In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly nella C. elegans Germline utilizzando Proximity Ligation Assay

Il test di ligation di prossimità consente agli utenti di rilevare interazioni proteina-proteina in situ, rivelando modelli spaziali e temporali delle interazioni. Questa tecnica può aiutare a rispondere a importanti domande sulla regolazione dello sviluppo di C.elegans. Questa tecnica offre una sensibilità comparabile per il rilevamento delle interazioni proteina-proteina senza la complessità di altre tecniche, come FRET e BiFC.

Gli individui che non hanno mai sezionato vermi per rilasciare le gonadi possono avere difficoltà con questo passaggio. Esercitati a sezionare i vermi e usale per l'immunofluorescenza per perfezionare le tecniche di manipolazione e dissezione prima di passare al PLA. Per iniziare, scegli da 30 a 40 vermi giovani adulti in un piatto di vetro da orologio contenente 500 microlitri di 1x M9 e levamisolo.

Dopo aver raccolto i vermi, rimuovere e scartare con cura la maggior parte dei mezzi per rimuovere i batteri che vengono trasferiti insieme ai vermi. Aggiungere 500 microlitri freschi di 1x M9 e levamisolo e utilizzare la pipetta per disegnare e erogare delicatamente il supporto per risciacquare i vermi. Rimuovere e scartare con cura la maggior parte dei supporti.

Ripetere il lavaggio da due a tre volte. Dopo i lavaggi, lasciare i vermi in circa 100 microlitri di supporto per non più di otto minuti. Utilizzando una pipetta in vetro o polietilene, trasferire i vermi in uno scivolo al microscopio da 25 millimetri per 75 millimetri rivestito con poli-L-lisina allo 001%.

Rimuovere il supporto in eccesso in modo che circa 15 microlitri di supporti rimangano sulla diapositiva. La rimozione del buffer in eccesso è fondamentale per garantire che i worm e le gonadi sezionati aderiscano alla diapositiva. Al microscopio sezionato, con due aghi calibro 26 1/2, posizionare un ago sopra l'altro in modo che le estremità forno un paio di forbici.

Usando gli aghi orientati in questo modo, tagliare i vermi dietro la faringe per rilasciare le linee germinali. Sezionare tutti i vermi entro cinque minuti. Dopo che tutti i vermi sono stati sezionati, posizionare delicatamente un coverslip di 22 millimetri per 40 millimetri sul vetrino in modo che sia perpendicolare allo scivolo.

Le estremità del coperchio devono bloccarsi dalla diapositiva. Congelare gli scivoli su un blocco di alluminio pre-refrigerato mantenuto sul ghiaccio secco per almeno 20 minuti. Posizionare delicatamente una matita refrigerata sopra la coverlip per evitare che il coverslip si allente a causa dell'espansione del ghiaccio.

Quando sei pronto per la fissazione, scorri le copertine con una matita e immergere immediatamente la diapositiva in un barattolo contenente metanolo fresco e ghiacciato per un minuto. Quindi pulire delicatamente i bordi dello scivolo che circonda il campione e applicare 150 microlitri di formaldeide fissiva a temperatura ambiente da fissare per cinque minuti. Toccare la diapositiva su un tovagliolo di carta con un angolo perpendicolare di 90 gradi per lasciare che il fissatore scorra dal vetrino e assorba nel tovagliolo della carta.

Bloccare le diapositive due volte per 15 minuti a temperatura ambiente in un barattolo coplin con 50 millilitri di PBT/BSA. Quindi bloccare le diapositive con una soluzione PBT/BSA contenente il 10% di siero di capra normale. Pulire delicatamente i bordi che circondano lo scivolo e applicare 100 microlitri della soluzione su ogni diapositiva.

E agitare delicatamente la diapositiva per aiutare a diffondere la soluzione. Incubare per un'ora a temperatura ambiente in una camera umida. Posizionare la diapositiva su un tovagliolo di carta per lasciare che la soluzione scorazzi dalla diapositiva e pulire delicatamente i bordi.

Per bloccare le diapositive, applicare una goccia del reagente di blocco allo spazio di 14 millimetri per 14 millimetri. Incubare gli scivoli per un'ora a 37 gradi Celsius in una camera umida. Posizionare le diapositive su un tovagliolo di carta per lasciare che il reagente bloccante scorra dalla diapositiva e pulire delicatamente i bordi.

Utilizzare il diluente anticorpale per diluire gli anticorpi primari. Applicare 40 microlitri della soluzione di anticorpi primari diluiti per uno spazio di 14 per 14 millimetri sulle diapositive. Posizionare gli scivoli in una camera umida e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius.

Al mattino, lavare gli scivoli due volte per cinque minuti, ciascuno con 50 millilitri di 1x tampone di lavaggio A a temperatura ambiente in un barattolo coplin. Impostare il barattolo Coplin su uno shaker orbitale impostato su 60 giri/min. Posizionare le diapositive su un tovagliolo di carta per lasciare che il tampone di lavaggio scoraggi fuori dalla diapositiva e pulire delicatamente i bordi.

Preparare una soluzione da 40 microliter contenente sonde più e meno. Aggiungere la soluzione a ogni spazio di 14 per 14 millimetri. Incubare gli scivoli in una camera umida per un'ora a 37 gradi Celsius.

Lavare gli scivoli due volte per cinque minuti ciascuno con 50 millilitri di 1x tampone di lavaggio A a temperatura ambiente in un barattolo coplin. Impostare il barattolo Coplin su uno shaker orbitale impostato su 60 giri/min. Diluire il tampone di legatura da uno a cinque con acqua ultrapura.

Utilizzare questo buffer per diluire la ligasi da uno a 40 per preparare uno stock di lavoro di soluzione di legatura. Posizionare lo scivolo su un tovagliolo di carta per lasciare che il tampone di lavaggio scoraggi i lati e pulire delicatamente i bordi. Aggiungere 40 microlitri della soluzione di legatura a ogni spazio di 14 per 14 millimetri.

Incubare gli scivoli in una camera umida per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver lavato e asciugato le diapositive come descritto in precedenza, aggiungere 40 microlitri di soluzione di amplificazione appena preparata, protetti dalla luce, ad ogni spazio di 14 per 14 millimetri. Incubare gli scivoli nella camera umida e buia per un'ora e 40 minuti a 37 gradi Celsius.

Lavare gli scivoli due volte per 10 minuti ciascuno con 50 millilitri di 1x tampone di lavaggio B e lavare gli scivoli una volta per un minuto con 50 millilitri di tampone di lavaggio 01x B.Dopo aver asciugato il perimetro rivestito in epossidico dello scivolo, aggiungere 10 microlitri di supporto medio a ciascun campione e posare delicatamente un copripazzo sulla parte superiore, consentendo al mezzo di montaggio di diffondersi. Dipingi intorno al bordo del coverslip con smalto per unghie per sigillare il coverslip e lo scivolo. Evitare di spostare il coverslip.

Lasciare indurire lo smalto per almeno 20 minuti a temperatura ambiente, protetto dalla luce. La co-immunosomozione delle linee germinali con gli anticorpi FLAG e GFP ha rivelato il loro modello di espressione nella linea germinale. Mentre la GFP era espressa in tutta la linea germinale, l'espressione OMA-1:GFP era limitata al pachytene tardivo e agli ovociti.

L'immunostaining FLAG mostra che 3xFLAG:DLC-1 è stato espresso in tutta la linea germinale in entrambi i ceppi. La regione di interesse per la quantificazione del PLA nella linea germinale comprendeva il pachytene tardivo attraverso gli ovociti in tutte le linee germinali. Questa è l'area dell'espressione OMA-1.

3xFLAG:DLC-1, le gerline OMA-1:GFP sembravano avere una maggiore quantità di fuochi PLA all'interno di questa regione rispetto alle germline 3xFLAG:DLC-1, GFP. Assicurarsi che ci sia abbastanza acqua per aumentare l'umidità nella camera. Inoltre, assicurarsi che le diapositive siano livellate all'interno della camera per evitare il deflusso dei reagenti.

Seguendo il saggio di legatura di prossimità, le gonadi estruse possono essere immagini su un microscopio confocale e quantificate utilizzando Fiji, flusso di lavoro ImageJ. Questa quantificazione può aiutare a determinare se l'interazione è statisticamente significativa. Il PLA ci ha permesso di valutare le interazioni in situ tra i regolatori critici dello sviluppo della linea germinale del nematode.