Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza

Substructure analyzer è un flusso di lavoro intuitivo che esegue l'analisi automatica di più metriche di microscopia di processo. Non significa zero tonnellate di software open source Icy e anche utilizzando le funzionalità della macchina. È importante sottolineare che questo flusso di lavoro è conveniente resort produrre conoscenza e analisi delle immagini.

Le immagini multicanale vengono caricate all'interno del flusso di lavoro e pre-elaborate al fine di migliorare il rapporto segnale/rumore e rimuovere immagini o difetti. Quindi, la segmentazione dell'immagine isola le aree di interesse, note anche come ROM dallo sfondo. Sono disponibili diversi metodi di segmentazione a seconda del livello di clustering e della natura degli oggetti di interesse.

Gli oggetti segmentati vengono salvati con un descrittore specifico in una cartella specifica. La forza e i segnali vengono quindi analizzati all'interno delle righe e più feature come posizione, dimensioni, forma nelle trame di densità, ma il numero e le dimensioni vengono esportati in un foglio di calcolo creato automaticamente. Scarica Icy dal sito icy.

Quindi scaricare Substructure Analyzer Protocol dalla libreria di protocolli Icy. Aprire Ghiacciato e fare clic sugli strumenti nel menu della barra multifunzione. Clicca sui protocolli per aprire l'interfaccia dell'editor dei protocolli.

Fare clic sul carico e aprire l'analizzatore della sottostruttura del protocollo. Il caricamento del protocollo può richiedere alcuni secondi. Il flusso di lavoro è composto da 13 blocchi generali che funzionano come una pipeline composta da diverse caselle che eseguono sottoattività specifiche.

Ogni blocco o casella è numerato e ha una classificazione specifica all'interno del flusso di lavoro. Cliccando su questo numero, assegnare la posizione più vicina possibile alla prima al blocco selezionato. Le posizioni degli altri blocchi vengono riorganizzate.

Facendo clic sull'icona dell'angolo in alto a sinistra, il blocco può essere espanso. Può anche essere ingrandito, ristretto o rimosso. Ogni pipeline del flusso di lavoro è corretta sorsa da una rete di caselle collegate tra loro da altri input e output.

Per creare una connessione, fare clic su un output e mantenerla fino a quando il cursore non contiene alcun input. Le connessioni possono essere rimosse facendo clic sul tag di output. Se necessario rinominare i file in modo che le sequenze da unire, avere gli stessi nomi prefisso seguito da separatore distinto.

Ad esempio, le sequenze di singoli canali da un'immagine A sono denominate immagine Un carattere di sottolineatura rosso, immagine Un carattere di sottolineatura blu e così via. Nella stessa cartella creare una nuova cartella per canale da unire. Ad esempio, per unire canali rossi, verdi e blu, creare tre cartelle e archiviare le sequenze corrispondenti all'interno di queste cartelle.

Utilizzare solo i canali di unione a blocchi, rimuovere gli altri blocchi e salvare il protocollo come canali di unione. Accesso alle caselle per impostare i parametri. Nella casella, numero di canale x, scegliere il canale da estrarre.

Nelle immagini RGB classiche, zero è rosso, uno è verde e due è blu. Nella casella, numero del canale della cartella x, Barra rovesciata il nome della cartella contenente le immagini del canale x. Nella casella separare il numero di canale x.

Separatore utilizzato per il nome dell'immagine. Nella casella, color map channel number x, indicare con un numero quale colonna di modello utilizzare per visualizzare il canale corrispondente in Icy. Nella casella, formato delle immagini unite, scrivere l'estensione per salvare le immagini unite.

Nell'angolo superiore sinistro del blocco dei canali unione, fare clic sul collegamento direttamente a destra della cartella. Nella finestra di dialogo aperta visualizzata fare doppio clic sulla cartella contenente le sequenze del primo canale definito nel canale della cartella box numero uno. Quindi fai clic su apri, eseguito il protocollo.

Le immagini unite vengono salvate in una cartella unita nella stessa directory delle cartelle dei singoli canali. La segmentazione degli oggetti è il passaggio più impegnativo nell'analisi delle immagini. La sua efficienza determina l'accuratezza delle misurazioni del set risultanti.

Pertanto, l'analizzatore di strutture integra algoritmi semplici e più complessi per proporre diverse alternative adattate alla complessità dell'immagine e alle esigenze degli utenti. Se gli oggetti non si toccano, l'altro utente non ha bisogno di differenziare gli oggetti cluster singolarmente utilizzare la segmentazione del blocco A.Quando gli oggetti non si toccano, ma alcuni di essi si trovano nelle immediate vicinanze, utilizzare la segmentazione del blocco B.Per gli oggetti con un livello cluster elevato e una forma convessa, utilizzare la segmentazione del blocco C.Se gli oggetti presentano un livello di clustering elevato e hanno forme irregolari , utilizzare la segmentazione del blocco D.Utilizzare la segmentazione del blocco nei cluster citoplasma per segmentare il citoplasma toccante singolarmente usando nuclei segmentati come marcatori. L'adattamento a blocchi per la segmentazione degli oggetti primari può essere eseguito in modo indipendente in modo che diversi blocchi possano essere utilizzati nella stessa esecuzione per confrontare la loro efficienza per una particolare sottostruttura o per segmentare diversi tipi di sottostrutture.

Per illustrare la segmentazione, è stata scelta la segmentazione del blocco B, che si adatta a un numero maggiore di problemi. Per utilizzare questo blog. Per prima cosa, collegalo per selezionare la cartella.

Quindi, richiama il segnale del canale, impostare il canale dell'oggetto su segmentare. Ad esempio, per corrispondere alla B, nella casella HK significa impostare il parametro delle classi di intensità e le dimensioni minime e massime approssimative in pixel di oggetti da rilevare. Per le classi di intensità, un valore pari a due classi classificherà i pixel in due classi, sfondo e primo piano.

Si adatta così quando il contrasto tra gli oggetti e lo sfondo è alto. Se gli oggetti in primo piano hanno intensità di origine o il contrasto con lo sfondo è basso, aumentare il numero di classi. Nella casella contorni attivi ottimizzare il rilevamento dei bordi degli oggetti.

Durante il processo, verrà creata una cartella per salvare immagini di oggetti segmentati. Nel testo della casella assegnare un nome a questa cartella, ad esempio segmentando i nuclei. Per impostare il formato per il salvataggio di immagini di oggetti segmentati, compilare il formato della casella delle immagini di oggetti segmentati, eseguito il protocollo.

La cartella viene creata nella cartella contenente immagini unite. Diversi blocchi sono stati sviluppati per adattarsi al numero di leggi e canali e compartimenti cellulari da analizzare in oggetti segmentati. Nell'esempio seguente, per l'analisi, scegliete i canali P.Two dell'analisi della fluorescenza a blocchi nello stesso compartimento e collegatelo per selezionare la cartella.

Il blocco di segmentazione avrebbe dovuto essere elaborato prima che questa analisi impostasse il ROI delle immagini della cartella di posta in arrivo dei parametri, scrivesse il nome della cartella contenente immagini di oggetti segmentati preceduti da una barra rovesciata. In formato Posta in arrivo delle immagini di oggetti segmentati, scrivere il formato utilizzato per salvare immagini di oggetti segmentati. La Posta in arrivo uccide i bordi per rimuovere entrambi gli oggetti.

Altrimenti, in questo momento, è necessaria l'installazione della raccolta di imaging J più completa per utilizzare questa funzione. Nelle caselle canale segnale spot, impostare il canale in cui devono essere rilevati i punti. Nelle immagini RTP classiche, zero è rosso Uno è verde e due è blu.

Nelle caselle nome della molecola localizzata, scrivi il nome della molecola che si localizza nelle macchie. Il numero di campi a cui rispondere dipende dal numero di molecole. Nelle caselle lunghezze d'onda per blocco rivelatore, impostare i parametri di rilevamento dei punti per ogni singolo canale.

Per elaborare blocchi diversi in una stanza, mantenere le connessioni dei blocchi scelti, con la cartella di selezione del blocco. Assicurarsi che i loro ranghi al di sotto della buona elaborazione del flusso di lavoro. Prima di eseguire il flusso di lavoro, si consiglia inoltre di rimuovere i blocchi inutilizzati e salvare il nuovo protocollo con un altro nome.

Fare clic sull'esecuzione per avviare il flusso di lavoro. Quando apre gli occhi appaiono libri. Fare doppio clic sulla cartella contenente le immagini dell'infermiere Quindi fare clic su Apri, il flusso di lavoro verrà eseguito automaticamente.

Se l'elaborazione viene completata, il flusso di lavoro eseguito correttamente verrà visualizzato nell'angolo in basso a destra, tutti i blocchi verranno contrassegnati con il segno verde. In caso meno, il blocco e la casella interna che presenta il segno di freccia indicheranno gli elementi corretti. È importante sottolineare che diversi display consentono di visualizzare i risultati intermedi durante ogni esecuzione al fine di controllare l'elaborazione.

La rapidità, la flessibilità e la funzionalità di questo flusso di lavoro saranno limitate a vari esempi. In questo primo esempio, analizziamo la traslocazione nucleare di NF kappa B.Dopo la simulazione con concentrazioni crescenti di TNF alpha. Nuclei e citoplasma sono stati delineati usando blocchi di segmentazione C ed E.

L'NF kappa B prospera nel segnale è stato analizzato utilizzando il blocco globale di analisi della traslocazione. Più di 40.000 cellule in 96 immagini sono state analizzate in 26 minuti. I dati generati sono stati utilizzati per stabilire questa curva di risposta alla dose che mostra l'induzione della traslocazione nucleare NF Kappa B da parte del TNF alpha.

Il flusso di lavoro può anche essere utilizzato per rilevare le dimensioni del file ed estrarre informazioni specifiche sulle relative funzionalità. Qui, le proprietà nelle singole cellule sono state rilevate localizzando l'EDC per le proteine. I nuclei nel citoplasma sono stati delineati usando blocchi di segmentazione A ed E.

EDC4 è stato analizzato utilizzando blocchi di analisi della fluorescenza C.In questo esempio, il segno citoplasmatico EDC4 è stato rilevato in entrambe le cellule analizzate. La dimensione in pixel di ogni lato completo è fornita nel foglio di calcolo. In questo esempio, abbiamo sfruttato la versatilità del flusso di lavoro per studiare i carboidrati una cinetica più lunga dello stress ossidativo.

Il segno di forza nucleare della coilina sono i principali componenti strutturali dei carboidrati Il loro numero e dimensione sono stati analizzati in base alle dimensioni, allo stato di stress, valutati da rotture a doppio filamento localizzate con 53BP1. I nuclei sono stati delineati utilizzando proxy di segmentazione, forza nucleare e segnali di coillin e 53BP1, sono stati analizzati simultaneamente utilizzando l'analisi della fluorescenza Blocco B.Utilizzando i dati di 2300 singole cellule, abbiamo evidenziato un aumento significativo del numero di siti di Greenfield dopo l'induzione dello stress associata a una diminuzione delle loro dimensioni. Questi dati suggeriscono fortemente che lo stress ossidativo cambia il potere nucleazione di un carboidrato nell'uso di una distribuzione plasmatica nucleare in un numero di nucleare più piccolo per il sito per giustificare un cambiamento nell'espressione della coilina potrebbe alterarne la localizzazione e cambiare la nucleazione dei corpi curvi.

Una proteina di fusione di coilina GFP esogena era sovraespressa. Le caratteristiche del nostro corpo sono state analizzate in base al livello di sovraespressione della coilina GFP. I nuclei sono stati delineati utilizzando il blocco di segmentazione A.I segnali fluorescenti di coilina e coilina GFP, sono stati analizzati simultaneamente utilizzando il blocco di analisi della fluorescenza B.Il livello di sovraespressione della coilina GFP è stato riflesso dalla densità di significato del segnale GFP nei singoli nuclei.

I dati generati dall'analizzatore di sottostrutture mostrano che la coilina GFP in sovraespressione aumenta significativamente le dimensioni e il numero di carboidrati. Poiché lo stress ossidativo aumenta il numero di carboidrati ma ne riduce le dimensioni. Questi dati potrebbero riflettere che l'effetto di stress ossidativo sulla struttura dei carboidrati è molto probabilmente indotto da un cambiamento della loro composizione piuttosto che da un effetto su una certa quantità di coilina.

Quindi l'analizzatore di strutture è un flusso di lavoro altamente modulare per l'analisi delle immagini bio. Può essere adattato a diversi contesti dalla semplice fusione dei canali alla quantificazione di più piani e segnali in migliaia di cellule. Integra anche algoritmi di segmentazione semplici e complessi a seconda della complessità dell'immagine e automatizza l'estrazione delle funzionalità del segnale fluorescente.