Name: Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per lesplorazione rapida e lanalisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Scopri un flusso di lavoro user-friendly per l'analisi automatica dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza. Utilizza il software open-source Icy per segmentare e quantificare segnali multipli in migliaia di cellule.

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G.H. è stato sostenuto da una borsa di studio della Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. è stata sostenuta da una borsa di studio universitaria dell'Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), mentre Q.T. è stata sostenuta da una sovvenzione pubblica supervisionata dall'Agenzia nazionale francese di ricerca (ANR) come parte del secondo programma "Investissements d'Avenir" FIGHT-HF (riferimento: ANR-15-RHU4570004). Questo lavoro è stato finanziato dal CNRS e dall'Università di Lorraine (UMR 7365).

<ol><li>Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolved+fluorescence+microscopy%3A+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig%2C+Stefan+Hell%2C+and+William+E.+Moerner%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li>
<li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imagining+the+future+of+bioimage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li>
<li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icy%3A+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li>
<li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+image+analysis+using+NIH+Image%2FImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47(2004).</li>
<li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+on+image+segmentation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Procedia+Computer+Science%22%5BJournal%5D)">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li>
<li>Molecular Devices. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018).</li>
<li>Nikon. NIS-Elements Imaging Software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014).</li>
<li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Communication+and+Image+Representation%22%5BJournal%5D)">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li>
<li>D'Autréaux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+as+signalling+molecules%3A+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li>
<li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS%2C+Cell+Senescence%2C+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127(2016).</li>
<li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li>
<li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2%CE%B2+%28SFRS10%29+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li>
<li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390(2016).</li>
<li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spliceosome+Structure+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707(2011).</li>
<li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100(2006).</li>
<li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+3.0%3A+Next-generation+image+processing+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un numero crescente di strumenti software liberi è disponibile per l'analisi delle immagini delle cellule a fluorescenza. Gli utenti devono scegliere correttamente il software adeguato in base alla complessità del loro problema, alle loro conoscenze nell'elaborazione delle immagini e al tempo che vogliono trascorrere nella loro analisi. Icy, CellProfiler o ImageJ/Fiji sono potenti strumenti che combinano sia l'usabilità che la funzionalità3. Icy è uno strumento autonomo che presenta una chiara int...

La microscopia leggera e, più in particolare, la microscopia a fluorescenza sono tecniche robuste e versatili comunemente utilizzate nelle scienze biologiche. Danno accesso alla localizzazione precisa di varie biomolecole come proteine o RNA attraverso la loro specifica etichettatura fluorescente. L'ultimo decennio è stato caratterizzato da rapidi progressi nelle tecnologie di microscopia e imaging, come dimostra il Premio Nobel 2014 per la chimica che ha assegnato Eric Betzig, Stefan W. Hell e William E. Moerner per lo sviluppo della microscopia a fluorescenza super risolta (SRFM)1. SFRM bypassa il limite di diffrazione della microscopia ottica tradizionale per portarla nella nanodimensione. Il miglioramento di tecniche come l'imaging live o gli approcci di screening ad alta velocità effettiva aumenta anche la quantità e la complessità dei dati da trattare per ogni esperimento. La maggior parte del tempo, i ricercatori si trovano di fronte ad alte popolazioni eterogenee di cellule e vogliono analizzare i fenotipi a livello di singola cellula.
Inizialmente, analisi come il conteggio dei foci sono state eseguite a occhio, che è preferito da alcuni ricercatori in quanto fornisce il pieno controllo visivo sul processo di conteggio. Tuttavia, l'analisi manuale di tali dati richiede troppo tempo, porta a variabilità tra gli osservatori e non consente l'accesso a funzionalità più complesse in modo che gli approcci assistiti da computer stiano diventando ampiamente utilizzati e quasi inevitabili2. I metodi di bioimmagine informatica aumentano notevolmente l'efficienza dell'analisi dei dati e sono liberi dall'inevitabile soggettività dell'operatore e dalla potenziale distorsione dell'analisi di conteggio manuale. L'aumento della domanda in questo campo e il miglioramento della potenza informatica hanno portato allo sviluppo di un gran numero di piattaforme di analisi delle immagini. Alcuni di loro sono liberamente disponibili e danno accesso a vari strumenti per eseguire analisi con personal computer. Una classificazione degli strumenti ad accesso aperto è stata recentemente stabilita3 e presenta Icy4 come un potente software che combina usabilità e funzionalità. Inoltre, Icy ha il vantaggio di comunicare con ImageJ.
Per gli utenti senza esperienza nell'analisi delle immagini, gli ostacoli principali sono scegliere lo strumento appropriato in base ai parametri problematici e sintonizzati correttamente che spesso non sono ben compresi. Inoltre, i tempi di installazione sono spesso lunghi. Icy propone un'interfaccia user-and-click denominata "Protocols" per sviluppare il flusso di lavoro combinando alcuni plugin che si trovano all'interno di una raccolta esaustiva4. Il design modulare flessibile e l'interfaccia point-and-click rendono possibile l'impostazione di un'analisi per i non programmatori. Qui presentiamo un flusso di lavoro chiamato Substructure Analyzer, sviluppato nell'interfaccia di Icy, la cui funzione è quella di analizzare i segnali fluorescenti in specifici compartimenti cellulari e misurare diverse caratteristiche come luminosità, numero foci, dimensione del foci e distribuzione spaziale. Questo flusso di lavoro affronta diversi problemi come la quantificazione della traslocazione del segnale, l'analisi delle cellule trasfette che esprimono un reporter fluorescente o l'analisi dei foci da diverse sottostrutture cellulari nelle singole cellule. Consente l'elaborazione simultanea di più immagini e i risultati di output vengono esportati in un foglio di lavoro delimitato da tabulazioni che può essere aperto in programmi di fogli di calcolo di uso comune.
La pipeline dell'analizzatore di sottostruttura è illustrata nella Figura 1. In primo luogo, tutte le immagini contenute in una cartella specificata vengono pre-elaborate per migliorare il loro rapporto segnale-rumore. Questo passaggio aumenta l'efficienza dei passaggi seguenti e riduce il tempo di esecuzione. Quindi, le regioni di interesse (ROI), corrispondenti alle aree dell'immagine in cui il segnale fluorescente deve essere rilevato, vengono identificate e segmentate. Infine, il segnale fluorescente viene analizzato e i risultati vengono esportati in un foglio di lavoro delimitato da tabulazioni.
La segmentazione degli oggetti (rilevamento dei confini) è il passo più impegnativo nell'analisi delle immagini e la sua efficienza determina l'accuratezza delle misurazioni delle celle risultanti. I primi oggetti identificati in un'immagine (chiamati oggetti primari) sono spesso nuclei da immagini macchiate di DNA (colorazione DAPI o Hoechst), anche se gli oggetti primari possono anche essere cellule intere, perline, macchie, tumori o qualsiasi altro oggetto macchiato. Nella maggior parte delle immagini biologiche, cellule o nuclei si toccano o si sovrappongono causando il fallimento degli algoritmi semplici e veloci. Ad oggi, nessun algoritmo universale può eseguire una segmentazione perfetta di tutti gli oggetti, soprattutto perché le loro caratteristiche (dimensioni, forma o trama) modulano l'efficienza della segmentazione5. Gli strumenti di segmentazione comunemente distribuiti con il software di microscopia (come il MetaMorph Imaging Software di Molecular Devices6o il software NIS-Elements Advances Research di Nikon7) sono generalmente basati su tecniche standard come la corrispondenza di correlazione, la soglia o le operazioni morfologiche. Sebbene efficienti nei sistemi di base, questi metodi sovrageneralizzati presentano rapidamente limitazioni se utilizzati in contesti più impegnativi e specifici. In effetti, la segmentazione è altamente sensibile ai parametri sperimentali come il tipo di cellula, la densità delle cellule o i biomarcatori e spesso richiede una regolazione ripetuta per un set di dati di grandi dimensioni. Il flusso di lavoro Substructure Analyzer integra algoritmi semplici e più sofisticati per proporre diverse alternative adattate alla complessità dell'immagine e alle esigenze degli utenti. Propone in particolare l'algoritmo del bacino idrografico basato su marcatori8 per gli oggetti altamente raggruppati. L'efficienza di questo metodo di segmentazione si basa sulla selezione di singoli marcatori su ogni oggetto. Questi marcatori vengono scelti manualmente la maggior parte del tempo per ottenere i parametri corretti per la segmentazione completa, che richiede molto tempo quando gli utenti devono affrontare un numero elevato di oggetti. Substructure Analyzer propone un rilevamento automatico di questi marcatori, fornendo un processo di segmentazione altamente efficiente. La segmentazione è, nella maggior parte dei tempi, la fase limitante dell'analisi dell'immagine e può modificare notevolmente il tempo di elaborazione a seconda della risoluzione dell'immagine, del numero di oggetti per immagine e del livello di clustering degli oggetti. Le pipeline tipiche richiedono da pochi secondi a 5 minuti per immagine in un computer desktop standard. L'analisi di immagini più complesse può richiedere un computer più potente e alcune conoscenze di base nell'analisi delle immagini.
La flessibilità e la funzionalità di questo flusso di lavoro sono illustrate con vari esempi nei risultati rappresentativi. I vantaggi di questo flusso di lavoro sono mostrati in particolare attraverso lo studio di sottostrutture nucleari in condizioni di stress ossidativo (OS). OS corrisponde a uno squilibrio dell'omeostasi redox a favore di ossidanti ed è associato ad alti livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Poiché il ROS agisce come molecole di segnalazione, i cambiamenti nella loro concentrazione e localizzazione subcellulare influenzano positivamente o negativamente una miriade di percorsi e reti che regolano le funzioni fisiologiche, tra cui la trasduzione del segnale, i meccanismi di riparazione, l'espressione genica, la morte cellulare e la proliferazione9,10. OS è quindi direttamente coinvolto in varie patologie (malattie neurodegenerative e cardiovascolari, tumori, diabete, ecc),), ma anche l'invecchiamento cellulare. Pertanto, decifrare le conseguenze del sistema operativo sull'organizzazione e la funzione della cellula umana costituisce un passo cruciale nella comprensione dei ruoli del sistema operativo nell'insorgenza e nello sviluppo delle patologie umane. È stato stabilito che l'OS regola l'espressione genica modulando la trascrizione attraverso diversi fattori di trascrizione (p53, Nrf2, FOXO3A)11, ma anche influenzando la regolazione di diversi processi co- e post-trascrizione come lo splicing alternativo (AS) dei pre-RNA12,13,14. Lo splicing alternativo delle trascrizioni primarie e non codificanti è un meccanismo essenziale che aumenta la capacità di codifica dei genomi producendo isoforme di trascrizione. AS è eseguita da un enorme complesso di ribonucleoproteina chiamato spliceosome, contenente quasi 300 proteine e 5 RNA nucleari piccoli ricchi di U (UsnRNA)15. L'assemblaggio spliceo e l'AS sono strettamente controllati nelle cellule e alcuni passi della maturazione sillimitata si verificano all'interno di compartimenti nucleari senza membrana chiamati Cajal Bodies. Queste sottostrutture nucleari sono caratterizzate dalla natura dinamica della loro struttura e dalla loro composizione, che sono principalmente condotte da interazioni multivalenti del loro RNA e componenti proteici con la proteina della coilina. L'analisi di migliaia di celle con il flusso di lavoro Substructure Analyzer ha consentito la caratterizzazione degli effetti mai descritti del sistema operativo sui corpi di Cajal. Infatti, i dati ottenuti suggeriscono che l'OS modifica la nucleazione dei corpi di Cajal, inducendo una ridistribuzione nucleoplasmica della proteina coilina in numerosi focolai nucleari più piccoli. Tale cambiamento della struttura dei corpi cajal potrebbe influenzare la maturazione dello spliceo some e partecipare alla modulazione AS da OS.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di formaldeide al 16% (p/v) senza metanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>per fissare le cellule</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 di capra anti-coniglio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>anticorpo secondario fluorescente</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 di capra anti-topo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21425</td><td>anticorpo secondario fluorescente</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Falloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A34055</td><td>anticorpo secondario fluorescente</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina standard (BSA)</td><td>euromedex</td><td>04-100-812-E</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Terreno di coltura cellulare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796-500ml</td></tr><tr><td>Terreno di montaggio in situ Duolink con terreno</td><td>di montaggio</td>DAPI <td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040-5ML</td></tr><tr><td>Umano: cellule HeLa S3</td><td>IGBMC, Strasburgo, Francia</td><td></td><td>linea cellulare utilizzata per eseguire gli esperimenti</td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno 30% (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ml</td><td>utilizzato come agente stressante</td></tr><tr><td>Reagente Lipofectamine 2000 Reagente</td> di <td>trasfezione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-coilin</td><td>abcam abcam</td><td>ab11822</td><td>Anticorpo specifico per coilin</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza Nikon Optiphot-2</td><td>Microscopio per epifluoresecenza</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Terreno a siero ridotto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Terreno di trasfezione</td></tr><tr><td>31985062 PBS pH 7.4 (10x)</td><td>gibco</td><td>70011-036</td><td>per lavare le cellule</td></tr><tr><td>Coniglio policlonale anti-53BP1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA1-16565</td><td>53BP1-specifico anticorpo</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale di coniglio anti-EDC4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4200114</td><td>EDC4-specifico</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683</td><td>per permeabilizzare le cellule</td></tr></tbody></table>

substructure analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

L'ultimo decennio è stato caratterizzato da scoperte nelle tecniche di microscopia a fluorescenza illustrate dal miglioramento della risoluzione spaziale, ma anche nell'imaging a cellule vive e nelle tecniche di microscopia ad alto consumo. Ciò ha portato ad un costante aumento della quantità e della complessità dei dati di microscopia per un singolo esperimento. Poiché l'analisi manuale dei dati di microscopia richiede molto tempo, soggettiva e proibisce l'analisi quantitativa, l'automazione dell'analisi delle immagini biologiche sta diventando quasi inevitabile. Abbiamo costruito un flusso di lavoro informatico chiamato Substructure Analyzer per automatizzare completamente l'analisi del segnale in bioimmagini dalla microscopia fluorescente. Questo flusso di lavoro è sviluppato sulla piattaforma open source user-friendly Icy ed è completato da funzionalità da ImageJ. Esso comprende la pre-elaborazione delle immagini per migliorare il rapporto segnale-rumore, la segmentazione individuale delle cellule (rilevamento dei confini cellulari) e la rilevazione/quantificazione dei corpi cellulari arricchiti in specifici compartimenti cellulari. Il vantaggio principale di questo flusso di lavoro è quello di proporre complesse funzionalità di bio-imaging agli utenti senza esperienza di analisi delle immagini attraverso un'interfaccia user-friendly. Inoltre, è altamente modulare e adattato a diverse questioni, dalla caratterizzazione della traslocazione nucleare/citoplasmatica all'analisi comparativa di diversi corpi cellulari in diverse sottostrutture cellulari. La funzionalità di questo flusso di lavoro è illustrata attraverso lo studio dei corpi Cajal (coiled) in condizioni di sollecitazione ossidativa (OS). I dati della microscopia a fluorescenza mostrano che la loro integrità nelle cellule umane è influenzata poche ore dopo l'induzione del sistema operativo. Questo effetto è caratterizzato da una diminuzione della nucleazione della bobina nei corpi cajal caratteristici, associata a una ridistribuzione nucleoplasmica della bobina in un numero maggiore di focolai più piccoli. Il ruolo centrale della bobina nello scambio tra i componenti CB e il nucleoplasmo circostante suggerisce che la ridistribuzione della bobina indotta dall'OS potrebbe influenzare la composizione e la funzionalità dei corpi cajal.

Tutte le analisi descritte sono state eseguite su un computer portatile standard (processore quad-core a 64 bit a 2,80 GHz con 16 GB di memoria ad accesso casuale (RAM)) che funziona con la versione a 64 bit di Java. La memoria ad accesso casuale è un parametro importante da considerare, a seconda della quantità e della risoluzione delle immagini da analizzare. L'utilizzo della versione a 32 bit di Java limita la memoria a circa 1300 MB, il che potrebbe non essere adatto per l'analisi dei Big Data, mentre la versione a 6...

Vi presentiamo un flusso di lavoro liberamente disponibile costruito per una rapida esplorazione e analisi accurata dei corpi cellulari in specifici compartimenti cellulari in immagini di microscopia a fluorescenza. Questo flusso di lavoro user-friendly è progettato sul software open-source E utilizza anche funzionalità ImageJ. La pipeline è conveniente senza conoscere l'analisi delle immagini.

Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Substructure analyzer è un flusso di lavoro intuitivo che esegue l'analisi automatica di più metriche di microscopia di processo. Non significa zero tonnellate di software open source Icy e anche utilizzando le funzionalità della macchina. È importante sottolineare che questo flusso di lavoro è conveniente resort produrre conoscenza e analisi delle immagini.Le immagini multicanale vengono caricate all'interno del flusso di lavoro e pre-elaborate al fine di migliorare il rapporto segnale/rumore e rimuovere immagini o difetti. Quindi, la segmentazione dell'immagine isola le aree di interesse, note anche come ROM dallo sfondo. Sono disponibili diversi metodi di segmentazione a seconda del livello di clustering e della natura degli oggetti di interesse.Gli oggetti segmentati vengono salvati con un descrittore specifico in una cartella specifica. La forza e i segnali vengono quindi analizzati all'interno delle righe e più feature come posizione, dimensioni, forma nelle trame di densità, ma il numero e le dimensioni vengono esportati in un foglio di calcolo creato automaticamente. Scarica Icy dal sito icy.Quindi scaricare Substructure Analyzer Protocol dalla libreria di protocolli Icy. Aprire Ghiacciato e fare clic sugli strumenti nel menu della barra multifunzione. Clicca sui protocolli per aprire l'interfaccia dell'editor dei protocolli.Fare clic sul carico e aprire l'analizzatore della sottostruttura del protocollo. Il caricamento del protocollo può richiedere alcuni secondi. Il flusso di lavoro è composto da 13 blocchi generali che funzionano come una pipeline composta da diverse caselle che eseguono sottoattività specifiche.Ogni blocco o casella è numerato e ha una classificazione specifica all'interno del flusso di lavoro. Cliccando su questo numero, assegnare la posizione più vicina possibile alla prima al blocco selezionato. Le posizioni degli altri blocchi vengono riorganizzate.Facendo clic sull'icona dell'angolo in alto a sinistra, il blocco può essere espanso. Può anche essere ingrandito, ristretto o rimosso. Ogni pipeline del flusso di lavoro è corretta sorsa da una rete di caselle collegate tra loro da altri input e output.Per creare una connessione, fare clic su un output e mantenerla fino a quando il cursore non contiene alcun input. Le connessioni possono essere rimosse facendo clic sul tag di output. Se necessario rinominare i file in modo che le sequenze da unire, avere gli stessi nomi prefisso seguito da separatore distinto.Ad esempio, le sequenze di singoli canali da un'immagine A sono denominate immagine Un carattere di sottolineatura rosso, immagine Un carattere di sottolineatura blu e così via. Nella stessa cartella creare una nuova cartella per canale da unire. Ad esempio, per unire canali rossi, verdi e blu, creare tre cartelle e archiviare le sequenze corrispondenti all'interno di queste cartelle.Utilizzare solo i canali di unione a blocchi, rimuovere gli altri blocchi e salvare il protocollo come canali di unione. Accesso alle caselle per impostare i parametri. Nella casella, numero di canale x, scegliere il canale da estrarre.Nelle immagini RGB classiche, zero è rosso, uno è verde e due è blu. Nella casella, numero del canale della cartella x, Barra rovesciata il nome della cartella contenente le immagini del canale x. Nella casella separare il numero di canale x.Separatore utilizzato per il nome dell'immagine. Nella casella, color map channel number x, indicare con un numero quale colonna di modello utilizzare per visualizzare il canale corrispondente in Icy. Nella casella, formato delle immagini unite, scrivere l'estensione per salvare le immagini unite.Nell'angolo superiore sinistro del blocco dei canali unione, fare clic sul collegamento direttamente a destra della cartella. Nella finestra di dialogo aperta visualizzata fare doppio clic sulla cartella contenente le sequenze del primo canale definito nel canale della cartella box numero uno. Quindi fai clic su apri, eseguito il protocollo.Le immagini unite vengono salvate in una cartella unita nella stessa directory delle cartelle dei singoli canali. La segmentazione degli oggetti è il passaggio più impegnativo nell'analisi delle immagini. La sua efficienza determina l'accuratezza delle misurazioni del set risultanti.Pertanto, l'analizzatore di strutture integra algoritmi semplici e più complessi per proporre diverse alternative adattate alla complessità dell'immagine e alle esigenze degli utenti. Se gli oggetti non si toccano, l'altro utente non ha bisogno di differenziare gli oggetti cluster singolarmente utilizzare la segmentazione del blocco A.Quando gli oggetti non si toccano, ma alcuni di essi si trovano nelle immediate vicinanze, utilizzare la segmentazione del blocco B.Per gli oggetti con un livello cluster elevato e una forma convessa, utilizzare la segmentazione del blocco C.Se gli oggetti presentano un livello di clustering elevato e hanno forme irregolari , utilizzare la segmentazione del blocco D.Utilizzare la segmentazione del blocco nei cluster citoplasma per segmentare il citoplasma toccante singolarmente usando nuclei segmentati come marcatori. L'adattamento a blocchi per la segmentazione degli oggetti primari può essere eseguito in modo indipendente in modo che diversi blocchi possano essere utilizzati nella stessa esecuzione per confrontare la loro efficienza per una particolare sottostruttura o per segmentare diversi tipi di sottostrutture.Per illustrare la segmentazione, è stata scelta la segmentazione del blocco B, che si adatta a un numero maggiore di problemi. Per utilizzare questo blog. Per prima cosa, collegalo per selezionare la cartella.Quindi, richiama il segnale del canale, impostare il canale dell'oggetto su segmentare. Ad esempio, per corrispondere alla B, nella casella HK significa impostare il parametro delle classi di intensità e le dimensioni minime e massime approssimative in pixel di oggetti da rilevare. Per le classi di intensità, un valore pari a due classi classificherà i pixel in due classi, sfondo e primo piano.Si adatta così quando il contrasto tra gli oggetti e lo sfondo è alto. Se gli oggetti in primo piano hanno intensità di origine o il contrasto con lo sfondo è basso, aumentare il numero di classi. Nella casella contorni attivi ottimizzare il rilevamento dei bordi degli oggetti.Durante il processo, verrà creata una cartella per salvare immagini di oggetti segmentati. Nel testo della casella assegnare un nome a questa cartella, ad esempio segmentando i nuclei. Per impostare il formato per il salvataggio di immagini di oggetti segmentati, compilare il formato della casella delle immagini di oggetti segmentati, eseguito il protocollo.La cartella viene creata nella cartella contenente immagini unite. Diversi blocchi sono stati sviluppati per adattarsi al numero di leggi e canali e compartimenti cellulari da analizzare in oggetti segmentati. Nell'esempio seguente, per l'analisi, scegliete i canali P.Two dell'analisi della fluorescenza a blocchi nello stesso compartimento e collegatelo per selezionare la cartella.Il blocco di segmentazione avrebbe dovuto essere elaborato prima che questa analisi impostasse il ROI delle immagini della cartella di posta in arrivo dei parametri, scrivesse il nome della cartella contenente immagini di oggetti segmentati preceduti da una barra rovesciata. In formato Posta in arrivo delle immagini di oggetti segmentati, scrivere il formato utilizzato per salvare immagini di oggetti segmentati. La Posta in arrivo uccide i bordi per rimuovere entrambi gli oggetti.Altrimenti, in questo momento, è necessaria l'installazione della raccolta di imaging J più completa per utilizzare questa funzione. Nelle caselle canale segnale spot, impostare il canale in cui devono essere rilevati i punti. Nelle immagini RTP classiche, zero è rosso Uno è verde e due è blu.Nelle caselle nome della molecola localizzata, scrivi il nome della molecola che si localizza nelle macchie. Il numero di campi a cui rispondere dipende dal numero di molecole. Nelle caselle lunghezze d'onda per blocco rivelatore, impostare i parametri di rilevamento dei punti per ogni singolo canale.Per elaborare blocchi diversi in una stanza, mantenere le connessioni dei blocchi scelti, con la cartella di selezione del blocco. Assicurarsi che i loro ranghi al di sotto della buona elaborazione del flusso di lavoro. Prima di eseguire il flusso di lavoro, si consiglia inoltre di rimuovere i blocchi inutilizzati e salvare il nuovo protocollo con un altro nome.Fare clic sull'esecuzione per avviare il flusso di lavoro. Quando apre gli occhi appaiono libri. Fare doppio clic sulla cartella contenente le immagini dell'infermiere Quindi fare clic su Apri, il flusso di lavoro verrà eseguito automaticamente.Se l'elaborazione viene completata, il flusso di lavoro eseguito correttamente verrà visualizzato nell'angolo in basso a destra, tutti i blocchi verranno contrassegnati con il segno verde. In caso meno, il blocco e la casella interna che presenta il segno di freccia indicheranno gli elementi corretti. È importante sottolineare che diversi display consentono di visualizzare i risultati intermedi durante ogni esecuzione al fine di controllare l'elaborazione.La rapidità, la flessibilità e la funzionalità di questo flusso di lavoro saranno limitate a vari esempi. In questo primo esempio, analizziamo la traslocazione nucleare di NF kappa B.Dopo la simulazione con concentrazioni crescenti di TNF alpha. Nuclei e citoplasma sono stati delineati usando blocchi di segmentazione C ed E.L'NF kappa B prospera nel segnale è stato analizzato utilizzando il blocco globale di analisi della traslocazione. Più di 40.000 cellule in 96 immagini sono state analizzate in 26 minuti. I dati generati sono stati utilizzati per stabilire questa curva di risposta alla dose che mostra l'induzione della traslocazione nucleare NF Kappa B da parte del TNF alpha.Il flusso di lavoro può anche essere utilizzato per rilevare le dimensioni del file ed estrarre informazioni specifiche sulle relative funzionalità. Qui, le proprietà nelle singole cellule sono state rilevate localizzando l'EDC per le proteine. I nuclei nel citoplasma sono stati delineati usando blocchi di segmentazione A ed E.EDC4 è stato analizzato utilizzando blocchi di analisi della fluorescenza C.In questo esempio, il segno citoplasmatico EDC4 è stato rilevato in entrambe le cellule analizzate. La dimensione in pixel di ogni lato completo è fornita nel foglio di calcolo. In questo esempio, abbiamo sfruttato la versatilità del flusso di lavoro per studiare i carboidrati una cinetica più lunga dello stress ossidativo.Il segno di forza nucleare della coilina sono i principali componenti strutturali dei carboidrati Il loro numero e dimensione sono stati analizzati in base alle dimensioni, allo stato di stress, valutati da rotture a doppio filamento localizzate con 53BP1. I nuclei sono stati delineati utilizzando proxy di segmentazione, forza nucleare e segnali di coillin e 53BP1, sono stati analizzati simultaneamente utilizzando l'analisi della fluorescenza Blocco B.Utilizzando i dati di 2300 singole cellule, abbiamo evidenziato un aumento significativo del numero di siti di Greenfield dopo l'induzione dello stress associata a una diminuzione delle loro dimensioni. Questi dati suggeriscono fortemente che lo stress ossidativo cambia il potere nucleazione di un carboidrato nell'uso di una distribuzione plasmatica nucleare in un numero di nucleare più piccolo per il sito per giustificare un cambiamento nell'espressione della coilina potrebbe alterarne la localizzazione e cambiare la nucleazione dei corpi curvi.Una proteina di fusione di coilina GFP esogena era sovraespressa. Le caratteristiche del nostro corpo sono state analizzate in base al livello di sovraespressione della coilina GFP. I nuclei sono stati delineati utilizzando il blocco di segmentazione A.I segnali fluorescenti di coilina e coilina GFP, sono stati analizzati simultaneamente utilizzando il blocco di analisi della fluorescenza B.Il livello di sovraespressione della coilina GFP è stato riflesso dalla densità di significato del segnale GFP nei singoli nuclei.I dati generati dall'analizzatore di sottostrutture mostrano che la coilina GFP in sovraespressione aumenta significativamente le dimensioni e il numero di carboidrati. Poiché lo stress ossidativo aumenta il numero di carboidrati ma ne riduce le dimensioni. Questi dati potrebbero riflettere che l'effetto di stress ossidativo sulla struttura dei carboidrati è molto probabilmente indotto da un cambiamento della loro composizione piuttosto che da un effetto su una certa quantità di coilina.Quindi l'analizzatore di strutture è un flusso di lavoro altamente modulare per l'analisi delle immagini bio. Può essere adattato a diversi contesti dalla semplice fusione dei canali alla quantificazione di più piani e segnali in migliaia di cellule. Integra anche algoritmi di segmentazione semplici e complessi a seconda della complessità dell'immagine e automatizza l'estrazione delle funzionalità del segnale fluorescente.

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