Name: Ecocardia ad ultrasuoni ad alta frequenza per valutare la funzione cardiaca del pesce zebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri l'ecocardiografia ad alta frequenza per valutare la funzione cardiaca in Danio rerio. Questo metodo non invasivo consente la quantificazione accurata dei parametri cardiaci e supporta la ricerca sulle malattie cardiovascolari.

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Ringraziamo il supporto tecnico di Fred Roberts e la revisione del manoscritto.

Tutte le procedure relative al pesce zebra sono state approvate dal nostro Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e sono conformi all'USDA Animal Welfare Act.
1. Configurazione sperimentale
<ol><li>
Impostazione della piattaforma per l'acquisizione di immagini
	<ol>
<li>Utilizzando piccole forbici o un bisturi fare un'incisione su una spugna nella posizione 12 ore per tenere il pesce durante la scansione. Posizionare la spugna in un contenitore di vetro (Figura 2A). NOTA: La posizione dell'incisione dovrebbe consentire spazio sufficiente per spostare il trasduttore e anche per mantenere il pesce sotto la linea d'acqua quando la piattaforma è inclinata per la scansione (Figura 2). L'incisione può variare a seconda delle dimensioni del pesce; tuttavia, per una dimensione e un peso standard, l'incisione dovrebbe essere di circa 2,5 cm x 0,7 cm x 0,5 cm (lunghezza, larghezza e profondità, rispettivamente). Il contenitore di vetro deve essere profondo almeno 6 cm per evitare perdite d'acqua durante l'imaging del pesce.</li>
		<li>Apporre la scatola di vetro contenente la spugna sulla piattaforma ad ultrasuoni, ad esempio utilizzando nastro a due lati. Assicurarsi che la scatola di vetro sia al centro della piattaforma e saldamente attaccata (Figura 2B).</li>
		<li>Inclinare la piattaforma in avanti di circa 30 gradi utilizzando la manopola sul lato sinistro del supporto della piattaforma (Figura 2B). Riempire il quadrato di vetro con 200-250 mL di acqua del sistema ittico contenente 0,2 mg/mL di metanonero (MS222). NOTA: La tricaina può essere preparata come soluzione di stock da 4 mg/mL a Tris 40 mM pH 7 e ulteriormente diluita alla concentrazione desiderata nell'acqua del sistema ittico; 0,2 mg/mL è risultato essere la migliore concentrazione16. La soluzione di 4 mg/mL di brodo di tricaine può essere conservata per un lungo periodo di tempo a -20 gradi centigradi o a 4 gradi centigradi per un mese.</li>
		<li>Inserire il trasduttore all'interno del supporto del micromanipolatore sulla stazione ferroviaria di lavoro, ruotando la tacca del trasduttore verso l'operatore. Mantenere l'array parallelo al terreno con il lato di lavoro longitudinale rispetto allo stage (vedere Figura 2B). Lasciare spazio sufficiente (10 cm su entrambi i lati) affinché il sistema trasduttore-rotaia ora connesso si sposti lungo gli assi x e y.</li>
		<li>Accedere al software di controllo e scegliere Mouse (piccolo) Vascolare. Creare un nuovo studio e una nuova serie per ogni animale incluso nello studio. Trova il nuovo pulsante di studio situato nella parte inferiore sinistra dello schermo nella pagina del browser (la vista inizia in modalità B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Manipolazione del pesce
NOTA: I pesci zebra utilizzati in questo studio erano maschi adulti di 11 mesi del ceppo di tipo selvatico AB/Tuebingen (AB/TU). I pesci zebra sono stati mantenuti in un sistema di acquario di flusso autonomo a 28 gradi centigradi in un ciclo di luce costante impostato come 14 h luce/10 h scuro. Il pesce zebra veniva nutrito due volte al giorno con gamberetti salamoia (Artemia nauplii) e fiocchi di cibo secco.
<ol><li>Utilizzando una rete da pesca, trasferire il pesce in un piccolo serbatoio contenente acqua di sistema con 0,2 mg/mL di tricaine. Attendere che il pesce sia completamente anetizzato (nessun movimento e nessuna risposta al tatto).</li>
	<li>Utilizzando un cucchiaino di plastica, trasferire delicatamente e rapidamente il pesce nella scatola di vetro contenente la spugna nell'incisione precedentemente fatta con il lato ventrale del pesce rivolto verso l'alto. NOTA: Assicurarsi che la testa del pesce sia posizionata verso l'operatore (stessa direzione della tacca del trasduttore) e ad un livello leggermente superiore rispetto al resto del corpo per ottenere una migliore visualizzazione del cuore.</li>
	<li>Abbassare delicatamente il trasduttore (mantenendo la sua posizione originale) utilizzando la maniglia sul sistema ferroviario, posizionandolo longitudinalmente e vicino al lato ventrale del pesce con la tacca del trasduttore rivolto verso l'operatore. Lasciare dal pesce una distanza di 2-3 mm (non più di 1 cm). Regolare la piattaforma rispetto al trasduttore utilizzando il micromanipolatore in tutti e 3 gli assi fino a quando il cuore di pesce viene visualizzato e quindi avviare l'acquisizione dell'immagine. L'angolo del trasduttore non deve essere modificato durante l'acquisizione dell'intera immagine (Figura 2C). NOTA: Finché c'è abbastanza prossimità (fino a 1 cm), l'acqua sopra il pesce fornirà una superficie di contatto tramite tensione superficiale liquida che consente la trasmissione delle onde ultrasoniche tra la sonda e il pesce. Pertanto, non è necessario spingere il trasduttore contro il pesce. Prova a completare questo passaggio e completa la scansione in meno di 3 minuti per prevenire la morte dei pesci o una diminuzione della frequenza cardiaca durante l'acquisizione dell'immagine. Se necessario, utilizzare un timer. Il cuore può essere trovato sul lato superiore dello schermo verso il lato sinistro dell'occhio, che può essere facilmente visualizzato se si sposta l'asse x tutta la strada a destra. Se c'è una continua difficoltà nel trovare il cuore in modalità B, passare alla modalità Doppler di colore, che permetterà di tracciare il flusso sanguigno (il rosso indica che il sangue scorre verso l'operatore) e localizzare il cuore.</li>
</ol>3. Acquisizione di immagini
NOTA: vedere Tabella dei materiali per il sistema di imaging e il software di analisi delle immagini.
<ol><li>Modalità B Vista longitudinale
	<ol>
<li>Dopo aver localizzare il cuore, selezionare o rimanere in modalità B (che si trova nella parte inferiore sinistra del touchscreen dopo aver iniziato una nuova serie) e ridurre il campo al fine di ingrandire e avere uno sguardo più da vicino il cuore per la traccia più facile durante l'analisi.</li>
		<li>Per avere una visione più ravvicinata e chiara del cuore nell'acquisizione di immagini in modalità B, riduci il campo ingrandendo. Utilizzare il touchscreen per restringere manualmente il campo sugli assi x e y.</li>
		<li>Se necessario, migliorare la qualità/contrasto dell'immagine impostando l'intervallo dinamico su 45-50 dB. Vai ai controlli in modalità B nell'opzione Altri controlli e successivamente salva la modifica in Predefiniti modalità. Tocca Predefiniti modalità per selezionare l'impostazione di acquisizione dell'immagine ottimizzata ogni volta che prima di iniziare l'immagine di una nuova serie.</li>
		<li>Scattare tutte le immagini desiderate nel piano dell'asse lungo selezionando Salva immagine. NOTA: informazioni più dettagliate e risorse di formazione sull'acquisizione di immagini sono disponibili presso <a href="https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab" target="_blank">https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab</a> e <a href="https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users" target="_blank">https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users</a>
</li>
	</ol></li>
	<li>Onda d'impulso vista longitudinale
	<ol>
<li>Passare a Doppler colore per il rilevamento del flusso sanguigno (selezionare il pulsante Colore) e l'acquisizione (trovato nella parte inferiore sinistra del touchscreen dopo aver avviato una nuova serie).</li>
		<li>Utilizzando il touch screen posizionare il quadrante sulla parte superiore della valvola atrioventricolare e localizzare l'afflusso, che si distinguerà per il segnale di colore rosso (Figura 3A). Ridurre il più possibile l'area del quadrante per aumentare la frequenza fotogrammi. NOTA: Abbassare la frequenza di ripetizione dell'impulso colore (Colore PRF) (intervallo di velocità) per garantire che il colore giallo possa essere visualizzato nel profilo di velocità dell'immagine Doppler colore. Questo aumenterà la gamma di velocità che possono essere viste e contribuirà a creare un mosaico di colore che permetterà di visualizzare più chiaramente le velocità di picco.</li>
		<li>Attivare la modalità Doppler (selezionare PW)per campionare la velocità dell'afflusso di sangue ventricolare. Posizionare il cancello del volume del campione al centro della valvola atrioventricolare (dove il segnale di colore rosso diventa più giallastro) per rilevare la velocità massima di flusso. Regolare l'angolo PW sullo schermo utilizzando le dita in modo che si allinei con la direzione dell'afflusso di sangue. Premere start o update per iniziare a campionare la velocità del sangue che scorre nel ventricolo. NOTA: Assicurarsi che la linea corretta dell'angolo sia parallela al flusso sanguigno per fornire risultati coerenti e riproducibili. Posizionando la linea corretta dell'angolo in modo che corrisponda alla direzione del flusso sanguigno, le velocità vengano catturate con precisione.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 3.2.3 per determinare la velocità di deflusso posizionando il quadrante Color Doppler alla giunzione tra il ventricolo e il bulbus (valvola bulbuventricolare) e localizzare il flusso, che sarà distinto da un segnale di colore blu (Figura 3B). Posizionare il cancello del volume del campione subito prima della giunzione ventricola-bulbus e regolare la linea di correzione dell'angolo in modo che corrisponda alla direzione del flusso sanguigno. NOTA: Come accennato in precedenza, per ottenere valori di velocità precisi, assicurarsi che l'angolo PW sia allineato con il flusso sanguigno.</li>
		<li>Regolare la linea di base (barra), abbassandola o sollevandola nel pannello della velocità di flusso, al fine di rilevare e tracciare completamente i picchi del segnale (Figura 3C,D). Identificare i picchi di afflusso nel quadrante superiore/positivo (segnale verso la sonda) e i picchi di deflusso nel quadrante inferiore/negativo (segnale che si allontana dalla sonda).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Recupero del pesce
<ol><li>Non appena l'acquisizione dell'immagine è completa, utilizzando un cucchiaino, trasferire il pesce in un sistema regolare aerato acqua libera da tricaina e lasciare che il pesce recuperare (di solito prende 30 s a 2 minuti per riprendere il movimento delle branchie e nuotare).</li>
	<li>Per aiutare il recupero, spruzzare ripetutamente l'acqua sulle branchie utilizzando una pipetta di trasferimento per promuovere l'aerazione del trasferimento di acqua e ossigeno.</li>
</ol>5. Analisi delle immagini
<ol><li>Aprire il software di analisi delle immagini.</li>
	<li>Selezionare un'immagine e fare clic sull'icona di elaborazione dell'immagine (Figura 4). Utilizzando la scala disponibile (Figura 4), regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine per consentire una chiara visualizzazione delle pareti ventricolare o del pattern del flusso sanguigno.</li>
	<li>Utilizzando l'immagine in modalità B, aprire l'elenco a discesa dall'opzione PSLAX (asse lungo parasterna) sul pacchetto/misurazioni cardiache (Figura 4). Selezionare LV traccia e traccia la parete interna ventricolare in sistole e diastolo per ottenere l'area ventricolare (VA) in sistole (VA) e diastole (VAd), volume diastolico finale (EDV) e volume sistolico finale (ESV)(Figura 5A,B). NOTA: i valori del volume vengono estrapolati dalle ritracceture delle immagini 2D e potrebbero discostarsi dall'entità 3D. Per tutte le misurazioni, in media 3 cicli cardiaci rappresentativi per animale.</li>
	<li>Si noti il volume del tratto e la frazione di espulsione che verranno calcolati e visualizzati automaticamente dal software. NOTA: il volume della corsa e la frazione di espulsione possono anche essere calcolati manualmente utilizzando le formule SV - EDV-ESV EF (EDV-ESV)/EDV dove SV è il volume della corsa, l'EDV è il volume diastolico finale, l'ESV è il volume sistolico finale ed EF è la frazione di espulsione</li>
	<li>Calcolare la modifica frazionaria dell'area utilizzando la formula FAC = (VAd - VAs)/ VAd dove FAC è il cambio di area frazionaria, VAd è un'area ventricolare in diastole e i VI sono nell'area ventricolare in sistole.</li>
	<li>Calcolare l'uscita cardiaca utilizzando la formula CO - HR x SV dove CO è uscita cardiaca, HR è frequenza cardiaca e SV è volume di ictus</li>
	<li>Utilizzando l'immagine pulsed Wave Doppler Mode ( Modalità Doppler onda smortizzata), misurare la velocità del sangue del flusso di lavoro selezionando l'opzione Flusso MV sotto il pacchettocardiaco( Figura 4 ). Selezionare e o A rispettivamente per la diastoleinizialee la diastole tardiva e determinare le velocità di picco nel grafico ( Figura 3C).</li>
	<li>Misurare la velocità del sangue in uscita selezionando Flusso AoV e determinare i picchi sul tracciamento (Figura 3D).</li>
	<li>Misurare la frequenza cardiaca utilizzando 2 diverse metodologie per una valutazione più affidabile:<ol>
<li>Quando il cuore viene visualizzato sullo schermo durante l'acquisizione dell'immagine, contare i battiti entro 10 s e moltiplicarlo per 6.</li>
		<li>Utilizzando l'immagine Pulse Wave Doppler sul software Vevo LAB, scegliere il pulsante della frequenza cardiaca e gli intervalli di traccia tra 3 picchi di flusso aortico consecutivi (Figura 4 e Figura 6).</li>
		<li>Per esportare i dati in un foglio di calcolo dopo aver tracciato il LV e i picchi del flusso sanguigno, fare clic su report - esportazione - salva come excel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).</li>
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<li>Lee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Assessment+of+Cardiac+Responses+of+Adult+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+to+Acute+and+Chronic+Temperature+Change+Using+High-Resolution+Echocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography.</a> PLOS ONE. 11 (1), e0145163(2016).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Descriviamo un metodo sistematico per l'imaging ecocardiografico e la valutazione della funzione cardiaca nel pesce zebra adulto. L'ecocardiografia è l'unico metodo disponibile non invasivo e più robusto per l'imaging cardiaco dei pesci adulti vivi e l'analisi funzionale, e sta diventando sempre più popolare nella ricerca cardiovascolare dei pesci zebra. La quantità di tempo necessaria è breve e consente studi ad alto valore di velocità effettiva e longitudinali. Tuttavia, vi è una notevole variazione nella metodologia u...

Il pesce zebra (Danio rerio) è un modello di vertebrato ben consolidato per gli studi sui processi di sviluppo e sulle malattie umane1. I pesci zebra hanno un'elevata somiglianza genetica con l'uomo (70%), la trattatibilità genetica, l'elevata fecondità e la trasparenza ottica durante lo sviluppo embrionale, che consente l'analisi visiva diretta di organi e tessuti, compreso il cuore. Pur avendo un solo atrio e un ventricolo, il cuore di pesce zebra (Figura 1) è fisiologicamente simile ai cuori a quattro camere di mammiferi. È importante sottolineare che la frequenza cardiaca del pesce zebra, la morfologia dell'elettrocardiogramma e la forma potenziale di azione assomigliano a quelle degli esseri umani più delle specie murine2. Queste caratteristiche hanno reso il pesce zebra un ottimo modello per la ricerca cardiovascolare e hanno fornito importanti approfondimenti sullo sviluppo cardiaco3,4, rigenerazione5, e le condizioni patologiche1,3,4, tra cui arteriosclerosi, cardiomiopatie, aritmie, malattie cardiache congenite, e amiloide luce catena cardiotossicità1,4,6. La valutazione della funzione cardiaca è stata possibile durante lo stadio embrionale (1 giorno dopo la fecondazione) attraverso l'analisi video diretta utilizzando la microscopia video ad alta velocità7,8. Tuttavia, i pesci zebra perdono la loro trasparenza oltre lo stadio embrionale, limitando le valutazioni funzionali dei normali cuori maturi e delle condizioni cardiache a esordio tardivo. Per superare questa limitazione, l'ecocardiografia è stata impiegata con successo come un'alternativa ad alta risoluzione, in tempo reale e non invasiva per valutare la funzione cardiaca del pesce zebra adulto9,10,11,12,13,14,15.
Nel pesce zebra, il cuore si trova ventralmente nella cavità toracica immediatamente posteriore alle branchie con l'atrio situato dorsale al ventricolo. L'atrio raccoglie sangue venoso dal venoso sinusae e lo trasferisce al ventricolo dove viene ulteriormente pompato al bulbus arteriosus (Figura 1). Qui, descriviamo un protocollo fisiologico, sott'acqua, per valutare la funzione cardiaca nel pesce zebra adulto mediante ecocardiografia non invasiva utilizzando una sonda a ultrasuoni a matrice lineare con una frequenza centrale di 50 MHz per l'imaging in modalità B con una risoluzione di 30 m. Poiché le onde a ultrasuoni possono facilmente viaggiare attraverso l'acqua, mantenendo la vicinanza tra il pesce e la sonda di scansione sott'acqua fornisce una superficie di contatto sufficiente per il rilevamento del cuore senza bisogno di gel ad ultrasuoni ed è nel complesso meno stressante per il pesce. Anche se i sistemi di ecocardiografia alternativa del pesce zebra sono stati segnalati da diversi autori9,12,13, qui presentiamo l'impostazione generale e più comunemente usata che si applica agli ultrasuoni ad alta frequenza negli animali.
Il metodo consente l'imaging ad alta risoluzione del cuore adulto di pesce zebra, tracciando le strutture cardiache e la quantificazione delle velocità di picco dalle misurazioni del flusso sanguigno di Doppler. Mostriamo una quantificazione affidabile in vivo di importanti parametri sistolici e diastolici, come la frazione di espulsione (EF), il cambiamento dell'area frazionaria (FAC), l'afflusso di sangue ventricolare e le velocità di deflusso, la frequenza cardiaca (HR) e l'uscita cardiaca (CO). Contribuiamo a stabilire una gamma affidabile di normali parametri funzionali e dimensionali cardiaci di pesce zebra adulto sani per consentire una valutazione più precisa degli stati patologici. Nel complesso, forniamo un metodo robusto per valutare la funzione cardiaca nel pesce zebra, che si è dimostrato estremamente utile per stabilire e convalidare i modelli di malattie cardiache del pesce zebra6,16, lesioni cardiache e recupero10,13, e rigenerazione11,12, e può essere ulteriormente utilizzato per valutare potenziali farmaci.

<table><tbody><tr><td>Nastro</td><td></td><td></td><td></td>biadesivo</tr><tr><td>Rete</td><td></td><td></td><td></td>da pesca</tr><tr><td>Contenitore in vetro - 100 pollici di altezza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore ad alta frequenza</td><td>Fujifilm/VisualSonics</td><td>MX700</td><td>Larghezza di banda 29-71 MHz, Trasmissione centrale 50 MHz, Risoluzione assiale 30 & micro; m</td></tr><tr><td>Cucchiaino</td><td></td><td></td><td></td>di plastica</tr><tr><td>Bisturi o forbici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piccoli acquari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spugna (spugna da cucina)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento (graduate 3 mL)</td><td>Samco Scientific</td><td>212</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 3100 Sistema di imaging e stazione di imaging</td><td>Fujifilm/VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo LAB sofware v 1.7.1</td><td>Fujifilm/VisualSonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ecocardia ad ultrasuoni ad alta frequenza per valutare la funzione cardiaca del pesce zebra

High-Frequency Ultrasound Echocardiography to Assess Zebrafish Cardiac Function

Il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un organismo modello molto popolare nella ricerca cardiovascolare, comprese le malattie cardiache umane, in gran parte a causa della sua trasparenza embrionale, della trattatibilità genetica e dell'amenità a studi rapidi e ad alto potenziale di sviluppo. Tuttavia, la perdita di trasparenza limita l'analisi della funzione cardiaca nella fase adulta, il che complica la modellazione delle condizioni cardiache legate all'età. Per superare tali limitazioni, l'ecocardiografia ad ultrasuoni ad alta frequenza nel pesce zebra sta emergendo come opzione praticabile. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per valutare la funzione cardiaca nel pesce zebra adulto mediante ecocardiografia non invasiva utilizzando ultrasuoni ad alta frequenza. Il metodo consente la visualizzazione e l'analisi della dimensione cardiaca del pesce zebra e la quantificazione di importanti parametri funzionali, tra cui la frequenza cardiaca, il volume dell'ictus, l'uscita cardiaca e la frazione di espulsione. In questo metodo, i pesci sono anestesizzati e tenuti sott'acqua e possono essere recuperati dopo la procedura. Sebbene gli ultrasuoni ad alta frequenza siano una tecnologia costosa, la stessa piattaforma di imaging può essere utilizzata per diverse specie (ad esempio, murine e pesci zebra) adattando diversi trasduttori. L'ecocardiografia del pesce zebra è un metodo robusto per la fenotipizzazione cardiaca, utile nella convalida e caratterizzazione dei modelli di malattia, in particolare le malattie ad esordio tardivo; schermi di droga; e studi di lesioni cardiache, recupero e capacità rigenerativa.

Il protocollo descritto consente la misurazione di importanti parametri cardiaci dimensionali e funzionali, analogamente alla tecnica utilizzata nell'ecocardiografia umana e animale. Le immagini In modalità B consentono di tracciare la parete interna ventricolare nella sistole e nella diastole (Figura 5) e di ottenere dati dimensionali, quali le dimensioni di camere e pareti, e dati funzionali, quali frequenza cardiaca, volume dell'ictus e uscita cardiaca, no...

Descriviamo un protocollo per valutare la morfologia cardiaca e la funzione nel pesce zebra adulto utilizzando l'ecocardiografia ad alta frequenza. Il metodo consente la visualizzazione del cuore e la successiva quantificazione dei parametri funzionali, come la frequenza cardiaca (HR), l'uscita cardiaca (CO), il cambiamento dell'area frazionaria (FAC), la frazione di espulsione (EF) e la velocità di afflusso e deflusso del sangue.

Ecocardia ad ultrasuoni ad alta frequenza per valutare la funzione cardiaca del pesce zebra

The zebrafish (Danio rerio) has become a very popular model organism in cardiovascular research, including human cardiac diseases, largely due to its ...

Il protocollo consente la rappresentazione e l'analisi non invasiva e ad alta risoluzione della funzione cardiaca zebrafish adulta. Questo metodo può essere utilizzato per la convalida di modelli di malattie cardiache adulte e potenziali schermi di farmaci. Questa tecnica consente un rapido posizionamento del pesce per un'immagine corretta fornendo risultati accurati e riproducibili.Non è invasivo ed eseguito sott'acqua che consente il rapido recupero del pesce. Per impostare la piattaforma per l'acquisizione di immagini, utilizzare piccole forbici o un bisturi per fare un'incisione su una spugna a ore 12. Posizionare la spugna in un contenitore di vetro.Utilizzando nastro a doppia parte, apporre il contenitore di vetro contenente la spugna sulla piattaforma ad ultrasuoni. Assicurarsi che il contenitore di vetro sia al centro della piattaforma e saldamente attaccato. Inclinare la piattaforma in avanti di circa 30 gradi utilizzando la manopola sul lato sinistro del supporto della piattaforma.Riempire il contenitore di vetro con circa 200 millilitri di acqua del sistema ittico contenente 0,2 milligrammi per millilitro tricaina metanosolfonato. Inserire il trasduttore all'interno del supporto del micromanipolatore sulla stazione ferroviaria di lavoro ruotando la tacca del trasduttore verso l'operatore. Mantenere l'array parallelo al terreno con il lato di lavoro longitudinale rispetto allo stage.Lasciare spazio sufficiente a circa 10 centimetri su entrambi i lati per il sistema ferroviario del trasduttore ora collegato per muoversi lungo gli assi x e y. Accedere al software di controllo e scegliere il mouse piccolo vascolare. Crea un nuovo studio e una nuova serie per ogni animale indotto nello studio.Premere il nuovo pulsante di studio situato nella parte inferiore sinistra dello schermo nella pagina del browser. La vista inizia in modalità B. Utilizzando una rete di pesce, trasferire il pesce in un piccolo serbatoio contenente acqua di sistema con 0,2 milligrammi per millilitro di tricaina.Attendere che il pesce sia completamente anestetizzato senza movimento o nessuna risposta al tatto. Trasferire delicatamente e rapidamente il pesce nel contenitore di vetro con la spugna nell'incisione precedentemente fatta con il lato ventrale del pesce rivolto verso l'alto. Abbassare delicatamente il trasduttore utilizzando la maniglia sul sistema ferroviario posizionandolo longitudinalmente e chiudere il lato ventrale del pesce con la tacca del trasduttore rivolto verso l'operatore.Lasciare da due a tre millimetri di sdoganamento dal pesce. Regolare la piattaforma rispetto al trasduttore utilizzando il micromanipolatore in tutti e tre gli assi fino a visualizzare il cuore del pesce. Subito dopo aver localizzare il cuore, seleziona o rimani in modalità B e riduci il campo ingrandindo per ottenere uno sguardo più da vicino al cuore.Se necessario, migliorare la qualità o il contrasto dell'immagine impostando l'intervallo dinamico su 45-50 decibel. Passare ai controlli in modalità B nell'opzione più controlli e successivamente salvare la modifica in modalità preimpostazioni. Toccare i predefiniti della modalità per selezionare l'impostazione di acquisizione dell'immagine ottimizzata ogni volta prima di iniziare a creare un'immagine di una nuova serie.Prendi tutte le immagini desiderate nel piano dell'asse lungo. Quindi, passa al doppler a colori per il rilevamento e l'acquisizione del flusso sanguigno. Utilizzando il touchscreen, posizionare il quadrante sopra la valvola atrioventricolare e localizzare l'afflusso che si distingue per il segnale di colore rosso.Ridurre il più possibile l'area del quadrante per aumentare la frequenza fotogrammi. Attivate la mossa Doppler dell'onda d'impulso per campionare la velocità di afflusso del sangue ventricolare. Posizionare il cancello del volume del campione al centro della valvola atrioventricolare per rilevare la velocità massima del flusso.Il segnale di colore rosso diventa più giallastro. Regolare l'angolo dell'onda d'impulso sullo schermo utilizzando le dita in modo che si allinei alla direzione dell'afflusso di sangue. Premere start o update per iniziare a campioare la velocità del sangue che scorre nel ventricolo.Determinare la velocità di deflusso posizionando il quadrante Doppler a colori alla giunzione tra il ventricolo e il bulbo e localizzare il flusso. Questo si distingue per un segnale di colore blu. Posizionare il cancello del volume del campione proprio prima della giunzione del ventricolo bulbo e regolare la linea di correzione dell'angolo in modo che corrisponda alla direzione del flusso sanguigno.Regolare la linea di base sollevarla nel pannello della velocità del flusso per rilevare e tracciare completamente i picchi del segnale. Non appena l'acquisizione dell'immagine è completa, utilizzare un cucchiaino e trasferire il pesce in acqua aerata regolare priva di tricaina e lasciare che il pesce si riprenda. Per aiutare il recupero, spruzzare ripetutamente acqua sulle branchie utilizzando una pipetta di trasferimento per promuovere l'aerazione dell'acqua e il trasferimento di ossigeno.Di solito ci vogliono da 30 secondi a due minuti per riprendere il movimento delle branchie e il nuoto. Aprire il software di analisi delle immagini. Selezionare un'immagine e fare clic sull'icona di elaborazione delle immagini.Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine per consentire una visualizzazione chiara delle pareti ventricolari o del modello di flusso sanguigno. Utilizzando l'immagine in modalità B, aprite l'elenco a discesa dall'opzione dell'asse lungo parasternale sulle misurazioni del pacchetto cardiaco. Selezionate traccia LV e tracciate la parete interna ventricolare a systole e diastole per ottenere l'area ventricolare in volume sistole e diastolico e diastolico e volume sistolico finale.In questo studio, le immagini in modalità B hanno permesso di tracciare la parete interna ventricolare in sistole e diastole e ottenere dati dimensionali come le dimensioni della camera e della parete. Sono stati ottenuti anche dati funzionali come frequenza cardiaca, volume dell'ictus e uscita cardiaca, nonché parametri della funzione sistolica ventricolare, incluso il cambio di area frazionata e la frazione di espulsione. Le misurazioni a livello della valvola atrioventricolare utilizzando immagini in modalità Doppler a colori fornivano anche velocità di afflusso ventricolare e sangue in deflusso.Sulla base dell'immagine Doppler dell'onda d'impulso, è stato generato un valore di frequenza cardiaca tracciando tre picchi di flusso aortici consecutivi. La cosa più importante è posizionare correttamente la piattaforma ad ultrasuoni e il pesce per un'imaging accurata e ridurre al minimo l'esposizione del pesce alla tricaina. Ulteriori metodi per supportare questa procedura includono l'elettrocardiogramma del pesce per il rilevamento rapido della disfunzione cardiaca come aritmie o metodi istologico per valutare la struttura del tessuto cardiaco o la morte cellulare.Queste tecniche consentono la valutazione della funzione cardiaca del pesce zebra e stabiliscono un fenotipo cardiaco nei modelli di malattie cardiache dei pesci zebra. Consente inoltre di testare nuovi farmaci, studiare le lesioni cardiache e la capacità rigenerativa. La tricaina MS-222 è irritante per la pelle, gli occhi e le vie respiratorie.Quando si prepara la soluzione di tricaina, i dispositivi di protezione devono includere una maschera antipolvere, uno scudo per gli occhi e guanti.

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Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare lo sviluppo di cuori in zebrafish in 4 dimensioni (4D). Imaging 4D, tramite microscopia di fluorescenza di luce-foglio (LSFM), prende 3-dimensionale (3D) immagini nel corso del tempo, di ricostruire i cuori in via di sviluppo. Indichiamo qualitativamente e quantitativamente che lo shear stress attiva endocardial tacca di segnalazione durante lo sviluppo di camera, che promuove trabeculation cardiaco.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

Qui, presentiamo un metodo affidabile, minimamente invasivo e conveniente per registrare e interpretare gli elettrocardiogrammi nel pesce zebra adulto anestesizzato vivo.

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Descriviamo strumenti ottimizzati per studiare il cuore di zebrafish in vivo con microscopia a fluorescenza a foglio leggero. In particolare, suggeriamo linee transgeniche cardiache luminose e presentiamo nuove delicate tecniche di incorporamento e immobilizzazione che evitano difetti dello sviluppo e cardiaci. Viene inoltre fornita una possibile pipeline di acquisizione e analisi dei dati adattata all'imaging cardiaco.

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Ecocardia ad ultrasuoni ad alta frequenza per valutare la funzione cardiaca del pesce zebra

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