Name: Ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e limaging di microscopia migliorato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per la coltura di organoidi renali su membrana corioallantoide di embrione di pollo. Questo metodo migliora la vascolarizzazione, la sopravvivenza e consente imaging confocale ad alta risoluzione.

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla Suomen Akatemia (Accademia di Finlandia) (206038, 121647, 250900, 260056; Sovvenzione del Centro di Eccellenza 2012-2017 251314, Munuaiss, - Associazione finlandese del rene e del fegato, la Sigrid Juseliuksen S'ti, Victoriastiftelsen, La Fondazione Culturale Svedese in Finlandia, Novo Nordisk, (Società oncologica della Finlandia), il settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013; concedere FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) e H2020 Marie Sklodowska-Curie Innovative Actions Training Network "RENALTRACT" Project ID 642937. Gli autori ringraziano Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias e Hannele Horkman per assistenza tecnica.
Le figure 3, 4 e Film 2 vengono ristampate con il permesso di Sviluppo.

La cura e le procedure sugli animali erano conformi alla legislazione nazionale finlandese per l'uso di animali da laboratorio, alla Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati per scopi sperimentali e di altro tipo (ETS 123) e alla direttiva 86/609/CEE dell'UE.
1. Fabbricazione di miniserbatoi per la coltivazione di reni embrionali di topo e organoidi renali su CAM di pollo e creazione di esperimenti di xenotrapianto
<ol><li>Utilizzare inserti di coltura cellulare transwell progettati per 6 pozze o 12 piastre di pozzo. NOTA: a seconda dell'esperimento specifico, è possibile utilizzare miniserbatoi grandi o piccoli. È meglio utilizzare piccoli miniserbatoi per lo xenotrapianto fino a otto reni embrionali o quando diversi miniserbatoi saranno posizionati sullo stesso embrione di pollo (ad esempio, campioni di esperimento e controllo sullo stesso CAM di pollo).</li>
	<li>Tagliare i lati degli inserti utilizzando un multitool rotante con una lama a sega circolare o una sega a mano per creare un anello di plastica alto 2 mm con una membrana permeabile attaccata ad esso.</li>
	<li>Polacco i bordi di questi minireservoirs con un bisturi o un coltello affilato.</li>
	<li>Sterilizzare i miniserbatoi nel 70% di etanolo per almeno 1 h.</li>
	<li>Lavare i miniserbatoi in acqua a doppia distillazione automatica e lasciarli asciugare in un cappuccio laminare.</li>
	<li>Risciacquare i miniserbatoi in PBS e mezzi di coltura (10% FBS/1% penicillina-streptomica).</li>
	<li>Collocare il serbatoio in una piastra Petri, sopra una goccia (600 l/400 l) di mezzo di coltura con la membrana rivolta verso l'alto.</li>
	<li>Disporre sezionati i reni embrionali ex vivo o gli organoidi renali uniformemente sulla membrana con l'aiuto di una pipetta o di un tubo capillare di vetro. Evitare di lasciare un sacco di liquido intorno ai reni.</li>
	<li>Lasciare che i campioni si attacchino alla membrana per 2-24 h in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 e 5% di CO2. NOTA: Fino a otto reni di topo embrionali E11,5 o organoidi renali possono essere disposti sul piccolo inserto. L'inserto di grandi dimensioni è raccomandato se saranno utilizzati pezzi più grandi di tessuto embrionale per xenotrapianto o una miscela di idrogel cellulare su un'area più ampia della CAM.</li>
	<li>Prendere polli embrionali coltivati ex ovo di 8 giorni preparati secondo metodi pubblicati in precedenza dall'incubatore di coltura cellulare12,13.</li>
	<li>Trasferire i miniserbatoi al CAM in modo che gli innesti siano rivolti verso il CAM e la membrana li sovrapponga. Posizionare i miniserbatoi nella periferia del CAM, in modo che non coprano l'embrione di pollo. NOTA: Quando si utilizzano i miniserbatoi più piccoli fabbricati da inserti transwell per 12 pozze, è possibile posizionare fino a tre miniserbatoi su un CAM.</li>
	<li>Aggiungete ai minicarri 500 l (6 ben inserti) o 300 l (12 pozzetto) di coltura medio.</li>
	<li>Coltivare i campioni su pollo CAM per un massimo di 9 giorni. Sostituire il supporto di coltura nei miniserbatoi ogni giorno. NOTA: La vascolarizzazione dei campioni può essere osservata non appena 24–48 h dopo il trapianto.</li>
</ol>2. Fabbricazione di lastre progettate su misura e impostazione di colture Fi
<ol><li>Forare fori di 20 mm di diametro nella parte inferiore di una piastra di 6 pozzetti. NOTA: per gli esperimenti di Fi-D, utilizzare 6 piastre di pozzo con una profondità di 16 mm (specificata in Table of Materials).</li>
	<li>Polacco i cerchi dei fori (soprattutto sul lato superiore) utilizzando un trapano elettrico con una punta di perforazione controsinkttrice, un bisturi, o un coltello affilato.</li>
	<li>Sterilizzare le piastre nel 70% di etanolo per almeno 1 h.</li>
	<li>Lavare le piastre in acqua a due distillati ad autoclave e lasciarle asciugare in condizioni sterili.</li>
	<li>Lavare accuratamente il vetro da 22 mm x 22 mm copre le labbra con il 70% di etanolo o pulirle secondo il protocollo pubblicato da Saarela et al.11.</li>
	<li>Incollare i copricapi sul lato superiore dei fori in 6 piastre di pozzo utilizzando una colla di tessuto non tossico. Applicare la colla intorno al foro e posizionare delicatamente il coperchio per coprirlo. Lasciare asciugare la colla.</li>
	<li>Ispezionare le piastre sotto uno stereomicroscopio e rimuovere la colla essiccata in eccesso dalla superficie dei coprinti, se necessario. NOTA: Verificare che non vi sia alcuna colla sopra il coperchio per garantire una compressione uniforme dei campioni.</li>
	<li>Mescolare le perline di polistirolo (dimensione delle particelle di 70 m) con un volume uguale di idrogel. È sufficiente un volume di 50-100 l per pozzo. NOTA: Mantenere la miscela di perline di idrogel e polistirolo sul ghiaccio.</li>
	<li>Posizionare un inserto transwell sotto un microscopio dissetante con la membrana verso l'alto.</li>
	<li>Disporre i campioni (ad esempio, reni embrionali ex vivo o organoidi renali) in modo uniforme sulla membrana.</li>
	<li>Aggiungere con attenzione la miscela di perline di idrogel/polistirolo accanto ai campioni per evitare danni ai tessuti fragili.</li>
	<li>Capovolgere l'inserto transwell in modo che la membrana con i campioni assemblati su di esso sia rivolta verso il basso.</li>
	<li>Posizionare delicatamente l'inserto in un pozzo della piastra del pozzo modificato 6 e premere delicatamente verso il basso in modo che i campioni sono compressi al livello delle perline. NOTA: Seguire l'avanzamento della compressione utilizzando un microscopio.</li>
	<li>Tenere l'inserto leggermente premuto al pozzo con una mano e fissarlo alla piastra fondendo la plastica con un ferro da saldatura in tre punti alla periferia dell'inserto.</li>
	<li>Quando l'inserto è fissato alla piastra, aggiungere 2 mL di mezzo di coltura (DMEM/10% FBS/1% penicillina-streptomycin) al pozzo e continuare ad assemblare i pozzi rimanenti nella piastra nello stesso modo.</li>
	<li>Trasferire la piastra finita su un'incubatrice in scena di un microscopio invertito per l'imaging time-lapse.</li>
	<li>Eseguire l'imaging time-lapse dei campioni utilizzando le impostazioni sperimentali appropriate. NOTA: La modifica del supporto di coltura nei pozzetti della piastra durante gli esperimenti time-lapse non è necessaria, ma può essere facilmente eseguita attraverso i fori sui lati dell'inserto.</li>
</ol>

<ol><li>Saxen, L., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+contact+and+cell+adhesion+during+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell contact and cell adhesion during tissue organization.</a> International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).</li>
<li>Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+die+tubulogenese+der+niere%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+F%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über die tubulogenese der niere.</a> Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).</li>
<li>Saxen, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxen%2C+L+%22Organogenesis+of+the+Kidney.+1st+ed%22">Organogenesis of the Kidney. 1st ed</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 536 (7615), 238(2016).</li>
<li>Halt, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146%2B+cells+are+essential+for+kidney+vasculature+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD146+ cells are essential for kidney vasculature development.</a> Kidney International. 90, 311-324 (2016).</li>
<li>van den Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+Subcapsular+Transplantation+of+PSC-Derived+Kidney+Organoids+Induces+Neo-vasculogenesis+and+Significant+Glomerular+and+Tubular+Maturation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li>
<li>Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+vascularization+of+the+metanephric+kidney+grafted+on+the+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane.</a> Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).</li>
<li>Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+fusion+of+the+epithelial+and+endothelial+basement+membranes+in+interspecies+hybrid+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli.</a> Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).</li>
<li>Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+glomerular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The origin of the glomerular endothelium.</a> Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).</li>
<li>Short, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Quantification+of+Tissue+Dynamics+in+the+Developing+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney.</a> Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).</li>
<li>Saarela, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fixed+z-direction+%28FiZD%29+kidney+primordia+and+an+organoid+culture+system+for+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging.</a> Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).</li>
<li>Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+ex+ovo-cultivation+of+developing+chicken+embryos+for+human+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts.</a> Stem Cells International. 2013, 960958(2013).</li>
<li>Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+coordinates+directional+cell+migration+and+extension+of+the+M%C3%BCllerian+duct+essential+for+ontogenesis+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract.</a> Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).</li>
<li>Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie-1-directed+expression+of+Cre+recombinase+in+endothelial+cells+of+embryoid+bodies+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice.</a> Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Vengono presentati due protocolli dettagliati che perfezionano il metodo classico della coltura organotipica renale e consentono la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging 4D ottimale (ad esempio, immagine e tempo 3D) di reni embrionali e organoidi ex vivo. In questa sezione vengono evidenziati i passaggi critici dei metodi e vengono illustrati i problemi.
La differenza significativa tra altri metodi di coltura CAM e questo metodo di coltura CAM del pollo migliorato è l'uso di minise...

La coltura organotipica dei reni embrionali è diventata un modello importante per studiare la nefrogenesi decenni fa1,2,3. Gli organoidi renali rappresentano un sistema modello avanzato per studiare lo sviluppo di reni sani e malati4. Lo svantaggio principale per entrambi i metodi, tuttavia, è che nessuno dei due metodi riassume la funzione principale del rene: la filtrazione del sangue. Nefrosci e vascolatura renale si sviluppano in organoidi renali e culture organotipiche in modo simile alla fase iniziale nello sviluppo vivo; tuttavia, i glomeruli formati in vitro rimangono avascolari5. La vascolarizzazione dei reni embrionali e degli organoidi renali ex vivo è stata precedentemente dimostrata negli esperimenti di trapianto solo in condizioni di vivo. Ad esempio, il trapianto di organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti umane sotto una capsula renale di topo consente lo sviluppo dei nefrodi nell'organoid e uno stadio funzionale6.
Un approccio intermedio tra le colture puramente in vitro e i metodi di trapianto in vivo è lo xenotrapianto alla CAM degli embrioni aviari. La vascolarizzazione della primardia renale di topo intatta è stata dimostrata in precedenza utilizzando questo sistema7,8. Tuttavia, è stato anche dimostrato che la vascolatura renale nel rene murino xenotrapiantato è stata derivata dall'endotelio ospite, non l'innesto9. Questa osservazione ha ridotto significativamente il potenziale dei modelli chimerici (aviari-mammiferi) del rene embrionale per studiare lo sviluppo della vascolatura renale, perché le condizioni sperimentali non erano permissive per la sopravvivenza delle cellule endoteliali derivate dai donatori.
Presentato nella prima parte di questo protocollo è un metodo migliorato per la coltivazione di reni embrionali di topo sul CAM di uova aviarie, combinando condizioni microambientali di coltura organotipica e xenotrapianto. Il principale miglioramento dei metodi precedenti è che invece di posizionare i reni embrionali del topo e gli organoidi renali direttamente sul CAM, l'area di impianto è sovrapposta a miniserbatoi permeabili pieni di mezzo di coltura che forniscono il tessuto trapiantato che fornisce il tessuto trapiantato con sostanze nutritive e proteggerlo dall'essiccazione. Il tasso di successo degli esperimenti aumenta in modo significativo e le condizioni per lo sviluppo della vascolatura derivata dal donatore migliorano. L'applicazione di questo metodo alle colture xenotrapianto comporta lo sviluppo della vascolatura glomerare composta da cellule endogene endogene dei reni donatrici.
L'analisi dettagliata della morfogenesi cellulare è un'altra importante applicazione dei modelli di coltura renale. I metodi precedentemente segnalati per l'acquisizione dell'immagine time-lapse delle colture renali sono sufficienti solo per l'analisi della morfologia complessiva e la modellazione del rene embrionale, ma non per tracciare singole cellule10. Recentemente, è stato descritto un nuovo metodo di risoluzione della direzione a z (Fi-D) destinato all'imaging time-lapse 3D confocale ad alta risoluzione di organoidi renali e colture organotipiche11. In questo metodo, gli organoidi e gli organi embrionali sono delicatamente compressi tra un coperchio di vetro e una membrana permeabile di un inserto transwell in una piastra progettata su misura fino a quando lo spessore del campione raggiunge 70 m, fornendo condizioni ottiche ottimali per l'imaging. Nella seconda parte dei metodi, viene descritto un protocollo dettagliato per la fabbricazione di una piastra su misura e la configurazione di esperimenti Fi-D per l'imaging organoid a lungo termine.

<table><tbody><tr><td>Punta da trapano a vanga regolabile Bosch</td><td></td><td>2609255277</td><td>Per praticare fori di 20 mm</td></tr><tr><td>di diametro Girauova automatico</td><td>OLBA B.V., Paesi Bassi</td><td>AT-42</td><td>Per l'incubazione di uova prima dell'installazione ex ovo.</td></tr><tr><td>Incubatore cellulare</td><td>Panasonic</td><td>13090543</td><td>Temperatura impostata a 37 gradi C, 90% di umidità, 5% CO2</td></tr><tr><td>cell Incubatore</td><td>SANYO</td><td>10070347</td><td>Incubatore per colture CAM di pollo. Temperatura impostata a 37 gradi C, 90% di umidità, 5% CO2</td></tr><tr><td>Cellstar Piastra</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>16 mm di profondità dei pozzetti per adattarsi agli inserti</td></tr><tr><td>Lama per sega circolare per utensile rotante Dremel</td> Microscopio confocale <td>Dremel</td><td>SC690</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Piastra a pozzetti multipli con inserti a membrana in policarbonato permeabile</td><td>Corning</td><td>10301031</td><td>Per piastre a 6 pozzetti. 40 & micro; m dimensione dei pori</td></tr><tr><td>Punta da trapano svasata</td><td>Craftomat, Bauhaus</td><td>22377902</td><td>Per lucidatura (20,5 mm, 1/4", HSS)</td></tr><tr><td>Tubo capillare in vetro monouso</td><td>Blaubrand</td><td>7087 33</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi monouso</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Trapano</td><td>Bosch</td><td>GSR 18 V-EC Incubatrice per uova ad</td><td></td></tr><tr><td>alto contenuto di glucosio</td>Professional<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma</td><td>D777</td></tr><tr><td>Compact S84</td><td>Grumbach, Germania</td><td>8012</td><td>Per l'incubazione di uova prima dell'installazione ex ovo. Temperatura impostata a 38 gradi C con umidità relativa superiore al 60%</td></tr><tr><td>Etanolo (70%)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uova fecondate</td><td>Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finlandia</td><td></td><td>Hy-Line White e Nick Chick</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino</td><td>HyClone</td><td>SH3007003HI Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Pinze DUMONT #5</td><td>Dumont</td><td>#5SF</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##</td><td>22x22 mm</td></tr><tr><td>Colla Histoacryl Braun</td><td></td><td></td> 1050052 <td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a tavolino</td><td>Okolab</td><td></td><td>Boldline, su misura</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS +/+</td><td>Biowest</td><td>X0520-500</td><td>Lavaggio dei mini serbatoi.</td></tr><tr><td>Perline di polistirene Penicillina e streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corpuscolare</td><td>1000263-10</td><td>70 &; m di diametro</td></tr><tr><td>Sistema multiutensile rotante</td><td>Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>Saldatore</td><td>Weller</td><td>TCP S</td><td>È possibile utilizzare anche il capillare in vetro riscaldato</td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari Thincert a 12 pozzetti con 0,4 e micro; Membrana in polistirene m-pore</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>Thincert Inserti per colture cellulari a 6 pozzetti con 0,4 & micro; membrana in polistirene m-pore</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td></td></tr></tbody></table>

ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging di microscopia migliorato

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Le colture organotiche renali embrionali, e in particolare gli organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti, sono strumenti eccellenti per seguire i processi di sviluppo e modellare la malattia renale. Tuttavia, i modelli sono limitati dalla mancanza di vascolarizzazione e funzionalità. Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un protocollo migliorato per il metodo di xenotrapianto di cellule e tessuti alla membrana corioallantoica (CAM) di un embrione aviario per ottenere la vascolarizzazione e il ripristino del flusso sanguigno. Gli innesti sono sovrapposti a minicarri su misura che fissano i campioni al CAM e forniscono loro un mezzo di coltura che protegge gli innesti dall'essiccazione. Il metodo di coltura migliorato consente agli xenograforti di crescere fino a 9 giorni. Il manoscritto descrive anche come fornire condizioni ottimali per l'imaging confocale a lungo termine di organoidi renali e colture organotipiche utilizzando il metodo di direzione fissa (Fi-D) pubblicato in precedenza. Questo metodo comprime delicatamente un organo embrionale o organoide tra un coperchio di vetro e la membrana in una grande quantità di mezzo e fornisce ottime condizioni per l'imaging per un massimo di 12 giorni. Insieme, questi metodi consentono la vascolarizzazione e il flusso sanguigno agli organoidi renali e alle colture renali organotipiche con una migliore imaging confocale. I metodi qui descritti sono molto utili per studiare le funzioni fondamentali e applicate dei reni ex vivo. Entrambi i metodi sono applicabili a vari tipi di tessuti e organoidi.

Il protocollo di coltura CAM qui presentato ha permesso una vascolarizzazione altamente efficiente degli organoidi renali e dei reni embrionali come risultato dello xenotrapianto su CAM di pollo(Figura 1, Film 1). I minicarri contenenti mezzi di coltura fornivano nutrienti al tessuto donatore e lo proteggevano dall'essiccazione durante il periodo di tempo precedente a una corretta vascolarizzazione. Questo metodo ha fornito condizioni permissive per la crescita delle cellule...

Questo lavoro descrive due metodi per studiare lo sviluppo degli organi, una migliore impostazione dello xenotrapianto sulla membrana corioallantoica (CAM) dagli embrioni aviari che consente la vascolarizzazione di organi embrionali e organoidi coltivati e una nuova direzione z fissa metodo di coltura dell'organo con condizioni sperimentali modificate che consente l'imaging confocale time-lapse ad alta risoluzione.

Ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging di microscopia migliorato

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

La coltura di organi renali e gli organelli derivati da cellule staminali programmate forniscono modi eccellenti per studiare i meccanismi alla base dello sviluppo renale e delle malattie. Tuttavia, l'attuale sistema di coltura degli organi non fornisce flusso sanguigno al rene. A causa di ciò, la ragione per cui i modelli attuali sono incompleti e non riescono a ricapitolare la funzione principale del rene, che è la filtrazione del sangue.In questa pubblicazione, presentiamo un protocollo migliorato per la coltivazione e la visualizzazione di reni embrionali e organoidi sulla membrana corioallantoica dell'embrione di pollo. Nel nostro nuovo set sperimentale, sovrapporiamo i rudimenti renali trapiantati su CAM con serbatoi di significato permeabili che sono pieni di terreno di coltura. Questo protocollo aumenta significativamente la sopravvivenza dei rudimenti renali e anche delle cellule endoteliali intrinseche.Il metodo consente il flusso sanguigno al glomerulus in via di sviluppo. Recentemente abbiamo anche pubblicato un nuovo metodo di coltura di organi a direzione fissa che offre immagini time-lapse 3D confocali ad alta risoluzione. Il metodo ha fornito condizioni ottimali per l'imaging confocale a lungo termine degli organoidi e dei rudimenti degli organi.Nell'approccio, comprimiamo delicatamente il tessuto tra uno scivolo di copertura in vetro e una membrana permeabile. Qui mostriamo come vengono realizzate le lastre progettate su misura e come vengono impostati gli esperimenti di coltura. Così, in questa pubblicazione presentiamo una migliore tecnica di coltura del tubo di organelli renali.Questo metodo offre un modo migliore per modellare la genesi degli organelli e condurre immagini ad alta risoluzione per studiare reni embrionali e organoidi renali ex vivo. A seconda dell'esperimento, prendere contro-inserti di celle di trasferimento progettati per piastre a sei o 12 pozzi. Tagliare i lati dell'inserto utilizzando uno strumento Dremel per creare un anello di plastica alto due millimetri con una membrana permeabile attaccata ad esso.Lucidare i bordi dell'anello dal swarf con un bisturi o un coltello affilato. Sterilizzare i mini serbatoi in etanolo al 70% per almeno un'ora. Quindi lavare i mini serbatoi in autoclave con acqua distillata e asciugarli in un cappuccio laminare.Risciacquare i mini serbatoi in PBS e mezzo di coltura. Posizionare il serbatoio su una piastra di Petri sopra la nostra goccia di mezzo di coltura con la membrana rivolta verso l'alto. Disporre reni embrionali ex vivo sezionati o organoidi renali sulla membrana.Evitare di lasciare molto liquido intorno ai campioni e lasciarli attaccati da due a 24 ore in un incubatore di coltura cellulare. Il trapianto exenale viene eseguito sulla membrana corioallantoica del pollo embrionale ex ovo di otto giorni. Trasferire i mini serbatoi in modo che la membrana copra l'innesto.Posizionarli nella periferia del CAM in modo che non coprano l'embrione. Quindi aggiungere il mezzo di coltura ai mini serbatoi. Coltivare i campioni su pollo CAM per nove giorni al massimo.Sostituire quotidianamente il mezzo di coltura nei mini serbatoi. La vascolarizzazione dei campioni può essere osservata già da 24 a 48 ore dopo il trapianto. Realizzare le piastre a sei pozzi progettate su misura per la coltura fissa.È necessario iniziare forando fori di 20 millimetri nella parte inferiore della piastra utilizzando una foratrice con una punta di perforazione adatta. Quindi, lucidare i bordi dei fori sul lato superiore della piastra. Infine, sterilizzare le piastre in 70%etanolo per almeno un'ora.Quindi lavare i piatti in autoclave con acqua distillata e asciugarli in cappuccio lemiare. Lavare il coperchio di 22x22 millimetri scivola in etanolo al 70% e lasciarli asciugare completamente. Incollare il coperchio scivolare sopra un foro nella parte inferiore di un pozzo usando colla tissutale.Dopo l'asciugatura, ispezionare le piastre al microscopio sterile e rimuovere la colla in eccesso. In primo luogo, mescolare un'aliquota di perline di polistirolo con un volume uguale di idrogeno. Posizionare l'inserto di transcompilato sotto un microscopio sezionante con membrana rivolta verso l'alto e disporre i reni sulla membrana.Aggiungere una goccia di miscela di perline idro-gel accanto ai reni con attenzione. Capovolgere l'inserto di transcompilato in modo che la membrana e i reni siano rivolti verso il basso. Quindi posizionare con cura l'inserto nel nostro pozzo di piastra a sei pozzi progettata su misura.Spingere l'inserto molto delicatamente nel pozzo. Seguire il grado di appiattimento dal microscopio fino a quando il rene è a livello con le perline. Tenere l'inserto leggermente premuto al pozzo con una mano e fissarlo alla piastra sciogliendo la plastica in tre punti alla periferia dell'inserto con un ferro da saldare.Aggiungere due mezzi di coltura millilitro nel pozzo attraverso un'apertura sul lato. Quando si avvia un'immagine time-lapse, trasferire la piastra nell'incubatore sul palco di un microscopio invertito. Il nostro protocollo di cattura CAM modificato consente una vascolarizzazione altamente efficiente degli organoidi renali e dei reni embrionali.Molti serbatoi contenenti mezzo di coltura fornisce tessuto donatore e lo protegge dall'essiccazione durante il periodo di tempo iniziale procedendo con il vascolarizzazione. Questo film mostra il flusso di cellule del sangue di pollo in un centro renale di topo embrionale innestato al CAM di pollo e coltivato per sette giorni. Questo pannello di figure mostra che il nostro metodo di coltura CAM migliorato fornisce condizioni permissive per le cellule endoteliali derivate renali.Le figure A e B mostrano che i reni embrionali coltivati per cinque giorni sulla coltura dell'intervallo di giorni sono stati innestati al cam di pollo per cinque giorni. La colorazione con anticorpi CD-31 specifici del mouse mostra che la rete cellulare endoteliale del centro renale innestato in CAM è più estesa che nel controllo laterale sinistro. Nella figura C vediamo che i vasi sanguigni dei topi macchiati con anticorpi CD-31 specifici del topo e questo è il massimo con i vasi sanguigni di pollo.Le figure D ed E mostrano criosezioni di reni embrionali di topo coltivati sulla coltura di viaggio o cam di pollo per cinque giorni e macchiati con CD-31 e Hoechst. La vascucolatura glomeruli è più matura nei reni coltivati su CAM di pollo che nelle colture di controllo. La figura F mostra un rene embrionale di topo coltivato su CAM di un pollo GFP transgenico per sette giorni.Le cellule endoteliali del topo sono macchiate con anticorpo CD-31 e possiamo osservare che la vascucolatura nei reni del topo xenotrapianti è per lo più ma non esclusivamente derivata dal topo. La nuova cultura della direzione fissa consente la coltivazione di reni embrionali e organoidi a una distanza impostata limitata. In una cultura di viaggio tradizionale, gli organi coltivati sono posizionati su un filtro che viene mantenuto in un'interfaccia di mezzo d'aria da una griglia metallica.Questo metodo consente buone condizioni per lo sviluppo e la crescita, ma non è ottimale per l'imaging. Nella coltura della direzione fissa dell'insieme, l'organo coltivato viene premuto tra un fondo di vetro del piatto e una membrana e lo spessore di esso è controllato dalle perline di polistirolo che lavorano come distanziati qui. Gli organi in via di sviluppo possono essere immagini direttamente attraverso il vetro di copertura dando una migliore vista dell'organo.Questo pannello di figure mostra che i reni embrionali e gli organoidi renali possono essere coltivati nel metodo di coltura della direzione fissa impostata. Immagini di campo luminoso di reni embrionali e organoidi renali al settimo giorno mostrano un normale sviluppo. Nella figura C, l'espressione GFB è stata attivata nei nefroni in via di sviluppo di un organoide renale dalla figura D mostra un rene con trauma una colorazione sul bocciolo euretrico e sei due colorazioni che segnano le cellule precursori del nefro.Le figure E e F presentano il rene del topo coltivato per 12 giorni. Il trauma e la colorazione del nefro mostrano il bocciolo euretico e i podociti. Anche il film presenta un rene embrionale di MTMG, origine cree di Taiwan, dove il credo di Taiwan induce l'espressione GFB nelle cellule endoteliali.Possiamo vedere che le cellule endoteliali renali sono presenti nel rene embrionale in via di sviluppo e la rete endoteliale può anche svilupparsi nel metodo di coltura. Nel pannello a destra, potete vedere come le cellule endoteliali migrano nella fessura vascolare di un nefrone da stadio a forma di S. Qui abbiamo presentato il protocollo migliorato per lo xenotrapianto di organoidi renali e reni embrionali al pollo CAM.Questo protocollo aumenta significativamente la sopravvivenza dei rudimenti renali e anche delle loro cellule endoteliali intrinseche. Il metodo consente il flusso sanguigno al glomerulus in via di sviluppo. L'altro protocollo qui presentato è il metodo di coltura degli organi a direzione fissa che migliora la qualità dell'imaging e aiuta a studiare la genesi degli organelli a livello di singola cellula.Le immagini ad alta risoluzione sono adatte per la segmentazione cellulare automatizzata e lo studio computerizzate del comportamento cellulare negli organoidi renali e nelle colture renali.

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Coltura organotipica renale su CAM di pollo: una tecnica per il trapianto di espianti di rene murino su CAM di pollo per indurre la formazione di architettura vascolare renale

Il metodo di coltura tridimensionale descritto in questo protocollo ricapitola sviluppo pancreas dispersi da progenitori topo pancreas embrionali, compresa la loro notevole espansione, differenziazione e morfogenesi in un organo ramificato. Questo metodo è suscettibile di immagini, interferenze funzionali e manipolazione della nicchia.

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L'intera struttura 3D e il contenuto cellulare degli organoidi, così come la loro somiglianza fenotipica con il tessuto originale possono essere catturati utilizzando il protocollo di imaging 3D a risoluzione singola descritto qui. Questo protocollo può essere applicato a una vasta gamma di organoidi che variano in origine, dimensione e forma.

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Un metodo semplificato per la generazione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane

Questo documento presenta un protocollo di fabbricazione per un nuovo tipo di substrato di coltura con centinaia di microcontenitori per mm2, in cui gli organoidi possono essere coltivati e osservati utilizzando la microscopia ad alta risoluzione. Anche i protocolli di semina cellulare e immunocolorazione sono dettagliati.

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Qui, presentiamo un protocollo per innestare organoidi cerebrali umani in più stadi di maturazione nella membrana corioallantoica (CAM) del pulcino. Gli organoidi cerebrali sono stati coltivati seguendo protocolli standardizzati non guidati.

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Ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e limaging di microscopia migliorato (Video) | JoVE Journal

Ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging di microscopia migliorato

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