Name: Un modello spheroid 3D per Glioblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Scopri un saggio 3D basato su sferoidi di glioblastoma per studiare l'invasione tumorale nel tessuto cerebrale sano. Questo metodo consente di quantificare migrazione e proliferazione in condizioni più vicine alla fisiologia in vivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto da Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon è un ricevente di borsa di studio presso l'Ospedale Universitario di Tolosa (CHU Tolosa).

Il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i pazienti (dall'Ospedale Haukeland, Bergen, Norvegia secondo i regolamenti del comitato etico locale). Il nostro protocollo segue le linee guida del comitato etico della ricerca umana della nostra istituzione.
1. Generazione di sferoidi tumorali di dimensioni uniformi
NOTA: Le cellule staminali sono coltivate in mezzi neurobasali completati con supplemento B27, eparina, FGF-2, penicillina e streptomicina, come descritto negli articoli precedenti12. Queste cellule formano spontaneamente sferoidi in coltura.
<ol><li>Lavare le cellule tumorali con 5 mL di salina tampone fosfato (PBS) e incubare le cellule con enzima di dissociazione di 0,5-1 mL (vedi Tabella dei materiali)per 5 minuti a 37 .</li>
	<li>Lavare con 4-4,5 mL di PBS e aggiungere 10 mL del mezzo di crescita completo (mezzo neurobasale completo, cNBM).</li>
	<li>Contare le celle utilizzando una tecnica di conteggio automatico con trypan blu e una diapositiva camera di conteggio cellulare.</li>
	<li>Per generare 100 sferoidi con 104 cellule per sferoide (secondo le dimensioni preferite), mescolare 106 cellule in 8 mL di NBM con 2 mL di 2% metilcellulosa.</li>
	<li>Trasferire le sospensioni in un contenitore di sistema sterile e erogare 100 .l/well con una pipetta multicanale in una piastra inferiore ben rotonda 96.</li>
	<li>Incubare la piastra a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 e il 95% di umidità. Sferoidi di dimensioni uguali si formeranno e possono essere utilizzati dopo 3-4 giorni.</li>
</ol>2. Esperimenti tridimensionali
<ol><li>Proliferazione<ol>
<li>Preparazione<ol>
<li>Sospendere gli inibitori (ad es. rotenone come nella Figura 4A)e le sostanze chimiche in 100 , l'una di mezzo e aggiungere a 100 , l'una di mezzo in ogni pozzo (ad es. uno sferoide per bene).</li>
			<li>Incubare la piastra a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2e il 95% di umidità.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Acquisizione e analisi delle immagini<ol>
<li>Scatta foto con un microscopio video in brightfield per creare una serie di condizioni a T0 e nei seguenti momenti previsti.</li>
			<li>Utilizzare Fiji per analizzare le immagini manualmente o in modo semiautomatico. Per farlo manualmente, disegna un cerchio intorno al nucleo dello sferoide con lo strumento di selezione a mano libera e misura l'area di ogni sferoide. Per analizzare le immagini in modo semiautomatico, utilizzare la macro mostrata nel documento supplementare 1 solo con //Core Area.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Invasione<ol>
<li>Preparazione<ol>
<li>Preparare la matrice di collagene in un tubo sul ghiaccio con collagene di tipo I a 1 concentrazione finale mg/mL, 1x PBS,collagene0.023xV , 1 M di idrossido di sodio e sterile H2O. Incubare la soluzione sul ghiaccio per 30 min.</li>
			<li>Raccogliere gli sferoidi dal pozzo del fondo rotondo in tubi da 500 l e lavarle 2 volte con 200 l1 PBS.</li>
			<li>Pipetta gli sferoidi con attenzione in 100 l della matrice di collagene e inserire al centro di un pozzo in normali 96 pozze di pozzo.</li>
			<li>Incubare il gel di collagene per 30 min a 37 gradi centigradi e quindi aggiungere cNBM sopra il gel. Inibitori o attivatori (ad esempio, cloruro di idrogeno come mostrato nella Figura 4B, 4C) possono essere aggiunti al mezzo in questa fase.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Acquisizione e analisi delle immagini<ol>
<li>Scattare foto in sequenza con un microscopio video in modalità brightfield 24 h dopo l'inclusione del collagene.</li>
			<li>Utilizzare Fiji per analizzare le immagini manualmente o in modo semiautomatico. Per farlo manualmente, disegnare intorno al nucleo e all'area totale dello sferoide con lo strumento di selezione a mano libera e misurare l'area invasiva di ogni sferoide sottraendo l'area totale con l'area del nucleo. Per analizzare le immagini in modo semiautomatico, utilizzare la macro come indicato nel documento supplementare 1 per determinare l'area invasiva.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Migrazione<ol>
<li>Preparazione<ol>
<li>Rivestire una piastra 6 po' con Matrigel (0,2 mg/mL) in NBM per 30 min a 37 gradi centigradi, quindi rimuovere il Matrigel e aggiungere 2 mL di cNBM.</li>
			<li>Trasferire gli sferoidi in 50 o L di cNBM dalla piastra del fondo rotondo alla piastra 6 del pozzo.</li>
			<li>Incubare la piastra a 37 gradi centigradi e attendere 30 min per gli sferoidi di aderire.</li>
			<li>Dopo 24 h di incubazione, macchia con 10 ng/mL di Hoechst e incuba 30 min a 37 gradi centigradi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Acquisizione e analisi delle immagini<ol>
<li>Ottenere immagini utilizzando un microscopio video in brightfield. Un laser da 405 nm viene utilizzato per la visualizzazione della colorazione Hoechst.</li>
			<li>Utilizzare il software Fiji per analizzare le immagini ed eseguire la macro come indicato nel documento supplementare 1. NOTA: Toccare il fondo del pozzo o rimuovere completamente il supernatante danneggia gli sferoidi. Per la movimentazione del gel di tipo collagene, tenere il gel sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione del collagene, non aggiungere un componente acido perché il cambiamento di pH influenzerà rapidamente la compattezza del gel e le cellule pipette nel collagene per prevenire la morte cellulare e la degradazione del gel.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Macro Fiji
NOTA: Fiji è un programma di analisi delle immagini sviluppato nel pubblico dominio che permette lo sviluppo di macro per accelerare l'analisi delle immagini. Anche l'analisi manuale è possibile, ma questo è un processo lento e può introdurre distorsioni. Le immagini possono essere importate mediante trascinamento della selezione nel software e quantificate con il plugin ROI Manager Tools. La procedura utilizzata in questo studio è descritta di seguito:
<ol><li>Aprire la finestra della macro: Plugins Macros Interprete interattivo.</li>
	<li>Copiare e incollare il seguente loop viola adattato. Mantenere le frasi viola e aggiungere le frasi verdi di interesse (Documento supplementare 1).</li>
	<li>Per analizzare l'intera serie, regolare i parametri in rosso per una quantificazione specifica ed eseguire la macro utilizzando Macro. Eseguire la macro o premendo Ctrl .</li>
	<li>Controllare e, se necessario, adattare manualmente la regione di interesse (ROI).</li>
</ol>4. Microscopia elettronica degli sferoidi
NOTA: la maggior parte dei seguenti passaggi deve essere eseguita in una cappa chimica.
<ol><li>Fase di fissaggio<ol>
<li>Raccogliere lo sferoide con una punta di tubodicatura tagliata, metterlo in un tubo da 1,5 mL e lavare 1x con buffer di fosfato da 0,1 M (PB).</li>
		<li>Fissare lo sferoide durante la notte a 4 gradi centigradi nel 2% di glutaraldeide/2% di paraformaldeide (PFA) in 0,1 M PB.</li>
		<li>Sostituire la soluzione di fissaggio con una soluzione di 1% PFA in 0,1 M PB seguita dalla preparazione del campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione del campione<ol>
<li>Trasferire gli sferoidi in un colino e metterli in un bicchiere di vetro per evitare danni sferoidi.</li>
		<li>Lavare con cura 3x con 0,1 M PB.</li>
		<li>Incubare con osmio per 2 h al buio. Diluire l'osmio al 4% nel buffer PB 1%0,1 M.</li>
		<li>Lavare con cura 3x con 0,1 M PB.<ol>
<li>Diidratati come segue: immergere in 50% etanolo per 10 min, 70% etanolo per 10 min, 2x 90% etanolo per 15 min, 2x 100% etanolo per 20 min, e 2x acetone per 30 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incubare i campioni in una miscela 50/50 di acetone/resina per 2 h. Durante questo passaggio, preparare la resina EPON (Embed-812: 11.25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).</li>
		<li>Scartare la miscela di acetone/resina, sostituire con resina appena preparata e incubare durante la notte.</li>
		<li>Sostituire la resina con una nuova e incubare tra 2-6 h.</li>
		<li>Aggiungere gli sferoidi in resina in uno stampo a 60 gradi centigradi per 48-72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pelissier, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+dysfunction+in+mechanotransduction+impairs+differentiation+of+human+mammary+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors.</a> Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+spheroids%3A+Relevance+to+cancer+stem+cells+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.</a> Cancer Science. 108, 283-289 (2017).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Corbet, C., Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+acidosis%3A+from+the+passenger+to+the+driver%27s+seat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).</li>
<li>Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Spheroid+Model+as+a+More+Physiological+System+for+Cancer-Associated+Fibroblasts+Differentiation+and+Invasion+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).</li>
<li>Boye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Dejeans, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+control+of+glioma+cells+adhesion+and+migration+through+IRE1alpha-mediated+cleavage+of+SPARC+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA.</a> Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).</li>
<li>Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+SPARC+expression+promotes+U87+glioblastoma+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+travel%3A+the+role+of+proteases+in+individual+and+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion.</a> Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).</li>
<li>Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP+proteolytic+activity+regulates+cancer+invasiveness+by+modulating+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins.</a> Scientific Reports. 7, 14219(2017).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+invasion+uncoupled%3A+increased+migration+is+not+an+inexorable+consequence+of+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).</li>
<li>de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimenter%27s+Guide+to+Glioblastoma+Invasion+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways.</a> Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+proteome+of+glioblastoma+revealed+by+laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection.</a> Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I saggi dello sferoide tumorale sono ben adattati per studiare le caratteristiche tumorali tra cui la proliferazione, l'invasione e la migrazione, così come la morte cellulare e la risposta ai farmaci. Le cellule tumorali invadono la matrice 3D formando un microtumore invasivo, come si vede nella Figura 4B,C. Durante il processo invasivo, matrici digeriste digeriscono matrici digerite a matrice (MMP) che circondano le cellule tumorali13e gli inibitori...

Nella maggior parte degli studi che utilizzano linee cellulari primarie o disponibili in commercio, i saggi vengono eseguiti su cellule coltivate su superfici plastiche come colture monostratori. La gestione della coltura cellulare in 2D rappresenta uno svantaggio, in quanto non imita un ambiente cellulare 3D in vivo. Nelle colture 2D, l'intera superficie cellulare è direttamente in contatto con il mezzo, alterando la crescita cellulare e modificando la disponibilità di farmaci. Inoltre, la superficie plastica non fisiologica innesca la differenziazione cellulare1. Sono stati sviluppati modelli di coltura tridimensionali per superare queste difficoltà. Hanno il vantaggio di imitare l'architettura multicellulare e l'eterogeneità dei tumori2, e quindi potrebbe essere considerato un modello più rilevante per i tumori solidi3. La complessa morfologia degli sferoidi contribuisce a valutare meglio la penetrazione e la resistenza dei farmaci4. L'eterogeneità tumorale nello sferoide influisce sulla diffusione di ossigeno e sostanze nutritive e la risposta agli agenti farmacologici (Figura 1A). La diffusione dell'ossigeno viene alterata quando la dimensione dello sferoide raggiunge i 300 m, inducendo un ambiente ipossico al centro dello sferoide (Figura 1A,C). I metaboliti sono anche meno penetranti attraverso gli strati cellulari e compensando le reazioni metaboliche avvengono5. Quando il diametro dello sferoide aumenta, i nuclei necrotici possono essere osservati, imitando ulteriormente le caratteristiche che si trovano in molti tipi di cancro solido, tra cui il cancro al cervello aggressivo glioblastoma (GBM)6.
Diversi saggi di invasione 2D o 3D per il glioblastoma sono stati riportati nella letteratura7,8. I saggi bidimensionali sono principalmente per studiare l'invasione in un piano orizzontale su uno strato sottile di matrice o in un assaggio della camera di Boyden9. I saggi tridimensionali sono stati descritti con colture di sferoidi 3D utilizzando classiche linee cellulari glioblastoma10. Varianti più complesse sono rappresentate dall'invasione degli organoidi cerebrali da parte di sferoidi tumorali nelle colture di confronto11. Tuttavia, è ancora importante sviluppare un saggio facile da usare e riproducibile a disposizione di qualsiasi laboratorio. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare cellule staminali del glioblastoma da campioni di pazienti. La quantificazione di questi saggi è facilmente gestibile e richiede solo software online ad accesso aperto. In breve, i pezzi tumorali vengono tagliati in piccoli pezzi e eviticamente digeriti. Le cellule singole derivate dalla digestione sono coltivate nel mezzo neurobasale. Dopo 4-7 giorni, le strutture sferoidi si formano spontaneamente. Al momento dell'impianto intracranico nei modelli di topi, formano tumori che presentano un nucleo necrotico circondato da cellule pseudo-palizzate12. Questo è molto simile alle caratteristiche che si trovano nei pazienti GBM.
In questo articolo, descriviamo il nostro protocollo per produrre sferoidi da un determinato numero di cellule per garantire la riproducibilità. A questo scopo possono essere utilizzate due matrici complementari: Matrigel e collagene di tipo I. Matrigel è arricchito in fattori di crescita e imita la membrana basale dei mammiferi necessaria per l'attaccamento cellulare e la migrazione. D'altra parte, il collagene I, un elemento strutturale dello stroma, è la matrice extracellulare fibrillare più comune ed è usato nei saggi di invasione cellulare. Qui illustriamo il nostro modello di sferoide GBM eseguendo analisi su migrazione e proliferazione. L'analisi è stata effettuata non solo in momenti fissi, ma anche monitorando l'espansione degli sferoidi e il movimento cellulare mediante imaging dal vivo. Inoltre, la microscopia elettronica è stata fatta per visualizzare i dettagli morfologici.

<table><tbody><tr><td>Piastra a fondo tondo a 96 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>08-772-212</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>Conservato a 4 gradi; C, enzima di dissociazione della sfera</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>Conservato a -20 &deg; C, scongelare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti di base</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Conservato a -20 &deg; C, scongelare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slide</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>Conservato a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Utilizzato per analizzare le immagini</td></tr><tr><td>Pallone 75 cm2</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Memorizzato a -20 &deg; C, diluito a una concentrazione finale di 0,2 mg/mL in NBM freddo</td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>Diluito in NBM per una concentrazione finale del 2%</td></tr><tr><td>NBM</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Conservato a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Conservato a 4 gradi; </td></tr><tr><td>C Penicillina - Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Conservato a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Trypan blue 0,4%</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>Utilizzato per il conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>Tipo I Collagen</td><td>Corning 354236</td><td></td><td>Conservato a 4 &deg; E</td></tr></tbody></table>

un modello spheroid 3d per glioblastoma

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Le colture cellulari bidimensionali (2D) non imitano la crescita del tumore in vivo in modo soddisfacente. Pertanto, sono stati sviluppati modelli di sferoidcoltura tridimensionale (3D). Questi modelli possono essere particolarmente importanti nel campo della neuro-oncologia. Infatti, i tumori cerebrali hanno la tendenza a invadere l'ambiente cerebrale sano. Descriviamo qui in un saggio ideale basato sul glioblastoma sferoide 3D che abbiamo sviluppato per studiare l'invasione tumorale. Forniamo tutti i dettagli tecnici e gli strumenti analitici per eseguire con successo questo saggio.

Gli sferoidi sono stati preparati come descritto nella sezione protocolli e sono state fatte osservazioni riguardanti la migrazione, l'invasione, la proliferazione e la microscopia. Per misurare l'ipossia in aree distinte della struttura sferica, l'colorazione iX di anidera carboxica è stata utilizzata per determinare l'attività ipossica (Figura 1A-C). Sono state osservate più cellule CAIX-positive nel centro sferoide (Fi...

Qui, descriviamo un assaggio di invasione facile da usare per il glioblastoma. Questo test è adatto per cellule staminali del glioblastoma. Viene descritta anche una macro Fiji per una facile quantificazione dell'invasione, della migrazione e della proliferazione.

Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Le colture cellulari bidimensionali non imitano adeguatamente la crescita tumorale in vivo. Per migliorare, le procedure 3D sono state sviluppate utilizzando sferoidi. Il nostro test 3D a base di glioblastoma sferoide è particolarmente adatto per indagare l'invasione del tumore al cervello nell'ambiente tumorale cerebrale sano.I modelli di coltura tridimensionale possono essere utilizzati per ricapitolare un'architettura multicellulare, l'eterogeneità e lo stato metabolico dei tumori consentendo una valutazione più rigorosa degli effetti farmacologici. Assicurati di non toccare il fondo del pozzo o di rimuovere completamente il supernatante, di mantenere il gel sul ghiaccio e di aggiungere rapidamente le cellule al gel. Per generare sferoidi tumorali di dimensioni uniformi, lavare prima la coltura cellulare tumorale di interesse con cinque millilitri di PBS e trattare le cellule con 0,5 a un millilitro di enzima dissociazione.Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, interrompere la reazione con quattro-4,5 millilitri di PBS e trasferire le cellule staccate in un tubo conico da 15 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo di crescita completo. Dopo il conteggio, rimorsi le cellule a una volta 10 alla sesta cella per otto millilitri di mezzo di crescita completo integrato con due millilitri di concentrazione di metilcellulosa al 2% e trasferire la sospensione in un contenitore di sistema sterile. Quindi aggiungere 100 microlitri di cellule a ciascun pozzo di una piastra inferiore rotonda da 96 po 'e posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica del 5% di 37 gradi Celsius per tre o quattro giorni.Per eseguire un saggio di invasione, quando le cellule tumorali hanno formato sferoidi di dimensioni uniformi, trasferire ogni struttura cellulare in un tubo di 500 microlitri e lavare gli sferoidi una volta con 200 microlitri di PBS. Dopo il secondo lavaggio, trasferire accuratamente gli sferoidi in 100 microlitri di matrice di collagene preparata al momento e aggiungere ogni sospensione sferoide al centro di ogni pozzo di una piastra piatta a 96 poggiasaggio. Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere 100 microlitri di mezzo di crescita completo sopra il gel in ogni pozzo.Assicurati di posizionare tutti gli sferoidi al centro di ogni pozzo per la migliore imaging dell'invasione delle cellule tumorali. Per eseguire un saggio di migrazione, quando le cellule tumorali si sono formate sferoidi di dimensioni uniformi, rivestire una piastra a sei pozzetti con 0,2 milligrammi per millilitro di Matrigel nel mezzo di crescita per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, rimuovere il Matrigel e aggiungere due millilitri di mezzo di crescita completo ad ogni pozzo.Trasferire gli sferoidi dalla piastra inferiore rotonda in 50 volumi di microliter in singoli pozzi della piastra a sei pozzetti e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Il giorno dopo, macchiare gli sferoidi con 10 nanogrammi per millilitro di Hoechst per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Per l'acquisizione di immagini dopo un test di invasione o migrazione, posizionare la lastra sul palco di un microscopio confocale Brightfield dotato di una videocamera e ottenere immagini durante l'appropriato periodo sperimentale.Per analizzare le immagini in modo semi-automatizzato, importare le immagini nelle Fiji e fare clic su Plugin, Macro, Interprete interattivo. Copiare e incollare il ciclo viola adattato. Mantieni le frasi viola e aggiungi le frasi verdi di interesse se necessario.Quindi, per misurare l'area di ogni sferoide, fare clic su Analizza e misura. Per misurare l'ipossia in aree distinte della struttura sferica, la colorazione carbonica anidrasi IX può essere usata per determinare l'attività ipossica. In questa analisi rappresentativa, nel centro dello sferoide sono state osservate cellule positive più carboniche dell'anidrasi IX.Le cellule ipossiche situate nel nucleo dello sferoide tendono ad essere più glicolitiche delle cellule che circondano il nucleo. I mitocondri possono essere immagini mediante microscopia elettronica per ulteriori analisi. Il diametro dello sferoide è direttamente correlato alla densità delle cellule che compongono la struttura cellulare 3D e le macro delle Fiji possono essere utilizzate per quantificare la proliferazione, l'invasione o la migrazione delle cellule all'interno di ogni sferoide o migrazione delle cellule all'interno di ogni sferoide.Gli aumenti del nucleo dello sferoide riflettono la stimolazione della proliferazione cellulare. Dopo l'inibizione del complesso I della catena respiratoria mitocondriale, la stragrande maggioranza della produzione di ATP nei mitocondri è compromessa riducendo la proliferazione del 20% dopo 72 ore. Il trattamento con cloruro di idrogeno migliora l'invasione del collagene di tipo I per un periodo di 24 ore, ma riduce l'area migratoria degli sferoidi di 1,5 volte rispetto agli sferoidi non trattati.Come valutato dall'imaging dal vivo, gli sferoidi dimostrano un'alta dinamica interna e si muovono rapidamente. La dimensione degli sferoidi dovrebbe essere relativamente uniforme e si dovrebbe fare attenzione a manipolare gli sferoidi al centro dei pozzi per ottenere i migliori risultati di imaging. Questo metodo può anche essere utilizzato per indagare la proliferazione, la migrazione e la morte delle cellule tumorali, nonché l'espressione di matrice extracellulare, recettori cellulari o proteine intracellulari di interesse.Anche gli sferoidi possono essere incapsulati e l'effetto dell'aumento della tensione superficiale cellulare può essere studiato al momento della rimozione delle capsule.

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Questo video dimostra come le gliomasfere, derivate da tumori cerebrali, vengono separate in singole cellule e incapsulate in un idrogel a base di acido ialuronico. Questo processo promuove le interazioni cellula-cellula, formando un modello di glioblastoma strutturato e tridimensionale.

Un idrogel a base di acido ialuronico per la coltura tridimensionale di cellule di glioblastoma

Fonte: Guyon, J., et al. Un modello sferoidale 3D per il glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)Il video dimostra la generazione di un modello sferoidale tridimensionale dell'invasione delle cellule tumorali. Gli sferoidi sono formati da cellule tumorali cerebrali umane e incorporati in una matrice di collagene. Le cellule tumorali alla periferia sferoidale adottano un fenotipo invasivo, secernendo proteasi per degradare il collagene e avanzando per invadere la matrice circostante.

Generazione di un modello sferoidale tridimensionale dell'invasione delle cellule tumorali

Protocollo per la propagazione di campioni chirurgici di glioma dissociati di alta qualità nel mezzo della neurosfera privo di siero da selezionare per le cellule con fenotipo delle cellule staminali tumorali. Per gli esemplari che non riescono a crescere come neurosfere, viene suggerito un protocollo alternativo. Viene descritta una tecnica di incorporamento della paraffina per mantenere l'architettura della neurosfera 3D per l'immunocitochimica.

Ottimizzazione della coltura cellulare glioma di alto grado da campioni chirurgici per l'uso in modelli animali clinicamente rilevanti e immunochimica 3D

L'invasione dei tessuti normali circostanti è una caratteristica distintiva dei tumori maligni. Forniamo qui un semplice saggio semi-automatico su micropiastra dell'invasione in una biomatrice 3D naturale che è stata esemplificata con una serie di modelli di tumori umani avanzati.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Qui, descriviamo un modello murino ortotopico preclinico per GBM, stabilito mediante iniezione intracranica di cellule derivate da tumori modello murino geneticamente modificati. Questo modello mostra le caratteristiche della malattia del GBM umano. Per gli studi traslazionali, il tumore cerebrale del topo viene monitorato mediante risonanza magnetica in vivo e istopatologia.

Modelli ortotopici traslazionali di glioblastoma multiforme

Gli embrioni di pulcino sono utilizzati per studiare i tumori cerebrali del glioblastoma umano (GBM) in ovo e in co-colture di fette cerebrali ex vivo. Il comportamento delle cellule GBM può essere registrato mediante microscopia time-lapse in co-colture ex vivo, ed entrambi i preparati possono essere analizzati all'endpoint sperimentale mediante analisi confocale 3D dettagliata.

Utilizzo del cervello dell'embrione di pulcino come modello per analisi in vivo ed ex vivo del comportamento delle cellule di glioblastoma umano

Qui, presentiamo un protocollo che consente la fabbricazione rapida, robusta ed economica di sferoidi tumorali seguita dall'incapsulamento dell'idrogel. È ampiamente applicabile in quanto non richiede attrezzature specializzate. Sarebbe particolarmente utile per esplorare le interazioni sferoide-matrice e costruire modelli di fisiologia o patologia tissutale in vitro .

Fabbricazione e incapsulamento di sferoidi tumorali in idrogel di polietilenglicole per lo studio delle interazioni sferoide-matrice

Presentiamo un metodo per replicare il microambiente tumorale del glioma nella parte anteriore invasiva che incorpora il flusso di liquido interstiziale. Questo modello è un idrogel di acido ialuronico I in un inserto di coltura tissutale in cui è possibile applicare una testa di pressione del fluido. L'invasione può essere quantificata e le cellule possono essere isolate o lisate.

Un modello fotopolimerizzabile di acido ialuronico-collagene del microambiente di glioma invasivo con flusso interstiziale

Qui, stabiliamo una piattaforma di profilazione metabolica che integra gliomi sferoidi tridimensionali (3D) e normalizzazione basata sull'imaging tramite analisi del flusso extracellulare. Questo approccio consente una valutazione più accurata delle risposte metaboliche dei tumori ai trattamenti farmacologici e fornisce informazioni sui potenziali meccanismi di resistenza.

Progressi nella profilazione metabolica degli sferoidi tridimensionali dei tumori cerebrali per lo screening dei farmaci

Presentiamo un modello di migrazione del glioblastoma 3D utilizzando gliomasfere magnetiche derivate dal paziente generate da tumori appena diagnosticati e ricorrenti. Questa piattaforma consente la visualizzazione delle dinamiche migratorie specifiche del paziente e la valutazione dell'efficacia terapeutica. Il saggio può essere multiplexato dopo la migrazione per valutare la localizzazione e i modelli di espressione delle proteine.

Test riproducibile di migrazione del glioblastoma 3D con localizzazione sferoide mediata da nanoparticelle magnetiche in condizioni ipossiche

Scopri un saggio 3D basato su sferoidi di glioblastoma per studiare l'invasione tumorale nel tessuto cerebrale sano. Questo metodo consente di quantificare migrazione e proliferazione in condizioni più vicine alla fisiologia in vivo.

Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

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