpi embrionali mediante Quantitative Chromosoma Conformation Capture (4C) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Scopri il metodo 4C per identificare i contatti tra enhancer e promotori nei corpi embrionali derivati da cellule staminali embrionali murine. Questa tecnica quantitativa permette di analizzare le interazioni cromatiniche durante la differenziazione cellulare.

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Ringraziamo F. Le Dily, R. Stadhouders e i membri del laboratorio Graf per i loro consigli e discussioni. G.S. è stata sostenuta da una borsa di studio Marie Sklodowska-Curie (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), T.V.T da una borsa di studio post-dottorato Juan de la Cierva (MINECO, FJCI-2014-22946). Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del7th Framework Programme FP7 (ERC Synergy Grant 4D-Genome, accordo 609989 a T.G.), del Ministero spagnolo dell'economia, dell'industria e della competitività (MEIC) al partenariato EMBL, Centro de Excelencia Severo Ochoa 2013-2017 e del programma CERCA Generalitat de Catalunya.

1. Generazione di corpi embrionali da cellule staminali embrionali di topo
<ol><li>Preparare il mezzo di coltura senza siero mESC: DMEM/F12 e mezzo neurobasale mescolati a un rapporto di 1:1. Il mezzo di coltura è integrato con MEM soluzione di amminoacidi non essenziali (1x), pyruvate di sodio (1 mM), L-glutamina (2 mM), penicillina-streptomycin (100 U/mL), beta-mercaptoe integratori a cui la parte (50 M), N2 e B27 (1x), PD0325901 (1 M), CHIR99021 (3 M) e il fattore inibitorio della leucemia (LIF) (1.000 U/mL).</li>
	<li>Preparare il mezzo di differenziazione EB: DMEM integrato con 10% siero bovino fetale (FBS), MEM acidi non essenziali (1x), pironevate di sodio (1 mM), L-glutamina (2 mM), penicillina-streptomica (100 U/mL), beta-mercapethanol (50 mM).</li>
	<li>Coltura mESC su 10 cm piatti di plastica prerivestiti con 0.1% (w/v) gelatina in mESC coltura senza siero.</li>
	<li>Quando gli mESC raggiungono il 60% di confluenza, rimuovete il mezzo di coltura e lavate delicatamente 1x con 2 mL di PBS sterilizzato.</li>
	<li>Rimuovere completamente PBS e aggiungere 2 mL di mezzo di stacco cellulare. Incubare il piatto di coltura a 37 gradi centigradi per 5 min.</li>
	<li>Disattivare la reazione aggiungendo 8 mL di mezzo di differenziazione EB nel piatto.</li>
	<li>Dissociare le colonie di mESC pipetting su e giù 15-20 volte per ottenere una sospensione a singola cella.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min e rimuovere con attenzione il supernatante.</li>
	<li>Contare le cellule (ad esempio, utilizzando un emocitometro).</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare con il mezzo di differenziazione EB e regolare la concentrazione a 2 x 104 celle/mL.</li>
	<li>Invertire il coperchio di un piatto di coltura di 15 cm e utilizzare una pipetta multicanale da 200 l per depositare 20 gocce di celle risospese (400 celle/goccia) sul coperchio.</li>
	<li>Invertire il coperchio con cura sulla camera inferiore e incubare il piatto con gocce appese a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 e 95% di umidità per 3 giorni.</li>
	<li>Raccogliere gli EB lavando delicatamente il coperchio con 10 mL di PBS e trasferire le sospensioni contenenti EB in un tubo di plastica da 50 mL.</li>
	<li>Posizionare il tubo a RT per 30 min, in modo che gli EB affonderanno sul fondo per gravità. Rimuovere con attenzione il super-natante.</li>
	<li>Risospendere delicatamente gli EB con 10 mL di mezzo di differenziazione EB fresco e trasferirli in una parabola Petri batteriologica di 10 cm.</li>
	<li>Controllare la formazione di EB 3-6 giorni dopo utilizzando un microscopio invertito. Le eB generate devono essere di dimensioni rotonde e omogenee.</li>
	<li>Incubare le colture a 37 gradi centigradi con un 5% di CO2 e 95% di umidità. Gli EB continueranno a differenziarsi nei tre strati germinali e potranno essere raccolti in vari momenti di analisi.</li>
</ol>2. Dissociazione degli EB
<ol><li>Raccogliere gli EB da due a tre piatti da 10 cm in un tubo di plastica da 50 ml. Centrifugare gli EB a 300 x g a RT per 5 min, quindi rimuovere con attenzione il supernatante.</li>
	<li>Risospendere gli EB con 10 mL di PBS. Centrifuga EBs a 300 x g a RT per 3 min e rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di trypsin-EDTA (0,25%) al pellet e incubare il tubo a 37 gradi centigradi per 15 min. Pipette su e giù ogni 3 minuti per ottenere una sospensione a cella singola.</li>
	<li>Aggiungere 8 mL di mezzo di differenziazione EB per arrestare la reazione trypsin. Controllare la dissociazione EB al microscopio e contare le cellule.</li>
</ol>3. Fissazione
<ol><li>Risospendere le cellule nel mezzo di coltura EB fresco a 1 x 106 cellule / mL. Per un tubo da 50 mL, utilizzare un massimo di 4,5 x 107 celle in 45 mL di mezzo.</li>
	<li>Aggiungere la paraformaldeide da uno stock del 37% (non più vecchio di 6 mesi) a una concentrazione finale dell'1%. AVVISO: Seguire le adeguate norme di salute e sicurezza durante la manipolazione della paraformaldeide perché è una sostanza chimica pericolosa.</li>
	<li>Incubare per 10 min a RT a rotazione.</li>
	<li>Quench formaldeide con l'aggiunta di glicina ad una concentrazione finale di 0.125 M.</li>
	<li>Incubare per 5 min a RT a rotazione.</li>
	<li>Trasferire le celle fisse sul ghiaccio e mantenere freddo a 4 gradi centigradi d'ora in poi.</li>
	<li>Pellere le cellule a 300 x g per 5 min in una centrifuga refrigerata.</li>
	<li>Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet a freddo PBS (1 mL per 5 x 106 celle), quindi trasferire a 1,5 mL tubi di blocco sicuro.</li>
	<li>Pellet le cellule a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, scartare il supernatante, e bloccare i pellet in azoto liquido. Memorizzare a -80 gradi centigradi o procedere con il protocollo riportato di seguito.</li>
</ol>4. Lalisi cellulare e la digestione enzimatica di restrizione
<ol><li>Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 0,25 mL di cuscinetto di lisi fredda di ghiaccio appena preparato (10 mM Tris-HCl pH : 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% Igepal CA630 e 1x inibitori proteasi) per 2-5 x 106 cellule. Per preparare 5 mL di buffer di lisi, vedere la tabella 1.</li>
	<li>Incubare le cellule per 15 min sul ghiaccio.</li>
	<li>Centrifuga a 1.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e tenere il pellet, che contiene i nuclei.</li>
	<li>Lavare i nuclei pelleta con 500 luna di lisi fredda tampone.</li>
	<li>Risospendere delicatamente il pellet in un tubo da 1,5 mL con 50 Gradi L di 0,5% di SDS nel buffer 1x 2, quindi incubare il tubo in un blocco di riscaldamento a 62 gradi centigradi per 10 min.</li>
	<li>Togliere i tubi dal blocco di riscaldamento e aggiungere 170 lofile di tampone di digestione contenente 25 - L di 10% triton X-100 per dissetare la SDS. Mescolare bene pipettando, evitando schiuma eccessiva.</li>
	<li>Incubare a 37 gradi centigradi per 15 min.</li>
	<li>Aggiungere 25 l di buffer di digestione, mescolare invertendo, e prendere 8 l come un controllo non digerito. Mantenere il campione di controllo non digerito a -20 . Aggiungere 100 Enzimi di restrizione U MboI (4 gradi di uno stock di 25 U/L) ai nuclei rimanenti e digerire la cromatina per 2 h a 37 gradi centigradi a rotazione. Aggiungere un'altra aliquota di 100 U di MboI e incubare per altri 2 h.</li>
	<li>Aggiungere altri 100 U di MboI e incubare a rotazione durante la notte a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Il giorno successivo, aggiungere altri 100 U di MboI e incubare per 3 h a 37 gradi centigradi a rotazione.</li>
	<li>Prendere 8 -L come campione di controllo digerito. De-crosslink campioni di controllo digerito e i campioni di controllo non digerito dal passo 4.8 aggiungendo 80 L di tampone TE (10 mM Tris pH , 8, 1 mM EDTA) e 10 -L di proteinae K (10 mg/mL). Incubare a 65 gradi centigradi per 1 ora.</li>
	<li>Eseguire 20 aliquote su un gel dello 0,6% per verificare l'efficienza della digestione. Le digestione riuscite mostrano per lo più frammenti nell'intervallo di 3,0-0,5 kb.</li>
</ol>5. Legatura di prossimità e inversione del collegamento incrociato
<ol><li>Incubare i campioni di MboI-digested a 65 gradi centigradi in un blocco di riscaldamento per 20 minuti per inattivare MboI, quindi raffreddare a RT.</li>
	<li>Centrifugare i tubi per 5 min a 1.000 x g a RT, rimuovere il supernatante e sciogliere il pellet in 200 .</li>
	<li>Aggiungere 1.000 l della miscela master di legatura ad ogni campione. Per preparare 1.000 l del mix master di legatura, vedere tabella 2.</li>
	<li>Mescolare invertendo e incubando a RT durante la notte con rotazione lenta (9 giri).</li>
	<li>Eliminare i residui di RNA e proteine aggiungendo 100 l di proteineassi K (10 mg/mL) e 10 -L di RNase A (10 mg/mL). Incubare campioni a 55 gradi centigradi per 45-60 min.</li>
	<li>Proseguire con i campioni di incubazione a 65 gradi centigradi per altre 4 h.</li>
</ol>6. tosatura del DNA e selezione delle dimensioni
<ol><li>Tubi freddi a RT.</li>
	<li>Centrifuga per 5 min a 1.000 x g a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Dividere il campione in tre tubi da 400 l in tubi da 2 mL e aggiungere 2 luna di glicogeno (20 mg/m), 40 l di acetato di sodio (3 M, pH e 5,2) e 2,5 x volumi (1 mL) del 100% di etanolo per ogni tubo. Mescolare invertendo e incubando a -80 gradi centigradi per 45-60 min.</li>
	<li>Centrifuga a 16.000 x g a 4 gradi centigradi per 25 min. Mantenere i tubi sul ghiaccio dopo la filatura e rimuovere con attenzione il supernatante con la pipettatura.</li>
	<li>Lavare i pellet di DNA risuspendendo in 800 : L del 70% di etanolo. Centrifuga a 16.000 x g a 4 gradi centigradi per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante ed eseguire il lavaggio ancora una volta con 800 luna di 70% di etanolo.</li>
	<li>Sciogliere il pellet in 130 gradi l di 1x di tampone Tris (10 mMM Tris-HCl, pH - 8) e incubare a 37 gradi centigradi per 15 min per sciogliere completamente il DNA. Se necessario, utilizzare il pipettaggio per risospendere qualsiasi precipitare.</li>
	<li>Misurare la resa del DNA; 2,5-5 g di cromatina ci si può aspettare per 1 x 106 cellule. Controllare la legatura eseguendo 200 ng del prodotto 3C su un gel di agarose 0.6%. Legature di successo mostrano per lo più frammenti di DNA > 3 kb. Conservare i campioni a -20 gradi centigradi.</li>
	<li>Diluire un campione in un tubo da 0,65 mL adatto per la sonicazione a 10 ng/L in 100 -L di 1x volume di buffer Tris (1 g per tubo). La quantità standard utilizzata per la preparazione della libreria è di 3 g, quindi eseguire la sonicazione in tre tubi separati, se necessario.</li>
	<li>Inclinare il DNA a una dimensione di 150-700 bp (media 400-500 bp) utilizzando i seguenti parametri sul sonicatore: Cicli: 6-8 di 20 s su -60 s off. Questo dovrebbe rendere il DNA adatto per la preparazione della libreria di sequenziamento ad alto valore di velocità utilizzando I sequencer.</li>
	<li>Trasferire il DNA trasato in un normale nuovo tubo di sicurezza. Raggruppare più sonicazioni dello stesso campione.</li>
	<li>Riscaldare una bottiglia di perline di purificazione del DNA a RT. D'ora in eora, usa suggerimenti per l'associazione bassa.</li>
	<li>Aggiungere 1,8 volte volumi di perline al tubo di DNA e risospendere delicatamente.</li>
	<li>Incubare a RT per 5 min.</li>
	<li>Raccogliere le perline con un rack magnetico. Lavare le perline 2x con 1 mL di etanolo appena preparato 80% mantenendo i tubi nel rack magnetico. NOTA: rimuovere tutto l'etanolo, incluse le goccioline residue.</li>
	<li>Asciugare all'aria brevemente le perline (2-3 min) alla RT. NOTA: Non asciugare perline più lunghe di 5 min. Questo diminuirà la resa del DNA.</li>
	<li>Risospendere le perline con 90 : L di 1x Buffer Tris (10 mM Tris-HCl, pH - 8) per eluire il DNA.</li>
	<li>Misurare la resa del DNA e analizzare un 5 L L su un gel 1.5%. Ci dovrebbe essere una perdita molto scarsa rispetto al rendimento della presanicazione.</li>
</ol>7. Preparazione della biblioteca per il sequenziamento
<ol><li>Aggiungere 15 -L di master mix dal kit di preparazione della libreria. Per riparare le estremità del DNA trasciato, combinare 10 : L di 10x end repair reaction buffer e 5 -L di mix di enzimi di riparazione finale.</li>
	<li>Incubare a RT per 30 min.</li>
	<li>Aggiungere 1,1 volte di volume di perline di purificazione del DNA e rispendere delicatamente.</li>
	<li>Incubare a RT per 5 min.</li>
	<li>Raccogliere le perline con un rack magnetico. Lavare le perline due volte con 1 mL di etanolo appena preparato 80% mantenendo i tubi nel rack magnetico. Rimuovere l'etanolo.</li>
	<li>Asciugare all'aria le perline per 2-3 min a RT. Risospendere le perline con 42 .</li>
	<li>Aggiungete 8 l di miscela master a coda dA ad ogni campione. Per preparare il master mix dA-tailing, unire 5 L L di 10x buffer di reazione dA-tailing e 3 -L di Klenow frammento exo minus.</li>
	<li>Incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.</li>
	<li>Aggiungere 2 vitelli intestinali fosfoforesi (CIP) per deforograre il DNA.</li>
	<li>Incubare per 30 min a 37 gradi centigradi, quindi 60 min a 50 gradi centigradi.</li>
	<li>Aggiungere 1,1 x volumi di perline di purificazione del DNA e risospendere delicatamente.</li>
	<li>Incubare a RT per 5 min.</li>
	<li>Raccogliere le perline con un rack magnetico. Lavare le perline 2x con 1 mL di etanolo appena preparato 80% mantenendo i tubi nel rack magnetico.</li>
	<li>Asciugare all'aria le perline per un breve periodo (2-3 min) a RT. Resuspend perline con 35 .L di 1x Tris buffer (10 mM)Tris-HCl, pH - 8) per eluire il DNA.</li>
	<li>Eseguire la reazione di legatura dell'adattatore. Utilizzare le concentrazioni ridotte di adattatori/ligase come indicato nella tabella 3.</li>
	<li>Incubare a 20 gradi centigradi per 15 min.</li>
	<li>Aggiungete 3-L della miscela di glicosilil dna e lisciase del DNA liscino ndonte viI (ad esempio, USER), mescolare per pipettaggio e incubare a 37 gradi centigradi per 15 min.</li>
	<li>Aumentare il volume a 100 gradi con acqua, far bollire 5 min a 96 gradi centigradi, quindi tenere i campioni sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 1,1 x volumi di perline di purificazione del DNA e risospendere delicatamente.</li>
	<li>Incubare a RT per 5 min.</li>
	<li>Raccogliere le perline con un rack magnetico. Lavare le perline 2x con 1 mL di etanolo appena preparato 80% mantenendo i tubi nel rack magnetico.</li>
	<li>Asciugare all'aria le perline per 2-3 min a RT. Risospendere le perline con 50 .L di 1x Tris buffer (10 mM Tris-HCl, pH - 8) per eluire il DNA.</li>
</ol>8. 4C cromatina libreria di interazione amplificazione e purificazione
<ol><li>Amplificare la libreria 4C utilizzando 10 l di libreria per effettuare il primo PCR. L'installazione e il programma PCR sono disponibili nella tabella 4.</li>
	<li>Eseguire PCR nidificato. L'installazione e il programma PCR nidificati sono disponibili nella tabella 5.</li>
	<li>Raggruppa i prodotti PCR per ogni libreria e purifica con una perla di purificazione del DNA 1.1x.</li>
	<li>Misurare la resa del DNA e analizzare un 5 L- aliquota su un gel 1.5%.</li>
	<li>Regolare la concentrazione della libreria e sequenziare la libreria. Se indicizzate, è possibile raggruppare in pool le librerie prima della sequenza.</li>
</ol>

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<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+from+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Stadhouders, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+chromosome+conformation+capture+sequencing+for+rapid+genome-scale+high-resolution+detection+of+long-range+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplexed chromosome conformation capture sequencing for rapid genome-scale high-resolution detection of long-range chromatin interactions.</a> Nature Protocols. 8 (3), 509-524 (2013).</li>
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<li>Schwartzman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UMI-4C+for+quantitative+and+targeted+chromosomal+contact+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">UMI-4C for quantitative and targeted chromosomal contact profiling.</a> Nature Methods. 13 (8), 685-691 (2016).</li>
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<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interplay+between+enhancer-promoter+topology+and+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dynamic interplay between enhancer-promoter topology and gene activity.</a> Nature Genetics. 50 (9), 1296-1303 (2018).</li>
<li>Apostolou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+chromatin+interactions+of+the+Nanog+locus+in+pluripotency%2C+differentiation%2C+and+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide chromatin interactions of the Nanog locus in pluripotency, differentiation, and reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 699-712 (2013).</li>
<li>de Wit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotent+genome+in+three+dimensions+is+shaped+around+pluripotency+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pluripotent genome in three dimensions is shaped around pluripotency factors.</a> Nature. 501 (7466), 227-231 (2013).</li>
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<li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li>
<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+Capture+Hi-C%3A+High-resolution%2C+Genome-wide+Profiling+of+Promoter+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo di coltura della caduta sospesa non ha bisogno di ulteriori fattori di crescita o citochine e genera riproducibilmente popolazioni omogenee di EB da un numero predeterminato di mESC5. Qui descriviamo un protocollo di quantitative 4C adattato dall'approccio UMI-4C per quantificare il contatto enhancer-promotore dei fattori di trascrizione specifici del lignaggio nel modello di differenziazione EB. Abbiamo identificato le regioni della cromatina che contattano i promotori dei geni Pou5f1 e T in modo dinamico durante la differenziazione EB. Pou5f1 è stato regolato durante la differenziazione EB e la frequenza di contatto tra il promotore Pou5f1 e il suo potenziatore distale è diminuita. Al contrario, T è stato regolato durante la differenziazione EB e abbiamo identificato tre stimolatori per i quali le frequenze di contatto con il loro promotore sono diminuite (Figura 3). Per confermare l'identificazione, un'immunoprecipitazioni della cromatina (ChIP) di marchio istorio attivo H3K27ac può essere eseguita24, in quanto questo segno istono è stato dimostrato essere associato con l'attivazione potenziatore e stimolatori perdere questo marchio durante la loro inattivazione11.
Una tecnica standard 4C è stata ampiamente utilizzata per esaminare il profilo di contatto della cromatina di specifici siti genomici25. Tuttavia, questo approccio è difficile da interpretare quantitativamente anche dopo un'ampia normalizzazione26,27,28 a causa delle distorsioni introdotte dall'eterogeneità delle dimensioni dei frammenti PCR e dall'impossibilità di distinguere i duplicati PCR. Il nostro metodo quantitativo 4C è in gran parte identico alla tecnica UMI-4C che consente la quantificazione di singole molecole utilizzando la sonicazione e un passo PCR mediato a legatura nidificata per aggirare la limitazione del classico approccio 4C23. Tuttavia, a differenza dell'UMI-4C che utilizza identificatori molecolari univoci, il nostro protocollo quantitativo 4C consente la quantificazione di singole molecole in base alla rottura specifica del DNA prodotta dalla fase di sonicazione. Rende il nostro protocollo compatibile con i kit di preparazione della libreria del DNA commerciale, eliminando la necessità di primer con identificatori molecolari unici.
Il nostro protocollo prevede diversi passaggi chiave che dovrebbero essere considerati. Come nel metodo 4C classico28, fattori critici del nostro protocollo sono l'efficienza della digestione e la legatura durante la preparazione delle molecole 3C. Basse efficienze di digestione/legamento possono ridurre drasticamente la complessità dell'interazione con un frammento di interesse, con conseguente riduzione della risoluzione. Come descritto in precedenza23, un altro passaggio critico del protocollo è la progettazione dei primer per l'amplificazione della libreria. I secondi primer di reazione PCR dovrebbero trovarsi a 5-15 nt dal sito di restrizione interrogatorio. In una lettura di sequenza 75 nt, ciò consente di almeno 40 nt a sinistra della lunghezza di acquisizione per il mapping. Il primer utilizzato nella prima reazione PCR deve essere progettato a monte del secondo primer senza sovrapposizioni ed entrambi dovrebbero essere sufficientemente specifici da garantire un'amplificazione efficiente del DNA. Per il multiplexing, i primer devono essere progettati in modo indipendente, puntando a una temperatura di fusione (Tm)di 60-65 gradi centigradi. Inoltre, come per altre tecniche 3C, la risoluzione del metodo quantitativo 4C è determinata dall'enzima di restrizione utilizzato nel protocollo25. Questo protocollo utilizza un enzima di restrizione con un sito di riconoscimento di 4 bp, MboI. La risoluzione massima con questo enzima è di circa 500 bp, ma questo è altamente dipendente dal locus e raramente raggiunto. Un'altra limitazione è che le interazioni che si verificano tra gli elementi che si trovano nello stesso frammento di restrizione non sono rilevabili. Inoltre, le interazioni che si verificano a una distanza di un sito di restrizione non possono essere distinte dallo sfondo non digerito. L'uso di un passaggio di riempimento prima della legatura potrebbe consentire il rilevamento di queste interazioni.
Quantitative 4C è ideale per interrogare i contatti della cromatina di loci mirati. Tuttavia, la fase specifica di amplificazione PCR limita il numero di loci che possono essere studiati contemporaneamente. Un modo per aumentare il numero di loci mirati è quello di multiplex passaggi PCR per amplificare contemporaneamente diversi obiettivi, ma questo richiede la compatibilità dei primer utilizzati e testare ogni coppia di primer prima dell'implementazione. Se si desiderano cambiamenti globali dell'architettura della cromatina nei promotori, approcci a livello di genoma come Hi-C, PC Hi-C o HiChIP sarebbero più appropriati29,30,31.

Nei topi, la massa cellulare interna (ICM) di embrioni di 3,5 giorni contiene cellule staminali pluripotenti embrionali. L'ICM si sviluppa ulteriormente nell'epiblast al giorno 4.5, generando ectodermi, mesodermi ed cellule endodermiche, i principali tre strati germinali nell'embrione. Sebbene le cellule pluripotenti nell'ICM esistano solo in modo transitorio in vivo, possono essere catturate nella coltura dalla creazione di cellule staminali embrionali di topo (mESC)1,2,3. I mESC rimangono in uno stato indifferenziato e proliferano a tempo indeterminato, ma su stimoli intrinseci ed estrinseci sono anche in grado di uscire dallo stato di pluripotenza e generare cellule dei tre strati germinali dello sviluppo2,4. È interessante notare che, quando coltivati in sospensione in piccole goccioline, le mESC formano aggregati tridimensionali (cioè EB) che si differenziano in tutti e tre gli strati germinali5. L'analisi della formazione EB è uno strumento importante per studiare il processo di specifica del lignaggio precoce.
Durante la specifica del lignaggio, le cellule di ogni strato germinale acquisiscono un programma di espressione genica specifico4. L'esatta espressione spatiotemporale dei geni è regolata da diversi elementi cis-regolatori, tra cui promotori di base, esaltatori, silenziatori e isolanti6,7,8,9.9 Stimolatori, segmenti di DNA regolatori in genere che abbracciano poche centinaia di coppie di basi, coordinano l'espressione genica specifica del tessuto8. Gli esaltatori sono attivati o silenziati mediante il legame di fattori di trascrizione e cofattori che regolano la struttura della cromatina locale8,10. Le tecniche comunemente usate per identificare gli stimolatori sono l'immunoprecipitazioni di cromatina a livello di genoma, seguita dal sequenziamento (ChIP-seq) e il test per la cromatina accessibile alla trasposta utilizzando tecniche di sequenziamento (ATAC-seq). Così, esaltatori attivi sono caratterizzati da specifici segni itoni attivi e da una maggiore accessibilità del DNA locale11,12,13,14. Inoltre, si ritiene che gli esaltatori dello sviluppo richiedano l'interazione fisica con il loro promotore di cognato8,9. Infatti, è stato dimostrato che le varianti e le delezioni dell'potenziatore che interrompono i contatti del promotore dell'avanzata possono portare a malformazioni dello sviluppo15. Pertanto, vi è la necessità di nuove tecniche che forniscano informazioni aggiuntive per l'identificazione dei potenziatori funzionali che controllano l'espressione genica dello sviluppo.
Dallo sviluppo della tecnica di cattura della conformazione cromosomica (3C)16, la mappatura dei contatti cromosomici è stata utilizzata in modo intensivo per valutare la distanza fisica tra gli elementi normativi. È importante sottolineare che di recente sono state sviluppate varianti ad alto contenuto di velocità effettiva di tecniche 3C, fornendo diverse strategie per la fissazione, la digestione, la legatura e il recupero dei contatti tra frammenti di cromatina17. Tra questi, in situ Hi-C è diventata una tecnica popolare permettendo il sequenziamento di prodotti di ligazione 3C genome-wide18. Tuttavia, gli elevati costi di sequenziamento necessari per raggiungere una risoluzione idonea per l'analisi dei contatti enhancer-promotore rende questa tecnica poco pratica per lo studio di loci specifici. Pertanto, sono stati sviluppati metodi alternativi per analizzare i loci mirati ad alta risoluzione19,20,21,22. Uno di questi metodi, vale a dire 4C, noto come uno contro tutta la strategia, consente il rilevamento di tutte le sequenze che contattano un sito selezionato come punto di vista. Tuttavia, uno svantaggio della tecnica standard 4C è la PCR inversa richiesta, che amplifica frammenti di dimensioni diverse, favorendo i piccoli prodotti e la quantificazione di biasimata dopo il sequenziamento ad alto throughput. Recentemente, UMI-4C, è stata sviluppata una nuova variante della tecnica 4C che utilizza identificatori molecolari univoci (UMI) per la profilazione quantitativa e mirata dei contatti cromosomici che aggira questo problema23. Questo approccio utilizza frese frequenti, sonicazione e un protocollo PCR mediato con legatura nidificata, che comporta così l'amplificazione di frammenti di DNA con una distribuzione della lunghezza relativamente uniforme. Questa omogeneità riduce le distorsioni nel processo di amplificazione delle preferenze PCR per sequenze più brevi e consente un recupero efficiente e un conteggio accurato delle molecole/frammenti collegati spazialmente.
Qui descriviamo un protocollo che adatta la tecnica UMI-4C per identificare e quantificare i contatti della cromatina tra promotori e stimolatori dei fattori di trascrizione istruttivi del lignaggio durante la differenziazione EB.

<table><tbody><tr><td>0,1% Gelatina EmbryoMax</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td></td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>10136224</td><td>Purificazione 4C/DNA</td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanolo</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico</td><td>Diagencode</td><td>B01060010</td><td>4C/sonicazione</td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td>4C</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1263</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>CIP</td><td>NEB</td><td>M0212</td><td>4C</td></tr><tr><td>cOmplete Proteasi Inibitore Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td>4C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 medio</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>Cell coltura</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td>4C</td></tr><tr><td>ESGRO Fattore inibitorio della leucemia (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide (37%)</td><td>Sigma</td><td>252549-25ML</td><td>4C</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>GE17-1323-01</td><td>4C</td></tr><tr><td>Glicogeno</td><td>ThermoFischer</td><td>R0551</td><td>4C</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA polimerasi</td><td>Agilent</td><td>600675</td><td>4C</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I3021-50ML</td><td>4C</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td></td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>MboI</td><td>NEB</td><td>R0147M</td><td>4C</td></tr><tr><td>MEM aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>N2 integratore</td><td>Gibco</td><td>A1370701</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>NEBNext Preparazione della libreria di DNA</td><td>NEB</td><td>E6040</td><td>4C</td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>4C/digestione</td></tr><tr><td>Terreno neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1036</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td>4C</td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorimetro</td><td>ThermoFischer</td><td>Q33238</td><td>4C</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit di analisi</td><td>ThermoFischer</td><td>Q32851</td><td>4C</td></tr><tr><td>RNasi A</td><td>ThermoFischer</td><td>EN0531</td><td>4C</td></tr><tr><td>Soluzione di piruvato di sodio</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Reagente di Dissociazione Cellulare</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Coltura Cellulare</td></tr><tr><td>T4 Tampone di Reazione DNA Ligasi NEB</td><td></td><td>B0202S</td><td>4C</td></tr><tr><td>T4 Tampone di Reazione DNA Ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202M</td><td>4C</td></tr></tbody></table>

identificazione dei contatti enhancer-promoter nei corpi embrionali mediante quantitative chromosoma conformation capture (4c)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Durante lo sviluppo dei mammiferi, i destini cellulari sono determinati attraverso la creazione di reti regolatorie che definiscono la specificità, la tempistica e i modelli spaziali dell'espressione genica. I corpi embrionali (EB) derivati dalle cellule staminali pluripotenti sono stati un modello popolare per studiare la differenziazione dei principali tre strati germinali e per definire i circuiti regolatori durante la specifica del destino cellulare. Anche se è ben noto che gli stimolatori specifici dei tessuti svolgono un ruolo importante in queste reti interagendo con i promotori, assegnarli ai loro geni bersaglio rilevanti rimane ancora impegnativo. Per rendere possibile tutto ciò, sono necessari approcci quantitativi per studiare i contatti potenziatori-promotori e le loro dinamiche durante lo sviluppo. Qui, abbiamo adattato un metodo 4C per definire gli esaltatori e i loro contatti con i promotori di cognati nel modello di differenziazione EB. Il metodo utilizza spesso enzimi di restrizione di taglio, sonicazione e un protocollo PCR mediato con la legatura nidificata compatibile con i kit di preparazione della libreria del DNA commerciale. Successivamente, le librerie 4C sono sottoposte a sequenziamento ad alto contenuto di velocità e analizzate in modo bioinformatico, consentendo il rilevamento e la quantificazione di tutte le sequenze che hanno contatti con un promotore scelto. I dati di sequenziamento risultanti possono essere utilizzati anche per ottenere informazioni sulle dinamiche dei contatti enhancer-promotore durante la differenziazione. La tecnica descritta per il modello di differenziazione EB è facile da implementare.

Sei giorni dopo l'induzione della differenziazione eSC nelle cadute appese, abbiamo ottenuto una popolazione omogenea di EB che sono stati utilizzati per ulteriori analisi (Figura 1). Abbiamo adattato il metodo UMI-4C23 per quantificare l'interazione specifica della cromatina a favore dei promotori di geni specifici del lignaggio inEB 24. Nella pagina 2Aè illustrata una panoramica schematica del protocollo con gel di controllo qualità rappresentativi a diverse fasi. Il primo controllo di qualità è stato effettuato per determinare l'efficienza della digestione degli enzimi di restrizione MboI. La digestione efficiente ha mostrato una dimensione del frammento inferiore a 3 kbp (Figura 2B). Da notare che la digestione della cromatina mESC ed EB era difficile e talvolta residua cromatina non digerita persisteva. Il secondo controllo di qualità è stato effettuato dopo la legatura per verificare che la maggior parte dei frammenti erano ora &gt; 3 kbp (Figura 2B). Quindi, i frammenti di cromatina ottenuti dopo la sonicazione sono stati analizzati dall'elettroforesi gel. Dimensioni dei frammenti di 400-500 bp erano attese (Figura 2B).
Dopo la sforosforalazione e la legatura dell'adattatore monofinale, sono stati eseguiti due cicli di PCR per amplificare gli obiettivi di interesse. Un approccio nidificato è stato utilizzato per progettare un set di due primer per ogni locus. Ciò ha contribuito a migliorare la specificità. Ogni obiettivo è stato amplificato separatamente con due diverse coppie di primer per ottimizzare le condizioni PCR (cioè le coppie primer A e B per le coppie Pou5f1 e primer C e D per il locus T, rispettivamente) e ha provocato uno striscio di DNA intorno a 400 bp (Figura 2C). In alternativa, la PCR multiplex è stata eseguita per amplificare contemporaneamente gli obiettivi A e C (Figura 2D) e ha prodotto una dimensione di frammento simile dopo la purificazione (Figura 2D). I primer utilizzati per la preparazione della biblioteca 4C (loci di Pou5f1 e T) sono disponibili nella tabella 6.
Per l'analisi dei dati, le letture di sequenziamento grezzo sono state prima allineate al genoma del topo refence mm10, sono state tutte duplicate e le letture di bassa qualità (&lt; 20) sono state rimosse. Per ogni esca, le informazioni su ogni frammento di restrizione sono state ottenute calcolando il numero di frammenti letti ed è stato ottenuto un profilo di contatto non elaborato. Successivamente, la regione di interesse è stata definita come tutti i frammenti di restrizione con 2 kbp e 250 kbp di distanza dall'esca. La dimensione di ogni frammento di restrizione è stata aumentata aggregando i frammenti di restrizione adiacenti in sequenza per attenuare i profili fino a raggiungere una soglia del 5% del numero totale di contatti non elaborati nell'area di interesse. Per garantire che le repliche fossero integrate e che le condizioni fossero confrontate, abbiamo incluso sia pendenze che intercettazioni casuali a livello di frammento di restrizione. Il profilo medio per condizione e il cambio di piega tra di essi sono stati tracciati come illustrato nella Figura 3. Durante la differenziazione EB, i contatti tra gli potenziatori e il promotore del gene pluripotenza Pou5f1 sono diminuiti, mentre i contatti potenziatori-promotori del fattore di trascrizione istruttivo di derivazione ndoderm T sono aumentati (Figura 3),fornendo informazioni funzionali su questi potenziatori dello sviluppo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig1.jpg"> Figura 1: Immagini rappresentative di mESC e corpi embrionali derivati. Giorno 0 mESC coltivato in condizioni prive di siero (sinistra) e giorno omogeneo 6 EB (a destra) osservato da un microscopio invertito. Barra di scala : 500 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig2.jpg"> Figura 2: flusso di lavoro 4C e immagini rappresentative dei passaggi principali del protocollo. (A) Flusso di lavoro schematico del quantitativo 4C. RS - sito di restrizione; Stati Uniti - a monte; DS - a valle; UP - primer universale; D - la distanza tra RS e DS dovrebbe idealmente essere 5-15 bp. (B) Esempi di cromatina digerita MboI (I), cromatina ligata in-nuclei (II) e cromatina sonicata (III). I numeri a sinistra indicano le dimensioni del DNA determinate dalla corsa della scala del DNA per ogni campione. (C) Esempi di amplificazione PCR nei due loci: Pou5f1 (primers A e B) e T (primer C e D). (D) Esempi di amplificazione PCR multiplex a Pou5f1 e T loci utilizzando primer A e C. ES - cellule staminali embrionali; EB - corpi embrionali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60960/60960fig3.jpg"> Figura 3: Esempi di profili 4C. Quantitative 4C profili per esche situati sui promotori genici Pou5f1 e T sputati in mESC e Day 6 EBS. Il pannello superiore mostra i grafici dei contatti medi generati da due repliche biologiche indipendenti; il pannello inferiore mostra il cambio di contatto medio degli EB del giorno 6 rispetto ai mESC (media delle due repliche). Le caselle azzurre indicano la posizione degli esaltatori con cambiamenti dinamici durante la differenziazione. Figura adattata da Tian etal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60960/60960fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Per 5mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1M Tris-HCl, pH8.0</td>
			<td>50 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>5M NaCl</td>
			<td>10 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% Igepal CA630</td>
			<td>100 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>50x Roche inibitori completi della proteasi</td>
			<td>100 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua MilliQ</td>
			<td>4,74 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: buffer di lisi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Per 1000 -L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua MilliQ</td>
			<td>869 lL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10X NEB T4 DNA Ligase Buffer</td>
			<td>120 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albumina del siero bovino bovino 20mg/mL</td>
			<td>6 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>2000 U/L T4 DNA Ligase</td>
			<td>5 ll</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Preparazione del mix master di ligazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Per 15</td>
		</tr>
<tr>
<td>5X Buffer di reazione alla ligazione rapida</td>
			<td>10 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adattatore NEBNext</td>
			<td>3 l l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ligase di DNA T4 veloce</td>
			<td>2 ll</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Reazione di legatura dell'adattatore.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Configurazione PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Adattatore ligated library-on-deads</td>
			<td>10 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua di grado PCR</td>
			<td>20,25 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>10M Primer specifico del bersaglio</td>
			<td>3,75 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 - Molle dell'indice NEB</td>
			<td>3,75 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer Herculase II 5X</td>
			<td>10 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 Mm dNTP</td>
			<td>1,25 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ipcolasi II polimerasi</td>
			<td>1 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume totale</td>
			<td>50 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>Programma PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase 1: 98 gradi C - 2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase 2: 98 gradi centigradi - 20</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase 3: 65 gradi centigradi - 30</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase 4: 72 gradi centigradi - 45s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Passo 5: andare al passaggio 2 per fare un totale di 15-18 cicli</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Passo 6: 72 c - 3 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Passo 7: 4 gradi centigradi – tenere premuto</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4: 4C cromatina interazione libreria amplificazione, primo PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Configurazione PCR annidata</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Frammento di DNA dal primo PCR</td>
			<td>10 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acqua di grado PCR</td>
			<td>20,25 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 - M specifico primer Illuminar</td>
			<td>3,75 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 -M P7 Illumina primer</td>
			<td>3,75 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer Herculase II 5X</td>
			<td>10 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 Mm dNTP</td>
			<td>1,25 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ipcolasi II polimerasi</td>
			<td>1 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume totale</td>
			<td>50 ll</td>
		</tr>
<tr>
<td>Programma PCR nidificato</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase 1: 98 gradi C - 2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase 2: 98 gradi centigradi - 20</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase 3: 65 gradi centigradi - 30</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase 4: 72 gradi centigradi - 45s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Passo 5: andare al passaggio 2 per fare un totale di 15-18 cicli</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Passo 6: 72 c - 3 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Passo 7: 4 gradi centigradi – tenere premuto</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 5: amplificazione della libreria di interazione della cromatina 4C, PCR nidificato.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Sequenza (5'-3')</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-Oct4-A</td>
			<td>AATGATACGGCACCACCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTACACGAG CTCTCTCTCTCTCTCTAAAGATAACTAAGCACCAGGCCAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stati Uniti-Ottobre4-A</td>
			<td>TCTCTCTCTAAGATAACTAGCACCAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-Oct4-B</td>
			<td>AATGATACGGCACCACCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTACACGAG CTCTCTCTCTCTGGGGGGGGGGGGGGGGGACCGCT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stati Uniti-Ottobre4-B</td>
			<td>ACCAGGGGGGGGGGGGCAGCAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-T-C</td>
			<td>AATGATACGGCACCACCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTACACGAG CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGCACGCAGCCAAGGAGAGAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>US-T-C</td>
			<td>GATTACACCTGGGTCCGCACATCGCCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>DS-T-D</td>
			<td>AATGATACGGCACCACCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTACACGAG CTCTCTCTCTGGGGCTTGGAGAGGTCAAGAGACCCGGGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>US-T-D</td>
			<td>GCTGAGGCTTTGGAGGCAGCAAGGAGACCACC</td>
		</tr>
<tr>
<td>UP-4C</td>
			<td>CAAGCAGAGaAGAGGCATACGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adap-i1</td>
			<td>CAAGCAGAGAGACGGCATACGAGAGTGGGACTGGGGGGGGGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTCTGAGATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adap-i2</td>
			<td>CAAGCAGAGAAGAGGCATACGAGACATCGGTGAGTTCAGA CGTGTGCTCTCTGAGATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adap-i3</td>
			<td>CAAGCAGAGAAGACGGCATACGAGACTGCAAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTCTGAGATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adap-i4</td>
			<td>CAAGCAGAGAGACGGCATACGAATTGCAGTGACTGGAGTTCAGA CGTGTGCTCTCTGAGATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 6: Primers utilizzati per la preparazione della libreria 4C.

Segnaliamo l'applicazione della cattura della conformazione quantitativa del cromosoma seguita dal sequenziamento ad alto processo in corpi embrionali generati da cellule staminali embrionali. Questa tecnica consente di identificare e quantificare i contatti tra stimolatori e regioni promotrici di un determinato gene durante la differenziazione delle cellule staminali embrionali.

Identificazione dei contatti Enhancer-Promoter nei corpi embrionali mediante Quantitative Chromosoma Conformation Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

La regolazione spatiotemporale precisa dei geni è controllata da diversi elementi cis-regolatori che interagiscono tra loro. Il nostro protocollo consente di interrogare quantitativamente i contatti di cromatina di loci selezionati come i promotori. Questa tecnica ci permette di identificare e quantificare contemporaneamente le frequenze di interazione tra vari elementi normativi.Per generare corpi embrionali, iniziare coltivando cellule staminali embrionali di topo al 60% di confluenza. Quindi rimuovere il mezzo di coltura e lavare due volte con due millilitri di PBS sterilizzato. Rimuovere completamente il PBS e aggiungere due millilitri di supporto di distacco cellulare.Incubare il piatto di coltura a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione per cinque minuti, aggiungere otto millilitri di mezzo di differenziazione EB al piatto. Per dissociare le colonie mESC per ottenere una sospensione a cella singola, pipettare il mezzo su e giù da 15 a 20 volte e trasferire la sospensione in un tubo da 10 millilitri.Centrifugare le cellule a 300 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi rimuovere con cura il supernatante. Dopo aver contato le cellule, rimorsi il pellet cellulare con il mezzo di differenziazione EB.Invertire il coperchio di un piatto di coltura di 15 centimetri. Utilizzando una pipetta multicanale da 200 microliter, depositare gocce da 20 microliter di cellule rimorsi sul coperchio. Invertire attentamente il coperchio e posizionarlo sulla parte inferiore del piatto della coltura.Incubare il piatto con le gocce appese per tre giorni. Per raccogliere le cellule dopo l'incubazione, lavare delicatamente il coperchio con 10 millilitri di PBS. Trasferire il PBS, che conterrà gli EB, in un tubo di plastica da 50 millilitri.Dopo aver lasciato riposare il tubo per 30 minuti a temperatura ambiente, rimuovere con cura il supernatante. Gli EB saranno lasciati nella parte inferiore del tubo. Rimorsi delicatamente gli EB in 10 millilitri di mezzo di differenziazione EB fresco.Trasferire la sospensione in una piastra batteriologica petri di 10 centimetri. Da tre a sei giorni dopo, utilizzare un microscopio invertito per controllare la formazione di EB. Gli OC dovrebbero essere rotondi e omogenei nelle dimensioni.Raccogli gli EB da due o tre piatti da 10 centimetri in un tubo di plastica da 50 millilitri. Centrifugare gli EB a 300 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare gli EB in 10 millilitri di PBS.Centrifugare nuovamente gli EB a 300 volte g a temperatura ambiente, questa volta per tre minuti. Rimuovere il supernatante e aggiungere due millilitri di triptina-EDTA al pellet. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per 15 minuti.Durante l'incubazione, pipettare su e giù ogni tre minuti per ottenere una sospensione a cella singola. Per fermare la reazione della tripsina, aggiungere otto millilitri di mezzo di differenziazione EB. Dopo aver riaspenso le cellule in mezzo EB fresco, aggiungere la paraformaldeide a una concentrazione finale dell'1%Incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente in rotazione.Tempra la formaldeide aggiungendo glicina ad una concentrazione finale di 0,125 molare. Completare il processo di fissazione come descritto nel manoscritto, quindi congelare i pellet cellulari in azoto liquido. Rimescolare delicatamente il pellet cellulare in tampone dilisi ghiacciato appena preparato e posizionare il tubo sul ghiaccio.Dopo 15 minuti, centrifugare le cellule a 1.000 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e lavare il pellet con 500 microlitri di tampone di lisi fredda. Riutilizzare il pellet in un tubo da 1,5 millilitri con 50 microlitri dello 0,5% di SDS in 1x buffer due e posizionare il tubo in un blocco riscaldante a 62 gradi Celsius.Dopo 10 minuti, rimuovere il tubo dal blocco riscaldante e aggiungere il tampone di digestione. Mescolare bene con la pipettazione, evitando un'eccessiva schiuma e incubare il tubo a 37 gradi Celsius. Per garantire un'efficiente restrizione della digestione enzimatica, in questo protocollo, abbiamo incluso un passo ripetitivo di digestione.Ecco perché è anche importante riprotetti bene i nuclei nel tampone di digestione. Aggiungere altri 25 microlitri di tampone di digestione, mescolare invertendo e prendere otto microlitri come controllo non digerito. Conservare il campione di controllo non digerito a -20 gradi Celsius.Successivamente, si aggiungeranno diverse aliquote dell'enzima di restrizione Mbol, incubando a 37 gradi Celsius in rotazione dopo ogni aliquota. Prendi otto microlitri come campione di controllo digerito. Per scollegare entrambi i campioni di controllo, aggiungere 80 microlitri di te buffer in 10 microlitri di proteinasi K.Incubate a 65 gradi Celsius per un'ora.Per controllare l'efficienza della digestione, eseguire aliquote da 20 microliter su un gel dello 0,6%. Le digestione di successo mostrano frammenti per lo più nell'intervallo da 3,0 a 5,0 coppie di kilobase. Preparare il DNA per la tosatura come descritto nel manoscritto.Utilizzare un sonicatore per tagliare il DNA a una dimensione da 150 a 700 coppie di basi. Trasferire il DNA tranciato in un normale nuovo tubo di blocco sicuro, raggruppando più sonicazioni dallo stesso campione. Aggiungere perline di purificazione del DNA riscaldate in una quantità pari a 1,8 volte il volume esistente e mescolare riutilizzando.Dopo cinque minuti di incubazione, raccogliere le perline con un rack magnetico. Tenendo i tubi nel rack magnetico, lavare le perline due volte con un millilitro di 80% di etanolo preparato al momento. Dopo aver asciugato all'aria le perline a temperatura ambiente per due o tre minuti, elutare il DNA rimospensendo le perline in 1x tampone Tris.Utilizzando il metodo della goccia appesa, una popolazione omogenea di EB è stata ottenuta sei giorni dopo l'induzione della differenziazione del CES. L'elettroforesi del gel è stata eseguita in tutto il protocollo per il controllo della qualità. Una digestione efficiente da parte di Mbol si traduce in frammenti di meno di tre coppie di kilobase.L'elettroforesi dopo la legazione ha mostrato che la maggior parte dei frammenti erano più grandi di tre coppie di kilobase. Dopo la sonicazione sono previste dimensioni dei frammenti da 400 a 500 coppie di basi. Dopo la defosforilazione e la legatura dell'adattatore single-end, sono stati eseguiti due cicli di PCR per amplificare gli obiettivi di interesse.Ogni bersaglio è stato amplificato separatamente con due diverse coppie di primer, A e B per il locus Pou5f1 e C e D per il locus T. Ciò ha portato a uno striscio di DNA di circa 400 coppie di basi. In alternativa, la PCR multiplex è stata eseguita per amplificare simultaneamente i bersagli A e C, con conseguente dimensione del frammento simile dopo la purificazione.In questi profili 4C, le scatole azzurre indicano la posizione degli esaltatori con cambiamenti dinamici durante la differenziazione. Le regioni di cromatina contattano i promotori dei geni Pou5f1 e T durante la differenziazione EB. Pou5f1 è stato deregolamentato durante la differenziazione EB.Al contrario, T è stato upregolamentato durante la differenziazione EB. Un'efficiente digestione enzimatica di restrizione e quindi la legazione di prossimità del DNA genomico incrociato sono fattori chiave per garantire il successo di questo protocollo. Un'altra cosa è il progetto del primer per interrogare la mappa dei contatti di ogni luogo.Questa procedura è ideale per interrogare il contatto con la cromatina a loci mirati. Se sono necessari cambiamenti globali, potrebbero essere eseguiti approcci a livello genomico come Hi-C, promoter capture Hi-C o HiChIP.

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